分子总结修订版 (2)

1、EHMT1通过PRDM16复合物控制棕色脂肪细胞命运和产热褐色脂肪组织（BAT）以消耗化学能的形式散热来防御低温和防止肥胖。当前有证据表明棕色脂肪细胞来自Myf5+皮节前体，是通过PRDM16(包含16个蛋白的PR结构域)转录复合物来发挥作用。但是，酶分子开关的组成部分以及它如何决定褐色脂肪细胞谱系仍然不明。在这里，我们将阐明BAT富含的常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基1（EHMT1）在PRDM16转录复合物控制棕色脂肪细胞的命运中，起到非常重要的作用。缺失EHMT1的棕色脂肪细胞产生的棕色脂肪特性严重损失，并通过诱导分化的肌肉在体内组蛋白3赖氨酸选择性的去甲基化9（ H3K9me2和3）基因启动

2、子。相反，通过稳定PRDM16蛋白质可使EHMT1积极表达来调节BAT按计划选择性产热。值得注意的是，脂肪缺失特有的EHMT1会导致BAT介导的适应性产热显著降低、肥胖以及全身胰岛素抵抗。这些数据表明EHMT1是控制褐色脂肪细胞命运和能量平衡的重要酶开关。当能量摄入长期超过总能量支出，将导致肥胖。目前被FDA批准的所有抗肥胖药物无论是通过抑制食欲或通过抑制肠道对脂肪的吸收，其作用原理都是抑制能量摄入。但是，这些药物会导致抑郁症、油性肠蠕动、脂肪泻等副作用，因此迫切需要替代的方法。BAT能通过解偶联蛋白1（UCP1）专门耗散能量。最近用氟标记的2-脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描的研究（18 FDG

3、-PET）表明:成人的活性BAT存储量与身体肥胖指数成反比关系，这表明它在成人能量平衡中起着重要的作用。因此，深入了解BAT发育的分子机理可能带来另一种平衡能量的方法通过增加能量消耗来改变能量平衡。据报道，肩胛间褐色脂肪细胞和肾周BAT源于Engrailed-11和Myf5皮节前体。在PRDM16-C/EBP-B与生肌前体结合成复合体，通过诱导过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）-c表达，激活棕色脂肪细胞的基因程序；但是，PRDM16-C/EBP-B复合作为一种命运开关来控制棕色脂肪细胞这种机制在心肌细胞中发挥何种作用仍然未知。 以前，我们通过使PRDM16产生两个缺失突变确定PRDM16是成

4、肌细胞转化为褐色脂肪细胞的基本结构域，这两个突变分别为：一种突变体缺乏PR-域（DPR），即共享同源性高甲基SET域；另一种突变体缺乏锌指结构域-1（DZF-1）（图1A，上图）。野生型（WT）和DPR突变体能够使成肌细胞转化为褐色脂肪细胞，但DZF-1突变体不能，这表明在该转化中需要锌指结构域-1（ZF-1）存在。根据这一结论，从野生型和缺乏PR-域而非缺乏DZF-1的褐色脂肪细胞中纯化PRDM16复合物，发现H3上有显著甲基活动（图1a，底部面板）。因为这种影响在其SET结构域中是独立的，我们寻找与分化PRDM16蛋白质（即，野生型和PR缺失型）相关的甲基化 ，而不是不分化的PRDM16（

5、DZF-1）。通过使用高分辨率液相色谱串联质谱（LC-MS/MS），我们发现EHMT1作为只有甲基l转移这是共同纯化与区别能干优先PRDM16复合。 EHMT1具有酶活性的H3K9单或二ME。值得注意的是，单倍剂量不足的EHMT1的基因，因为9q34.3微缺失或pointmutations在humans13 ，与包括智力发育迟缓的临床表型有关。重要的是，有40-50EHMT1突变的患者发展为肥胖。然而，深层次的机制仍然完全没有弄清楚。鉴于PRDM16的复杂性和BAT的重要作用的发展，我们认为EHMT1是控制血统规范和BAT的产热功能的一个关键酶组分。 为了检验这一假设，我们首先通过伴随褐色脂肪

6、细胞里的免疫印迹的免疫互动证实了PRDM16EHMT1的相互作用（图1b补充图1）纯化的ZF-1（224-454）和ZF-2（881-1038）谷胱甘肽S-转移酶（GST）-PRDM16的结构域绑定到体外翻译的EHMT1蛋白质上，如先前报道的一样PRDM16的680-1038区域绑定到CtBP1上。（图1和图2的补充）。这些结果表明EHMT1直接与PRDM16相互作用。EHMT1是褐色脂肪细胞中PRDM16复合物甲基化的主要酶。因为当用两个短发夹RNA（shRNA）定位显示EHMT1被耗尽时，PRDM16复合物的组蛋白甲基转移酶活性在很大程度上失去。此外，表达EHMT1蛋白的基因高度富集在与P

7、RDM16相关的BAT和培养棕色脂肪细胞。（图1e和补充图4）。与此相反，EHMT2蛋白的量在白色脂肪组织（WAT）中比在BAT中高。为了测试EHMT1是否能调制PRDM16转录活性，我们使用含有PPAR-C结合位点1的萤光素酶报道基因进行萤光素酶测定。如图1，如果EHMT1的和PRDM16共同表达则能够增加报道基因的活性，而当DZF-1突变表达这种诱导则完全丧失。这些数据表明，EHMT1与PRDM16形成转录复合物，并通过直接相互作用调节其活性。 接下来，我们调查了体内BAT的产生对EHMT1的遗传要求。在Ehmt1（基因） FLOX/ FLOX小鼠Myf5的-Cre重组酶的小鼠1体内的Eh

8、mt1基因在褐色脂肪细胞前体时已被删除，因为在棕色脂肪细胞出现前把全身的Ehmt1敲除会导致胚胎死亡。如图。图2a-C，敲除Ehmt1myf5 基因的小鼠的肩胛间的BAT在出生后比WT小鼠小得多。苏木精和伊红染色显示，敲除棕色脂肪细胞中的Ehmt1myf5 的小鼠比野生型小鼠显著较小并含有较少的脂质，而在BAT附近的组织包括皮肤等组织似乎正常（图2b和补充图5）。在观察第18.5天的胚胎时也出现了类似的结果（补充图6）。随后，我们用RNA测序分析了野生型和敲除Ehmt1myf5 基因的胚胎BAT的全球基因的表达。以下基因本体论分析发现，敲除Ehmt1myf5的BAT的基因表达模式呈骨骼肌表型：

9、那就是说，骨骼肌选择性基因的广泛激活和BAT选择性基因的广泛减排。引人注目的是，在BAT基因敲除小鼠中，78.7%的分化表达基因被分配到骨骼肌细胞的发育、BAT发展和功能（葡萄糖、脂肪酸代谢）的不同层面上去。具体而言，在BAT基因敲除中，77.5%的异位激活基因和骨骼肌的发育有关，包括肌细胞和肌球细胞重链。在另一方面，在BAT基因敲除中80%的减排基因都参与BAT的发育和脂肪酸、葡萄糖代谢，包括Ucp1, Pgc1a, Cebpb, Cpt1a and Elovl3（图2和图7）。这些结果表明，EHMT1绝对是BAT和肌肉之间细胞规范命运所必需的。为了观测EHMT1是通过什么机制来决定的世系，

10、我们采用了表达一个竞争控制的（）或用EHMT1标记的shRNAs(shEHMT1-1 and -2)的逆转录病毒和PRDM16（补充图）一同被转染进入C2C12成肌细胞的方法。如上板图二所示，PRDM16的表达能够有力地阻止以剂量依赖性方式的成肌分化，如所示的使用一个泛骨骼肌肌球蛋白重链免疫组化（MHC）抗体。相反，EHMT1的耗尽明显地消除了在成肌过程中由PRDM16形成的压迫（下面板的图二）。基因表达分析表明，当EHMT1被耗尽时，对于像肌细胞生成素这类的选择性抑制肌肉基因的压迫已经接近于完全消失了（图和辅助图b)。这种抑制效应通过对EhMT1甲基转移酶活性的调节来实现，因为缺乏EhMT1

11、甲基转移酶活性的异位表达突变体显著减弱了肌肉发育过程中PRDM16介导的抑制作用（补充图9A）。此外，两对EhMT1 / 2的化学抑制剂，bix-01294和unc0638，堵塞了PRDM16的抑制作用（补充图9b，C）。BIX-01294在棕色脂肪细胞中的疗效也显著降低了选择性基因的表达（补充图d)。有了这些一致的数据，染色质免疫沉淀分析发现EHMT1的损耗强有力的减少了H3K9me2和me3在肌细胞生成素基因启动子近端区域中的数量，这段启动子能招募EHMT1（图二 g)。相反的，大量的H3K9 / 14ac在对H3总数量没有任何影响的情况下可以显著的增加EhMT1的消耗。在包括Acts,

12、Ryr1和Mylpf1在内的肌肉选择性基因启动子中招募，EHMT1的部位也可观察到类似的行为变化（图10补充）。相反，在亲脂的培养条件下，击倒EhMT1很大程度上阻止了PRDM16在C2C12细胞中对棕色脂肪细胞的诱导（图11补充）。综上所述，这些结果表明EhMT1通过PRDM16来决定BAT和肌细胞世系，PRDM16的作用是调控肌肉选择性基因启动子中H3K9的甲基化状态。值得注意的是，EHMT1的表达明显增加了PRDM16蛋白质的独立于它的mRNA的表达之外的量（图3和补充图15）。这种效果是由于改变蛋白质的退化速率，因为酮追踪实验表明EHMT1的表达延长了PRDM16蛋白的半衰期，从8.5

13、h到16.5h。该N1198L; H1199E突变作为强效的WT形式也延长了PRDM16蛋白的半衰期（图3g）。PRDM16蛋白质积累只由EhMT1突变体结合PRDM16引发（补充图16）。EHMT1调节内源性PRDM16蛋白在体内的量（补充数据1）。EHMT1蛋白质的稳定性并没有受PRDM16的影响（补充图表17）。这些结果共同表明，EhMT1具有双重功能：即肌肉基因的选择程序的抑制效应通过它的甲基转移酶活性以及，PRDM16蛋白的稳定性活化BAT选择性基因程序直接与其相联系。接下来，我们检查EHMT1在体内产热适应性的要求。为了排除EhMT1基因敲除小鼠在骨骼肌中的潜在缺陷，我们使用脂联素

14、Cre重组酶的小鼠产生脂肪组织特异EhMT1基因敲除小鼠（EhMT1基因敲除）。值得注意的是，所述差异的62.3 Ehmt1小鼠肌肉/ BAT选择性基因失调类似Ehmt1敲除小鼠（扩展数据2），虽然脂联素-Cre在BAT和WAT中都表达，但EHMT1在BAT中的表达高于WAT（图1e）。此外，WAT Ehmt1基因敲除小鼠脂肪分解能力与野生型小鼠没有什么区别（图18的补充）。EHMT1是beige/brite细胞发育所必需的（扩展数据3）。因此，EhMT1基因敲除小鼠允许我们检查EHMT1在体内BAT/beige脂肪介导的产热的作用。如3h图显示， Ehmt1基因敲除小鼠直肠温度在经过

15、6;低温1小时后，温度直线下降，而对照小鼠保持不变。在Ehmt1基因敲除小鼠中，BAT选择性基因在骨骼肌中的表达不发生改变（补充图19）。我们对在热中性条件下（29-30°C）ß3肾上腺素受体途径活化的耗氧率进行了后续计量。如图4a所示，WT小鼠的耗氧率经过施用CL316,243之后显著上升，然而，在基因敲除小鼠中此诱导作用则完全丢失。基因敲除小鼠的受损产热伴随着较高的血清量，该血清含有大量游离脂肪酸（图4b)。这与之前的研究结果一致，即作为游离脂肪酸发热体的主要场所，而且减少BAT的脂肪酸氧化将引起血清游离脂肪酸含量的增加。实际上，敲除BAT基因后，脂肪酸的氧化能力显著低

16、于基底状态和施用,的小鼠，此外，敲除基因后，脂肪酸摄取量也减少了（补充图）。这些结果表明，EHMT1是BAT介导的适应性产热和体内脂肪酸的代谢所绝对必需的。最后，我们测试在一个致胖的、热中性条件下（2930°C）EHMT1在BAT中的不足是否影响体重增加的趋势，因为Ucp1基因敲除小鼠的肥胖表型只能在热中性条件下表达。如四维图和补充中所表明的，基因敲除小鼠获得了比食物的摄入量没有任何变化的野生小鼠显著地更高的体重（补充表格1）。基因敲除小鼠比野生小鼠的附睾白色脂肪组织和肩胛间棕色脂肪组织有更高的量（Fig. 4e, f）。有葡萄糖耐受试验发现基因敲除小鼠比野生小鼠表现出了更高的血糖浓

17、度（Fig. 4g）。同样，基因敲除小鼠通过胰岛素耐量试验展现出了对胰岛素的受损应对反应（Fig. 4h），在禁食和葡萄糖刺激的状态下血清胰岛素的含量更高（Fig. 4i）。基因敲除小鼠即使在对于体重没有观察出明显差异的环境温度下也能表现出胰岛素抵抗的表型（补充Fig.22）。值得注意的是，基因敲除小鼠的肝脏含有更多的脂类和甘油三酯（Fig. 4j, k），也表现出作为响应于胰岛素评定Akt磷酸化的受损胰岛素信号（Fig. 4l 和补充说明的Fig. 23）。与此同时，这些结果表明在BAT中EHMT1的不足导致了高脂肪饮食下的肥胖、全身胰岛素抗性和脂肪肝。 总之，我们已经认定EHMT1是必要的

18、含甲基的BAT，它能控制体内棕色脂肪细胞的死活、自适应产热和葡萄糖稳态。尽管成人体内BAT的存在广受赞赏，但是除了UCP1的多态性和3-肾上腺素受体的基因之外还没有没有对人类BAT的变化和产热产生影响的突变被描述过。EHMT1的突变和BAT产热之间的因果关系的划定将会在通过后生途径理解能量平衡的分子控制方面提供一个全新的前景，这可能会研究出针对肥胖和代谢性疾病的有效的治疗措施。(第一页图下边内容)图1 | EHMT1在PRDM16转录鉴定复杂。A. 上图： PRDM16的示意图。下图： PRDM16复从褐色脂肪细胞纯化经受体外组蛋白甲基化检测。 B. EHMT1蛋白质的免疫沉淀之后免疫印迹以检

19、测PRDM16 。输入示于下面板。 C. 在体外结合分析35S标EHMT1或CtBP1和纯化PRDM16片段。从棕色PRDM16复杂D.组蛋白甲基化分析脂肪细胞表达表明构建体（ N53或4）。电子，免疫印迹表示蛋白质在脂肪组织中。楼PRDM16的转录活动使用PPAR -C响应荧光素酶报告（ N53 ） 。误差线，标准误差。*P<0.05, *P<0.01, *P<0.001.第四页图右侧内容图4 | EHMT1的不足在BAT中导致肥胖和胰岛素抵抗。A. WT耗氧率和在热平衡的条件下，用CL316,243（0.5mg/kg）处理基因敲除小鼠（N =6）。B. 用生理盐水或cl3

20、16243处理小鼠血清游离脂肪酸含量。C. 脂肪酸氧化的BAT(n=610).D. 在热平衡、高脂肪的饮食条件下体重的变化E. 4周的高脂饮食后，脂肪组织质量（N = 16）。F. 苏木精和伊红染色的脂肪组织。比例尺，100µm。G. 9周高脂饮食喂养的小鼠的葡萄糖耐量试验（N =9）。H. 10周的高脂肪食物喂养的小鼠胰岛素耐受试验（N =9）。I. 血清胰岛素在禁食和葡萄糖刺激的状态量（N=9）。J. 肝脏D的苏木精和伊红染色，比例尺，50µm，、在J中肝脏甘油三酯的量（N = 9）。 I肝胰岛素信号作为评估磷酸化（S473）和总Akt的量。误差线，标准误差。 * P&

21、lt;0.05，* P <0.01，* P <0.001。方法总结：动物：所有的动物实验都是依照加利福尼亚大学、旧金山的动物保护机构和使用委员会的程序去执行的，脂联素-Cre重组酶的小鼠和Ehmt1flox17由A. Tarakhovsky和E. D. Rosen提供。为了代谢研究，Bl6背景下的雄性小鼠在热中和性和环境温度条件下由高脂肪食物喂养了四周。生物信息学：在加利福尼亚大学构建了RNA测序库。基因本体丰富的分析是用RefSeq作为数据背景库、通过基因表达的差异来实现的（P<0.05，以-方法为基础的假设验证）。该数据的登陆账号是E-MTAB-1704。在线内容：任何附

22、加的方法、扩展数据和源数据可以在文本的在线版本中获得，独特引用的那些段落只在网络版的文本中。补充信息：可以在文本的在线版本中获得。致谢：感谢A. Tarakhovsky, E. D. Rosen, Y. Shinkai andE. Hara提供了小鼠和质粒，感谢旧金山加利福尼亚大学的同事们（Y. Qiu, A. Chawla, C. Paillart, S. Koliwad, M. Robblee,D. Scheel, S. Ohata, L. Mera, D. Lowe, S. Sonne, S. Keylin, I. Luijten, H. Hong andE. Tomoda）的帮助。这项

23、工作也得到了美国国立卫生研究院的援助，我们也感谢DERC中心、加利福尼亚大学、旧金山生物医学研究所、皮尤慈善信托基金的支持。作者贡献：S.K. 和H.O.构思、设计了这个实验，所有的作者参与了实验的操作与数据的分析，S.K. 和H.O.完成了本篇文章。作者信息：重印和版权的信息可以在上得到。作者声明没有竞争性的经济利益，欢迎读者通过网络版本进行评论。关于材料的信件和要求可以给S.K.（）。备注：1、Akt：又称PKB，即蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。胰岛素等生长和存活因子都可以激活Akt信号途径。2、

24、BAT：棕色脂肪组织3、WAT：白色脂肪组织4、EHMT1：常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶5、CUP1：偶解联蛋白之一。偶解联蛋白是一种线粒体内膜蛋白，这种蛋白质能消除线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差，令利用质子浓度差驱动的氧化磷酸化过程减慢，阻碍了三磷酸腺苷（ATP）的正常产生。在生理学上有其特定的作用，冬眠动物以及新生动物利用解偶联蛋白，可以将部分本用于制造ATP的能量转化为热量。6、Cre重组酶：整合酶家族的一个成员，来源于噬菌体P1，在细胞内，Cre 重组酶的功能是保持P1基因组处于溶源状态。广泛地用于各种生物体细胞内和细胞外的基因重组实验中。7、RefSeq：是美国国家生物信息技术

25、中心（NCBI）数据库的参考序列。各种试验方法的介绍：动物：动物实验都是经过加州大学旧金山的制度动物保护和动物保健及使用委员会批准，根据程序执行处理。 Ehmt1flox老鼠和脂联素Cre / 1 由 Tarakhovsky和e·d·罗森提供。Myf5 Cre / 1小鼠是从杰克逊实验室获得的。为了分析胚胎蝙蝠的发展,Ehmt1flox /液氧或Myf5-Cre1/2;Ehmt1flox /液氧胚胎在E18.5或新生鼠P1中收集并固定在4%多聚甲醛中用来进行组织学分析。根据组织学和RNA表达分析肩胛间地区的BAT仓库是有微小裂口的。寒冷暴露实验中,男性Ehmt1adipo的

26、基因敲除小鼠(Adipo-Cre1/2;Ehmt1flox /液氧)和body-weight-matched（体重相关联的）控制老鼠(Ehmt1flox /液氧)在10周的年龄独自关在笼子里并暴露于4摄氏度环境中5小时。直肠温度每小时使用TH-5温度计(Physitemp)（Physitemp是一个品牌）监控一次。代谢研究：Ehmt1adipo基因敲除小鼠或控制体重的小鼠在14周的年龄时，在热力中性(29 - 30摄氏度)的条件下，使用一个综合实验室动物监测系统(哥伦布仪器)监测了全身的能量消耗。小鼠腹腔用特异性肾上腺素能受体激动剂CL316,243 kg21注射,剂量为0.5毫克每千克。食源

27、性肥胖研究中，雄性老鼠在6 - 7周的年龄在热力中性的条件下用高脂肪食物(D12492,研究饮食)喂养4周。实验结束时,血清样本被收集。用商业上能够有效测量的装备测量了大量的血清胰岛素(微孔),甘油三酸酯(热)和FFA（wako）。葡萄糖耐量测试实验中,雄性老鼠被喂食高脂肪的饮食9周。快速一夜后,小鼠腹腔注射葡萄糖(1 g 每千克)。对胰岛素耐量试验实验中,雄性老鼠喂食高脂肪食物10周。快速一夜后,小鼠腹腔注射胰岛素(0.75 U /kg)。血液样本在和大量指示的时间点收集并使用血糖测试条(Abbott)（Abbott一个公司）对大量葡萄糖进行测定。为测量肝脏甘油三酯的含量，使肝脏组织(25毫

28、克)在1.25毫升的Folch溶液中(氯仿/甲醇,2:1,v / v)成为均匀的颗粒。随后,将等量(0.4毫升)的氯仿和水添加到溶解产物中。在735 g离心3分钟后,收集氯仿相并烘干。使颗粒在异丙醇中溶解。用无限甘油三酯工具包(热)测定大量的甘油三酯。脂肪酸氧化试验：WT和Ehmt1adipo基因敲除小鼠在11周时,用生理盐水或CL316,243进行腹腔注射。注射五个小时后,肩胛间的BAT仓库被孤立。脂肪酸氧化试验根据 Mao et al.描述的协议进行,简单地说，被切碎的脂肪组织小块用补充了1毫摩丙酮酸、1%不含 FFA的牛血清蛋白和0.5毫摩的油酸盐培养基培养。14C油酸以 1 Ci/ l

29、在37摄氏度加入两小时。添加70%高氯酸到每个培养基后,二氧化碳被在3 M氢氧化钠溶液中浸泡1 h的高级绘画纸所吸收。用液体闪烁计数器测量放射性14C并规范化的测量组织质量。为评估脂肪酸吸收,(大约100毫克)BAT从WT和Ehmt1adipo基因敲除小鼠中孤立出来,并在含有油酸(250毫摩,Nu-Chek prep)并补充了14 c油酸(0.25 Ci/ l)和10%的FBS的培养基中培养15分钟。BAT外植体的放射性14 c用液体闪烁计数器测量并将总蛋白质含量标准化。体内胰岛素刺激试验：小鼠用三溴乙醇(三溴乙醇)麻醉。将胰岛素U(5)注入劣质腔静脉。肝脏被注射2分钟后在裂解缓冲液 

30、;(50 mM Tris-HCl, pH 7.5,150 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 100 mM NaF, 10 mM EGTA, 1 mM Na3VO4,1% (w/v) Triton X-100, 5 mM ZnCl2, 2 mM)和蛋白酶抑制剂混合物中将细胞溶解（罗氏制药企业完成）。溶菌产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺孤立和分离，SDSpolyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。一种蛋白激酶(Pan)抗体(细胞信号)和一种含磷的蛋白激酶(Ser473)抗体(细胞信号)被用于免疫印迹。脂肪脂类分解分析：附睾的脂肪垫被收集并在消化缓冲区(12

31、1毫摩NaCl, 4.9毫摩氯化钾，1.2毫摩MgSO4 ,0.33毫摩氯化钙,12毫摩HEPES)消化，同时包含阿胶基因D(1.5 U ml21),dipase II(2.4 U ml21)、3毫摩葡萄糖和 1% B牛血清蛋白无酸脂肪(阿克伦生物技术)。消化1 h后，在37 摄氏度轻轻摇匀,脂肪细胞通过尼龙网过滤并以186克离心5分钟。收集浮动脂肪细胞并在含有10%的FBS与存在或不存在异丙肾上腺素(1毫摩)的培养基中在37摄氏度条件下培养1.5 h。释放到媒体中的甘油决定使用一个免费的甘油试剂()。大量的甘油通过使用一个皮尔斯BCA蛋白质测定试剂(热科学)被规范化到主要脂肪细胞的总蛋白质含

32、量。细胞培养：永生的棕色脂肪细胞从P1-P3 WT老鼠的肩胛间的BAT中分离。小鼠胚胎成纤维细胞在前面已经描述。HEK293细胞和C2C12细胞从美国文化集合类型中得到。C2C12细胞的脂肪细胞分化是由用含有10%的FBS、0.5毫摩异丁基甲基黄嘌呤、125毫摩吲哚美辛、2微克每毫升氟美松、850nM胰岛素、1nMT3和0.5 微摩梵蒂雅的培养基中培养的治疗汇合细胞诱导的。感应两天后,细胞转向含有10%FBS,850nM胰岛素,1nM T3和0.5mM梵蒂雅的维持培养基培养。为了cAMP治疗，将细胞在10微摩的毛喉素中培养4小时。C2C12成肌细胞的肌细胞分化是由在含有2%马血清的培养基中处理

33、的细胞诱导的。至于在培养中米黄色细胞的分化,间质血管(SV)部分是从Ehmt1flox /flox老鼠和镀覆盖有胶原的板块中独立的。根据前面的描述，在缺乏或存在0.5毫摩罗格列酮（即梵蒂雅）的情况下细胞分化发生。DNA结构和病毒生产：标记的PRDM16和GST-fused（fused融合的） PRDM16片段的缺失突变体(1 - 223、223 - 454、224 - 680、680 - 880881 - 1038和1039 - 1176年)是前面描述的。EHMT1表达式构造是从Y. Shinkai和 E. Hara获得的。EHMT1 向pMSCV-puro（puro嘌呤毒素）逆转录表达克隆。

34、用于针对EHMT1逆转录shRNA表达载体的序列是59-CGC TAT GAT GAT GAT GAA TAA-39 (shEHMT1-1) and 59-GAG GAT AGT AGG ACT TCT AAA-39 (shEHMT1-2).相应的双链DNA序列被结扎成pSUPER-Retro(GFP-Neo)(Oligoengine)用于逆转录表达。逆转录病毒生产,死而复生包装细胞在70%融合的情况下由 10 mg逆转录载体磷酸钙法转染。48小时后,收集病毒上清并过滤。细胞用病毒上清,并配以6微克每毫升聚凝胺培养一夜。随后,用嘌呤霉素(PRDM16和EHMT1),潮霉素(C / EBP-b)

35、或G418(shRNAs)进行选择。基因表达分析：遵守制造商的协议，使用试剂盒(英杰公司)或RiboZol试剂(AMRESCO)，从组织中分离所有的RNA。所有样品中RNA的质量用分光光度计检查。反转录反应是使用IScript互补DNA(互补)合成装备(Bio-Rad)进行的。这项研究中使用的引物序列可以在补充表2中找到。定量逆转录酶聚合酶链反应(二者)是使用ABI ViiA7 PCR机器用SYBR绿色荧光染料进行的。和规范样本相比，mRNA表达是由使用TATA-binding（TA-TA结合蛋白）蛋白质作为内生控制的DD-Ct方法决定的。用目标-诱饵方法发现率估计为 0% 为了确认在褐色脂肪

36、细胞中PRDM16和EHMT1之间的相互作用，使用抗EHMT1（RD系统）或标记抗体（M2）对免疫纯化的复合物进行纯化，并进行4-12的SDS-PAGE，兔多克隆抗体PRDM1635或EHMT1抗体（RD Systems公司）用于免疫印迹。COS7细胞表达标记PRDM16的血凝素（HA）或者在转染后48小时收集Flag标记EHMT1的缺失片段，总细胞裂解物在4用Flag M2琼脂糖珠温育过夜，用沸水洗净，该immunoprecipitants通过使用HA抗体（罗氏）和免疫印迹分析仪来进行分析，用于体外结合测定，该GST-融合PRDM16的各种片段如前所述进行纯化，S-标记的蛋白（EHMT1，EHMT2，CtBP1，C / EBP-b）用TNT网织红细胞溶胞产物试剂盒（Promega）制备，等量的GST融合蛋白（2毫克）在pH值7.7含20mM HEPES ，300mM 氯化钾2.5mM氯化镁，0.05NP40,1mMDTT和10glycerol.结合缓冲液中，4条件下和体外翻译的蛋白一起过夜培育，然后用结合缓冲液洗涤五次这个琼脂糖珠粒。结合的蛋白质通过SDS-PAGE分离，并通过放射自显影进行分析。组蛋白甲基化分析。所述PRDM16转录