第04章蛋白质化学最终版

1、蛋白质的化学蛋白质的化学第第 四四 章章目的与要求：目的与要求：课时：课时：3 3第一节第一节 了解了解第二节第二节 掌握掌握第三节第三节 重点掌握重点掌握第四节第四节 重点掌握重点掌握第五节第五节 理解，理解，部分掌握，如蛋白质的变性等部分掌握，如蛋白质的变性等第六节第六节 了解了解第七节第七节 自学自学一、蛋白质是构成生物体的基本成分一、蛋白质是构成生物体的基本成分分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。个部分都含有蛋白质。含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的体干

2、重的4545，某些组织含量更高，例如脾、肺及，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达横纹肌等高达8080。第一节第一节 蛋白质是生命的物质基础蛋白质是生命的物质基础二、二、 蛋白质具有多样性的生物学功能蛋白质具有多样性的生物学功能蛋白质蛋白质生物催化生物催化运动、支持运动、支持免疫防御免疫防御代谢调节代谢调节转运、贮存转运、贮存控制生长和分化控制生长和分化信息接受和传递信息接受和传递组成生物膜组成生物膜第二节第二节 蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成一、一、蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成主要有主要有c c、h h、o o、n n和和s s。有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素

3、或金属元素铁、铜、铁、铜、锌、锰、钴、钼锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘 。 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为1616。 蛋白质的含量蛋白质的含量 = 蛋白质含氮量蛋白质含氮量 6.25二、蛋白质结构的基本单位二、蛋白质结构的基本单位（一）氨基酸的结构（一）氨基酸的结构c+nh3coo-hr rl-l-氨基酸的通式氨基酸的通式1. 氨基酸都是氨基酸都是两性电解质两性电解质2.组成蛋白质的氨基酸都是组成蛋白质的氨基酸都是-氨基酸（氨基酸（脯氨酸例外脯氨酸例外）3.各种氨基酸的侧链各种氨基酸的侧链r的结构的结构和性质不同和性质不同碳原子碳原子4

4、. 4. 组成蛋白质的氨基酸都是组成蛋白质的氨基酸都是l-l-氨基酸（氨基酸（甘氨酸甘氨酸例外）例外）1 1非极性非极性r r基氨基酸基氨基酸, , 8种。种。 2 2极性不带电荷极性不带电荷r r基氨基酸基氨基酸, , 7 7种。种。3 3带负电荷的带负电荷的r r基氨基酸基氨基酸, , 2种种4 4带正电荷的带正电荷的r r基氨基酸，基氨基酸，3种种（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类 p63p63甘氨酸甘氨酸 gly g 5.97丙氨酸丙氨酸 ala a 6.00缬氨酸缬氨酸 val v 5.96亮氨酸亮氨酸 leu l 5.98异亮氨酸异亮氨酸 ile i 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸

5、phe p 5.48脯氨酸脯氨酸 pro p 6.3021 1、非极性疏水氨基酸、非极性疏水氨基酸色氨酸色氨酸 try w 5.89丝氨酸丝氨酸 ser s 5.68酪氨酸酪氨酸 try y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cys c 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 met m 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asn n 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 gln q 5.65 苏氨酸苏氨酸 thr t 5.60 2 2、极性中性氨基酸、极性中性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸 asp d 2.97谷氨酸谷氨酸 glu e 3.22赖氨酸赖氨酸 lys k 9.74精氨酸精氨酸 arg r 10.76组氨酸组氨酸 his h 7

6、.593 3、酸性氨基酸、酸性氨基酸4 4、碱性氨基酸、碱性氨基酸q 必需氨基酸必需氨基酸指体内需要而又不能自身合成，必须由食指体内需要而又不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸，共有物供给的氨基酸，共有8种：种：ile、 met、 val、 leu、 trp 、 phe、 thr 、 lys 。 “一家写两三本书来一家写两三本书来”氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。溶液的酸碱度。氨基酸等电点氨基酸等电点(pi) (pi) 在某一在某一phph的溶液中，氨基酸解离成阳离子的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子

7、，呈和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的电中性。此时溶液的phph值值称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。（三）、（三）、氨基酸的两性解离及等电点氨基酸的两性解离及等电点c ch hr rcoocooh h3 3n n+ph=pi+oh-phpi+h+oh-+h+phpi氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子chnh2coohr chnh2coohrchnh3+coo-r chnh3+coo-rchnh2coo-r chnh2coo-rch coohrnh3+ch coohrnh3+coochh3n+ch3 k1coohchh3n+ch3coo

8、h2nch3 k2ala+ala+ala ala alaalahccoohc hh3n+ch2coohcoochh3n+ch2coohcoochh2nch2cooasp+asp+aspaspaspasp= k1 k2 k3ccch2coon +3hooh.紫外吸收苯丙氨酸：苯丙氨酸： maxmax259nm259nm酪氨酸：酪氨酸： maxmax278nm278nm色氨酸：色氨酸： maxmax279nm279nm含有这三种氨基酸的蛋白质在含有这三种氨基酸的蛋白质在280280nmnm波长下有最大光波长下有最大光吸收，可以测定蛋白质的含量。吸收，可以测定蛋白质的含量。 . .茚三酮的反应茚三酮

9、的反应a. a. 灵敏度灵敏度0.5-500.5-50g/ml g/ml b. b. 氨基酸与茚三酮生成的蓝紫色物质，在氨基酸与茚三酮生成的蓝紫色物质，在570nm570nm测定吸光值测定吸光值c.c.脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在440nm440nm处测吸光值处测吸光值（三）氨基酸的分离与分析（三）氨基酸的分离与分析v 1.1. 自动氨基酸分析仪自动氨基酸分析仪1.蛋白质完全酸水解2.水解液于ph 2上样于钠型阳离子交换柱3.用ph 3.5 0.2mol/l柠檬酸钠溶液洗脱4.用ph 4.25 0.2mol/l柠檬酸钠溶液洗脱5.分析洗脱谱上

10、各峰的位置和面积，与标准氨基酸图谱比较分析 p66p66v 2. 2. 高效液相色谱高效液相色谱v 3.3. 离子交换层析离子交换层析v 4.4. 生物质谱生物质谱蛋蛋 白白 质质 的的 分分 子子 结结 构构 第第 三三 节节蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括 一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构空间结构空间结构定义定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构化学键化学键肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。 肽键肽键是由一个氨基酸的是由一个氨基酸的

11、 - -羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的 - -氨基脱水缩合而形成的化学键。氨基脱水缩合而形成的化学键。 二硫键二硫键：两个半胱氨酸的：两个半胱氨酸的-sh-sh通过缩去一份子通过缩去一份子h2h2形成形成 的的-s-s-s-s-键。键。（一）肽键和肽链（一）肽键和肽链nh2-ch-chooh甘甘氨氨酸酸nh2-ch-chooh甘甘氨氨酸酸nh-ch-choho oh甘甘氨氨酸酸+-hoh甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键肽键nh2-ch-c-n-ch-coohhhhonh2-ch-c-n-ch-coohhhho* * 肽肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。是由氨基酸通过肽键缩合而形成的

12、化合物。* * 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为不全，被称为氨基酸残基氨基酸残基。* * 由十个以内由十个以内氨基酸氨基酸相连而相连而成成的的肽肽称为称为寡肽，寡肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽多肽。n 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端c 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端体内多肽和蛋白质生物合成时，是从氨基端开体内多肽和蛋白质生物合成时，是从氨基端开始，延长到羧基端终止。始，延长到羧基端终止。多肽链有两端多肽链有两端h2nch2coohcnhccch3oo

13、ohnch2chh丙氨酸丙氨酸丝氨酸丝氨酸甘氨酸甘氨酸n n末端末端c c末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶gshgsh过氧过氧化物酶化物酶h2o2 2gsh 2h2o gssg gshgsh还原酶还原酶nadph+h+ nadp+ 生物活性肽生物活性肽谷胱甘肽谷胱甘肽(gsh)一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。功能的基础。（三）蛋白质一级结构测定的原理（三）蛋白质一级结构测定的原理c末端氨基酸分析n末端氨基酸分析n末端氨基酸分析a.a.二硝基氟苯（二硝基氟苯（dnfbdnfb）法：）法：p70p70b.b.二甲氨基萘磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法

14、（dns-cldns-cl）灵敏度：灵敏度：1 1 1010-9-9molmol。n (c h3)2s o2c lh2nc hcroh nc hcros o2n (c h3)2+水解n (c h3)2s o2h nc hcroo h+氨基酸丹磺酰氯多肽n-端丹磺酰n-端氨基酸丹磺酰氨基酸c.c.edmanedman法（苯异硫氰酸，法（苯异硫氰酸，pitcpitc法）法）：p71p71，蛋白质自动分析仪，蛋白质自动分析仪 d.d.氨肽酶法：氨肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的肽链外切酶，从多肽链的n-n-端逐个水解氨基酸。端逐个水解氨基酸。a a. .肼解法肼解法: :h2nchcrohnchcro

15、orncchhnohn-1n-端氨基酸 c-端氨基酸orncchh2nohh2nchcronhnh2+h+nh2nh2氨基酸酰肼c-端氨基酸c c末端氨基酸分析末端氨基酸分析b.b.羧肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的羧肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的c-c-端逐个水解氨基酸。端逐个水解氨基酸。大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解a.a.化学裂解法：化学裂解法：溴化氰裂解法；羟胺溴化氰裂解法；羟胺nhnh2 2ohoh裂解法裂解法 b.b.酶裂法酶裂法: :胰蛋白酶，胃蛋白酶等胰蛋白酶，胃蛋白酶等确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序：重叠法：重叠法 p72p7

16、2 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。顺序。 1616肽，端肽，端h h 端端 法裂解：法裂解：ons ps eove rla howtons ps eove rla howt b b法裂解：法裂解：seo wton verl aps hoseo wton verl aps ho 重叠法重叠法确定序列：确定序列：howtonseoverlapshowtonseoverlaps分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸

17、残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。蛋白质一级结构测定蛋白质一级结构测定按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基分离编码蛋白质的基因因测定测定dna序列序列排列出排列

18、出mrna序列序列5.5.核酸推导法测定蛋白质一级结构核酸推导法测定蛋白质一级结构蛋白质链蛋白质链dnamrna二、蛋白质的构象二、蛋白质的构象又称为空间结构，立体结构，高级结构，三维构象等又称为空间结构，立体结构，高级结构，三维构象等。蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列，分蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列，分布及肽链的走向。布及肽链的走向。（一）维持蛋白质构象的化学键（一）维持蛋白质构象的化学键1.1.氢键氢键2.2.疏水键疏水键 3.3.离子键（盐键）离子键（盐键） 4.4.范德华引力范德华引力 5.5.配位键配位键 6.6.二硫键二硫键cc二硫键二硫键（二）蛋白质的二级结构

19、（二）蛋白质的二级结构定义：定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键：主要的化学键： 氢键氢键 - -螺旋螺旋 - -折叠折叠 - -转角转角 无规线团无规线团 蛋白质二级蛋白质二级结构的主要结构的主要形式形式肽键具有部分双肽键具有部分双键的性质，不能键的性质，不能自由旋转。参与自由旋转。参与肽键的肽键的6个原子个原子c 1、c、o、n、h、c 2位于同一位于同一平面，称为肽键平面，称为肽键平面或平面或肽单

20、元肽单元 。1.1.肽单位肽单位2. 2. - -螺旋螺旋结构特点：结构特点：右手右手螺旋螺旋每螺旋圈包每螺旋圈包含含3.63.6个氨基个氨基酸残基酸残基氨基酸侧链氨基酸侧链伸向螺旋外侧，伸向螺旋外侧，对对 - -螺旋的形螺旋的形成有一定影响。成有一定影响。3.3. - -折叠折叠要点：要点： 肽键平面折叠肽键平面折叠成锯齿状（折纸状）成锯齿状（折纸状）r r基团交错位于基团交错位于齿状结构上下方齿状结构上下方氢键氢键维持稳定与维持稳定与主链长轴垂直主链长轴垂直两条以上肽链并两条以上肽链并列时，列时， - -片层有片层有顺式和反式平行顺式和反式平行(4)r-(4)r-基团太大时，基团太大时，

21、- -折叠不易形成折叠不易形成- -折叠：顺式和反式中的氢键折叠：顺式和反式中的氢键4. 4. - -折角折角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。分肽链结构。 5.5.无规卷曲无规卷曲角蛋白中的-螺旋和二硫键（三）超二级结构（三）超二级结构-模体模体 多肽链顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠多肽链顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体，是近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体，是蛋白质发挥特定功能的基础。蛋白质发挥特定功能的基础。钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子的模体合钙离子的模体 锌

22、指结构锌指结构 纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 （四）结构域（四）结构域在较大的蛋白质分子中，由多肽链上相邻的超二级在较大的蛋白质分子中，由多肽链上相邻的超二级结构紧密的联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的结构紧密的联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的三维实体，各行使其功能，称为结构域三维实体，各行使其功能，称为结构域 。结构域特点结构域特点：结构域与分结构域与分子整体以共价子整体以共价键相连键相连具有相对独具有相对独立的空间构象立的空间构象和生物学功能和生物学功能免疫球蛋白免疫球蛋白g g的立体结构的立体结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 范德华力等。范德华力

23、等。 主要的化学键：次级键主要的化学键：次级键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。( (五）蛋白质的三级结构五）蛋白质的三级结构 具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性，三具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性，三级结构一旦破坏，蛋白质的生物学功能丧失。级结构一旦破坏，蛋白质的生物学功能丧失。胰岛素分子的三级结构胰岛素分子的三级结构溶菌酶的三级结构溶菌酶的三级结构（六）蛋白质的四级结构（六）蛋白质的四级结构血红蛋白血红蛋白的四级结构的四级结构 蛋白质结构示意图蛋白质结构示意图视频

24、：蛋白质的折叠视频：蛋白质的折叠三、蛋白质和多肽合成的基本原理三、蛋白质和多肽合成的基本原理（二）采用生物技术合成蛋白质（二）采用生物技术合成蛋白质（一）化学合成法的基本原理（一）化学合成法的基本原理1. 1. 氨基酸的基团保护：氨基酸的基团保护：氨基保护、羧基保护、侧链基团保护氨基保护、羧基保护、侧链基团保护2. 2. 多肽的液相合成多肽的液相合成 p80p803. 3. 多肽的固相合成多肽的固相合成 p81p811. 1. 基因工程基因工程2. 2. 细胞工程细胞工程3. 3. 酶工程酶工程 p82p82基因工程合成蛋白质基因工程合成蛋白质基因工程药品基因工程药品（1 1）. .传统的蛋白

25、质药品（如动物激素）：传统的蛋白质药品（如动物激素）：控制某种物控制某种物质合成基因质合成基因转基因转基因“工程菌工程菌”基因工基因工程药品程药品基因表基因表达产物达产物基因工程基因工程发酵分离提取从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。（3 3）基因工程生产的药品）基因工程生产的药品重组人生长激素重组人白细胞介素 重组人干扰素 重组人胰岛素发酵罐（2 2）基因工程方法生产药品的方法：）基因工程方法生产药品的方法：杂交瘤细胞杂交瘤细胞蛋白质结构与功能蛋白质结构与功能第第 四四 节节一级结构是蛋白质生物学功能的基础一级结构是蛋白质生物学功能的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与

26、功能的关系 2. 一级结构中一级结构中关健部分相同，其功能相同关健部分相同，其功能相同-acthacth活性必需部分活性必需部分 -丝丝-酪酪-丝丝-24-丝丝-谷谷-苯丙苯丙-coo-h3n+1 2 3 24 31 33 39 -丝丝-酪酪-丝丝-24-亮亮-谷谷-苯丙苯丙-coo-h3n+ -丝丝-酪酪-丝丝-24-丝丝-谷胺谷胺-苯丙苯丙-coo- h3n+-人人猪猪牛牛剩剩2-10 丧失活性丧失活性 活性仍活性仍100 3.3.一级结构中一级结构中“关键关键”部分变化，其生物活性也改变部分变化，其生物活性也改变例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血n-val his leu thr

27、pro glu glu c(146) hbs 肽链肽链hba 肽肽 链链n-val his leu thr pro val glu c(146) 4. 4. 一级结构的变化与疾病的关系一级结构的变化与疾病的关系 这种由遗传物质这种由遗传物质dnadna突变引起的、在分子水平上仅存在突变引起的、在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病，称为微观差异而导致的疾病，称为“分子病分子病”。二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系 1. 1. 蛋白质前体的活化蛋白质前体的活化蛋白质分子特定的空间构象是蛋白质实现其功蛋白质分子特定的空间构象是蛋白质实现其功能或活性所必需能或活性所必需蛋白

28、质空间结构的改变伴随其功能的变化，而一级结蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，而一级结构没有变化，称为构没有变化，称为变构效应变构效应。2. 2. 蛋白质的变构现象蛋白质的变构现象 3.3.蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象改变与疾病 因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化引起的疾病，称为蛋白质构象病。疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白( prp)引起的一组人和动物神经退行引起的一组人和动物神经退行性病变。性病变。prpc-螺旋螺旋prpsc-折叠折叠 正常正常 疯牛病疯牛病不同生物与人的不同生物与人的cytccytc的的aaaa差异数目差异数目生物生物 aaaa差异差异数目数目黑猩猩黑猩

29、猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 10响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21蛾蛾 31小麦小麦 35酵母酵母 44 三、蛋白质的一级结构与生物进化三、蛋白质的一级结构与生物进化第五节第五节蛋白质的性质蛋白质的性质一一、蛋白质分子的大小、形状及分子量测定、蛋白质分子的大小、形状及分子量测定1 1、分子筛层析、分子筛层析p87 表表4-92 2、sds-pagesds-pagesds-十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠二、蛋白质的变性二、蛋白质的变性 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象发生改变或破坏，从而导致其理化性

30、质改变和构象发生改变或破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。生物活性的丧失。 天然状态，有催化活性天然状态，有催化活性非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇1 1、变性的本质、变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。生物活性的丧失生物活性的丧失理化性质的改变理化性质的改变如：黏度增加，失去结晶能力，易被蛋白酶水解等。如：黏度增加，失去结晶能力，易被蛋白酶水解等。2 2、变性蛋白的特征、变性蛋白的特征3 3、变性作用的因素、变性作用的因素加热、紫外线、乙醇等有机溶剂、强酸、加热、紫外线、乙醇等有

31、机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 酒精、紫外线消毒；酒精、紫外线消毒；高温灭；高温灭；除去杂蛋白；除去杂蛋白；避免活性成分变性。避免活性成分变性。4、变性作用的意义、变性作用的意义视频：蛋白质的变性视频：蛋白质的变性三三. .蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 * * 蛋白质的等电点（蛋白质的等电点（pi) pi) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一phph时，蛋白质解离成正、负时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的液的phph称为称为蛋白质的等电点。蛋白质

32、的等电点。p91p91表表4-104-10蛋白质在其等电点时溶解度最低。蛋白质在其等电点时溶解度最低。四、蛋白质的胶体性质四、蛋白质的胶体性质 蛋白质分子大小在胶粒范围之内。蛋白质分子大小在胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化层水化层+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质水化膜水化膜水化膜水化膜2. 低温低温有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：0 044低温操作，低温操作，丙酮用量一般丙酮用量一般1010倍于蛋白质溶液体积，沉淀后，应立即倍于蛋白质溶液体积，沉淀后，应立即分离，以防蛋白质会变性，也可用乙醇沉

33、淀。分离，以防蛋白质会变性，也可用乙醇沉淀。 1. 中性盐沉淀蛋白质：中性盐沉淀蛋白质：在蛋白质溶液中加入大在蛋白质溶液中加入大量的硫酸铵，硫酸钠或氯化钠等中性盐，破坏蛋白质量的硫酸铵，硫酸钠或氯化钠等中性盐，破坏蛋白质的水化膜和同种电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生的水化膜和同种电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。沉淀。 五、蛋白质沉淀反应五、蛋白质沉淀反应3. 加热沉淀反应加热沉淀反应4. 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 蛋白质在溶液蛋白质在溶液ph稍大于其等电点时，蛋稍大于其等电点时，蛋白质解离成负离子白质解离成负离子，易与重金属离子结合，易与重金属离子结合，生成不溶性的蛋白质盐沉淀。生成

34、不溶性的蛋白质盐沉淀。5. 生物碱试剂沉淀法生物碱试剂沉淀法 蛋白质溶液蛋白质溶液ph小于其等电点时，蛋白质解离成小于其等电点时，蛋白质解离成正离子，正离子，易与生物碱试剂结合，生成不溶性的易与生物碱试剂结合，生成不溶性的盐而沉淀。盐而沉淀。六、蛋白质的颜色反应六、蛋白质的颜色反应（一）茚三酮反应：氨基（一）茚三酮反应：氨基 （二）双缩脲反应：肽键（二）双缩脲反应：肽键（三）酚试剂反应（三）酚试剂反应p93 p93 图图4-114-11七、蛋白质的免疫学性质七、蛋白质的免疫学性质v1.1.抗原，抗原性抗原，抗原性v2.2.抗体抗体v 单克隆抗体单克隆抗体v 多克隆抗体多克隆抗体v3.3.蛋白质

35、免疫性质的应用蛋白质免疫性质的应用v 免疫预防：疫苗免疫预防：疫苗v 免疫、诊断治疗免疫、诊断治疗骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞致敏的致敏的b b淋巴细胞淋巴细胞杂交瘤杂交瘤一、蛋白质的提取一、蛋白质的提取第六节第六节 蛋白质的分离和纯化基本原理蛋白质的分离和纯化基本原理二、蛋白质的分离纯化二、蛋白质的分离纯化1 1、等电点沉淀：、等电点沉淀： 蛋白质在等电点时溶解度最小。但是单纯使用此方蛋白质在等电点时溶解度最小。但是单纯使用此方法不易使蛋白质沉淀完全，常与其他方法配合使用。法不易使蛋白质沉淀完全，常与其他方法配合使用。（一）根据溶解度不同的分离纯化方法（一）根据溶解度不同的分离纯化方法视频：血红蛋白

36、的提取视频：血红蛋白的提取 是将硫酸铵、是将硫酸铵、硫 酸 钠 或 氯硫 酸 钠 或 氯化 钠 等 加 入化 钠 等 加 入蛋白质溶液，蛋白质溶液，使 蛋 白 质 表使 蛋 白 质 表面 电 荷 被 中面 电 荷 被 中和 以 及 水 化和 以 及 水 化膜 被 破 坏 ，膜 被 破 坏 ，导 致 蛋 白 质导 致 蛋 白 质沉淀。沉淀。 2 2、盐析沉淀：、盐析沉淀：视频：蛋白质的盐析视频：蛋白质的盐析超过滤加压加压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜支持膜的栅板支持膜的栅板超滤液超滤液（二）根据分子大小不同的分离纯化方法（二）根据分子大小不同的分离纯化方法 1.1.透析及超滤法透析及超滤法2.分子排阻层析未知未知logmrlogmr洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mlml）层析的主要设备3. 密度梯度离心密度梯度离心蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度滴加样品滴加样品1.1.电泳法电泳法蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pipi的溶液中为带电的颗粒，在电场中的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术种蛋白质的技术, , 称为称为电泳。电泳。 （三）根据电离性质的分离纯化方法（三）根据电离性质的