陈红磊 毕业设计(论文)任务书

1、毕业设计（论文）任务书设计（论文）题目 瓜蒌多糖提取、纯化、分子修饰及其工艺设计 学院名称 生物与食品工程学院 专 业 （班 级） 生物工程 （09-2班） 姓 名 （学 号） 陈红磊（20096098） 指 导 教 师 李军红 系（教研室）负责人 叶明 8一、毕业设计（论文）的主要内容及要求（任务及背景、工具环境、成果形式、着重培养的能力）（一）毕业设计（论文）的主要内容1.瓜蒌多糖的分离纯化。2.对纯化后的多糖进行分子修饰。3.研究多糖修饰前后对-葡萄糖酶活性的影响。4.瓜蒌多糖的提取及工艺设计。（二）毕业设计（论文）的基本要求1根据论文题目，阅读相关文献，全面了解植物多糖提取纯化，分子修

2、饰及其修饰前后对降血糖活性的知识；2. 通过阅读相关文献，设计实验方案；3综合相关文献写出毕业论文前言，包括国内外研究现状及现实意义、研究目的以及对所研究问题的认识及其中心论点；4.掌握多糖提取、分离纯化工艺、分子修饰工艺及活性研究知识等。5按毕业设论文格式书撰写1.5-2.0万字论文，其中中文摘要约300字，英文摘要约250个实词；翻译1-2万字符(或译出5000汉字)与本课题有关的英文文献（并附原文）；6撰写一篇研究论文。二、应收集的资料及主要参考文献1. Carbohydrate polysaccharide Journal2. Food Chemistry Journal3 生物技术

3、期刊,4. 生物工程学报 期刊5. Qilin Huang, Lina Zhang.Preparation. chain conformation and anti-tumor activities of water-soluble phosphated (13)-d-glucan from Poria cocos mycelia.Carbohydrate PolymersJ. 83 (2011): 13631369. 论文三、毕业设计（论文）进度计划起 迄 日 期工 作 内 容备 注2012.12.242013.3.152013.3.162013.3.222013.3.232013.4.23

4、2013.4.242013.5.72013.5.82013.5.152013.5.162013.6.162013.6.172013.6.23查阅资料，毕业实习，外文翻译，完成开题报告；预备试验，开题；瓜蒌多糖提取及纯化；对多糖进行甲基化等修饰；多糖修饰前后对-葡萄糖酶活性影响的研究；瓜蒌多糖提取工艺设计资料整理，数据分析，论文撰写，答辩准备；答辩、评定成绩。在实验的同时完成英文翻译、论文前言；在实验的同时要做到论文的撰写与实验同步。 开 题 报 告 （该表格由学生独立完成)一毕业设计（论文）题目：瓜蒌多糖提取、纯化、分子修饰及其工艺设计二课题来源、目的、意义及该课题在国内外的概况：课题来源：瓜

5、蒌深加工关键技术研发及产业化，企业委托项目。目的意义：栝楼属 ( Trichosanthes Linn. )是葫芦科中一个比较大的属, 共有 80 多种植物,大多为雌雄异株,其分布地区为东亚及澳大利亚北部, 其中我国有一半的种类。栝楼属植物的化学成分主要有油脂、有机酸类、黄酮类、三萜、甾体类、甾醇及蛋白质等。本属有多种药用植物,其药用价值很高;具有润肺止咳、 清热化痰之功效,主治咳嗽痰多、胸痹肋痛、大便燥结等症,其中天花粉蛋白在临床上用来引产。研究表明瓜蒌皮提取物能明显降低小鼠的血糖和血脂，对人脐带静脉内皮细胞的损伤具有保护作用。而瓜蒌皮中含有很多多糖类物质，瓜蒌多糖属于植物多糖类。因此推测瓜

6、蒌多糖具有降血糖、降血脂的功能。但瓜蒌活性多糖的一级结构如何？其构效关系如何？目前尚不十分清楚。因此制约了药用瓜蒌的开发与利用。因此为了阐述瓜蒌多糖活性机理、深入研究瓜蒌多糖，欲对瓜蒌多糖的产量、分级分离、单一组分的理化性质、化学结构进行研究，进一步研究该多糖的降血脂及肝肾损伤修复活性。瓜蒌多糖作为一类重要的生物活性物质，虽然到目前为止还未应用于临床，但其多方面的生物学功能，使多糖药物及保健品具有很广阔的应用前景。因此对瓜蒌多糖进行深入研究具有十分重要的意义和开发应用价值。国内外概况：栝楼属 ( Trichosanthes Linn. )是葫芦科中一个比较大的属, 共有 80 多种植物,大多为

7、雌雄异株,其分布地区为东亚及澳大利亚北部, 其中我国有一半的种类。长期以来，国际学者对瓜蒌提取物进行过不少研究，最近的研究结果表明，瓜蒌皮提取物，具有降血糖、降血脂、抗肿瘤的功能。瓜蒌果皮含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7 种必需氨基酸及丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、门冬氨酸等10 种非必需氨基酸1无机元素分析结果表明，栝楼果皮中含有丰富的钾、钙、镁、铁、锌、铜、锰、钠、钴、镍、锶等元素2。巢志茂等3研究发现，栝楼果实中的钙、镁含量较高，铜、锌、锰等元素含量亦较其他果实为高，但铁含量较低，且同一元素在种子和果皮中的分布

8、有差别。瓜蒌富含蛋白质、油脂、挥发油、甾醇、三萜、无机元素等化学成分,但对瓜蒌多糖成分的研究尚未见报导。越来越多的研究发现,多糖对人体具有极大的利用价值,许多中药所含多糖均有显著的药用功效,如免疫增强作用,降血糖作用,抗氧化作用等4。程俊文等发现灵芝多糖提取物胶囊具有较强的免疫调节作用5；韦璐等验证了金花茶多糖具有明显的降血脂功能6；李红等人研究发现车前子粗多糖具有治疗便秘的功效7；童红莉等人研究发现，黄芪多糖具有降低高血脂大鼠的功能8。因此分析瓜蒌皮多糖的活性,研制瓜蒌皮多糖胶囊，为瓜蒌多糖的进一步研究利用提供了一定的基础。屠婕红等从瓜蒌中提取多糖，纯化，并分析其单糖组成，发现瓜蒌多糖由三种

9、单糖组成，分别是鼠李糖、阿拉伯糖和葡糖糖。但瓜蒌活性多糖的一级结构如何？其构效关系如何？目前国内外学者尚未解析清楚。近年来，植物多糖的研究逐步活跃起来，其中，一些分子量在几千以上，具有很强生物活性的活性多糖的研究受到日益重视，它们的生理功能、化学结构以及构效关系等正成为多糖研究的前沿阵地，取得了很大进展，而关于多糖分离、纯化和结构测定的方法也不断发展和完善。但多糖作为一种重要的生物活性物质，还有很大的发展空间，寻找新的具有生物活性的糖类，建立糖种类和功能数据库，筛选糖类的模拟物，探索更为有效的结构测定方法，总结糖复合物的构效关系，研究糖基化的调控机制，进而对天然糖链进行修饰和人工合成，改造已有

10、的药物，开发多糖药物，使用糖类导向和定位药物，使用糖类提高药物在体内的寿命等等，均能为多糖的开发提供理论指导和实践基础。三尚待研究问题：1、瓜蒌多糖提取条件的优化；2、瓜蒌多糖的分离纯化；3、瓜蒌多糖磷酸化分子修饰；4、瓜蒌多糖修饰前后多葡萄糖苷酶活性的比较研究；4、瓜蒌多糖生产车间的设计。四可能的思路或方案1.瓜蒌多糖的超声波辅助提取工艺优化1-41.1提取时间对多糖提取率的影响选择最适超声波温度，固定液料比为30:1，每管中加入0.1g瓜蒌皮粉末，分别以提取不同时间（10，15，20，25，30 min）进行超声波辅助提取，设定超声波提取器的提取功率为80%。提取液过滤,上清液加入4倍95

11、%的乙醇沉淀，离心，沉淀复溶，苯酚-硫酸法测多糖含量，并计算多糖得率。1.2液料比对多糖提取率的影响选择最佳微波温度和提取时间，每管中加入0.1g瓜蒌皮粉末，分别以不同的液料比（20:1、30:1、40:1、50:1、60:1）加入自来水进行微波辅助提取，设定超声波提取器的提取功率为80%，提取后统一补水到10 ml，提取液过滤，上清液加入4倍95%的乙醇沉淀，离心，沉淀复溶，用苯酚-硫酸法进行显色，测定多糖的吸光度，并计算多糖的得率。1.3功率对多糖提取率的影响选择最佳微波温度、提取时间和液料比，每管中加入0.1g瓜蒌皮粉末，分别以不同的功率（60%、70%、80%、90%、100%）加入自

12、来水进行微波辅助提取。提取液过滤，上清液加入4倍95%的乙醇沉淀，离心，沉淀复溶，用苯酚-硫酸法进行显色，测定多糖的吸光度，并计算多糖的得率。1.4响应面试验根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，选取超声温度、时间、料液比3个因素为自变量，以单因素试验得出的各最佳条件为中心点，以瓜蒌多糖含量为响应值，利用超声波辅助技术对瓜蒌多糖提取条件进行优化试验，采用design expert软件进行响应面试验设计优化提取多糖的工艺参数，确定最佳试验方案。超声温度、时间、料液比，分别以x1，x2，x3表示，按方程Xi=(xi-x0)/x对自变量进行编码（Xi为自变量的编码值，xi为自变量的真实

13、值，x0为试验中心点处自变量的真实值，x为自变量的变化步长），并以自变量的编码值+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，以生物量Y为相应值。响应面试验因素水平表见表1。表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码表因素编码值水平-101温度/X1506070时间/minX2152025料液比X31:301:401:501.5 统计分析采用DPS软件处理系统进行直观分析、回归分析，建立回归方程并进行显著性分析。1.6 验证试验以均匀试验回归分析和直观分析所得较优发酵条件、基础发酵条件进行试验，各平行三组。2多糖的提取、分离、纯化：2.1多糖提取提取条件：料液比1:15，温度60，时间

14、30min，功率60%。将粉碎后的瓜蒌皮置于1000mL烧杯中，在60超声30min后得到瓜蒌多糖粗提液，粗体液经抽滤、浓缩后加入4倍体积的 95乙醇，于4沉淀24h。然后4500 r·min-1离心20 min，除去上清液，沉淀用蒸馏水溶解并冷冻干燥即得胞外粗多糖。2.2、多糖分离纯化（1）脱蛋白: 取瓜蒌多糖溶液50 mL加入1/3体积的Sevage试剂（氯仿、正丁醇体积比4:1），将混合物剧烈振摇20 min，再静止20 min。用分液漏斗分液，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白，重复至水相与溶剂相的交界面无胶状变性蛋白质。（2）脱色：脱蛋白后，向多糖溶解液中加入其体积10的30

15、%的H2O2，50 保温脱色后，得到胞外粗多糖溶液。 （3）透析袋透析：将脱蛋白后的多糖水溶液置于透析袋（直径25mm 、截留分子量3500Da）中，自来水逆向流动透析48h，再用蒸馏水透析24h。3. 瓜蒌多糖的磷酸化修饰及其对-葡萄糖苷酶活性的影响3.1瓜蒌多糖的磷酸化修饰10-12小烧杯中用100ml水溶解一定量的浓度为0.1g/ml的磷酸化试剂（三聚磷酸钠与三偏磷酸钠质量比为6:1）和5%的Na2SO4(减少反应时的起泡现象)，溶解后再加入精制的0.01g/mL的瓜蒌多糖，用NaHCO3调pH =9后，在80条件下反应5h，样液用3倍体积的95%乙醇沉淀24h，将醇沉多糖冷冻

16、干燥，再于60水浴中复溶，复溶后的溶液于透析袋（截留相对分子质量为10000）以蒸馏水为透析液透析24h，将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得磷酸化衍生物。3.2磷酸根的测定（钼蓝比色法）13磷酸二氢钾标准液的制备：准确称取1g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水中，吸取10ml上述溶液，蒸馏水稀释至1000ml，摇匀后备用，此溶液浓度即为10g/ml。准确吸取上述标准液0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5和5ml，蒸馏水补充至5ml，置于25ml比色管中，依次加入2.0mL 5% 钼酸铵溶液，摇匀，静置几秒后，分别加入1.0mL 2%亚硫酸钠溶液和1.0mL 0

17、.5%的对苯二酚溶液，摇匀，加水至刻度，静置30min 后，以参比调零，在波长660nm 处测定吸光度，以磷酸根标准液(以P 计)质量浓度为横坐标、相对应吸光度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线方程。取适量的样品于烧杯中，分别加入1mL浓硫酸和浓硝酸，在电炉上加热至冒烟，然后待冷却后加入1mL 30% 的过氧化氢溶液，再缓慢加热，重复以上的步骤直至瓶内不再冒烟，溶液呈无色透明或淡黄色。冷却后加入1mL 6mol/L盐酸，在电炉上加热使酸彻底分解，转移至50mL的容量瓶中定容。取5mL按标准曲线操作方法测定吸光度，根据回归曲线计算出磷酸根（以P计，下同）的含量。2.3瓜蒌多糖磷酸化修饰前后对-葡萄

18、糖苷酶活性的影响8,14-17葡萄糖苷酶活性单位定义为：pH6.8，37，每l min释放1molL硝基酚为1个活性单位。葡萄糖苷酶抑制剂活性单位定义：pH 6.8，37，使1酶活性单位失活为1个抑制单位。取pH6.8磷酸盐缓冲溶液1.85mL， 依次加入0.1U·mL-1的-葡萄糖苷酶50L， 各均一组分溶液50L， 0.0116mol·L-1PNPG 50L， 将上述反应体系在37保温30min后， 加入0.1mol·L-1的Na2CO3溶液8mL终止反应， 然后在400nm波长处测吸光度A。每个体系同时作3个平行， 取平均值。同时设不加酶的样品空白组， 不加

19、样品的阴性对照组， 不加样品和酶的空白对照组。按照下列公式计算各样品对-葡萄糖苷酶的抑制率。通过prism软件求出IC50值。抑制率 （%）=（A样品-A样品空白）/（A阴性-A空白）×100%式中： A样品为加入样品后酶反应的吸光度值，A样品空白为体系中加入样品但无酶的吸光度值，A阴性为体系中无样品时酶与底物反应后的吸收度值，A空白为体系中既无样品也无酶的吸光度值。五、主要仪器设备紫外可见分光光度计（上海光谱有限公司）；RE- 52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KDC- 1044 低速离心机（科大创新股份有限公司）；KQ3200DE 型数控超声波提取器（昆山市超声仪器有限

20、公司）；ALC- 310.3 电子分析天平（北京赛多利司科技有限公司）；SHB- IIIA 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；参考文献：1 龚钢明,王化田,韩娜.超声波法提取红景天多糖J.食品科学,2005,26(10):127-130.2 张霁,王丰俊,王建中.超声波辅助提取甘薯根颈多糖J.中国农学通报,2008,24(5):132-135.3 刘荣,孙芳,陈秀丽,等.超声波在松仁多糖提取中的应用J.林产化学与工业,2007,27(1):117-120.4 王飞飞,余芳,辛志宏,等.富硒绿茶功能成分的超声波提取及其抗氧化活性研究J.食品科学,2007,28(1): 142-147

21、5 闫景坤，李琳，吴建勇. 人工培养冬虫夏草胞外多糖的分离纯化研究J.现代食品技术，2010,26（4）：366-369.6 贾淑珍，王成忠，于功明.香菇多糖脱蛋白工艺的研究J.中国酿造，2008，182（5）：24-26.7 杨晓杰 ,郑云姬，杨恩策.蒲公英多糖提取中脱蛋白方法的研究J. 高师理科学刊,2009,29(3)：62-64.8 何学斌,薛存宽,魏守蓉,等.茶多糖对-淀粉酶活性抑制作用及对糖尿病模型大鼠血糖影响研究.医药导报J,2007,26(11):1284-1287. 9 潘丽军，陈锦权试验设计与数据处理M 南京：东南大学出版社，200810 丁婷,杨建华，路新卫，韦莉萍 桃胶

22、粗多糖对糖尿病小鼠免疫调节和血糖影响初探.食品工业 2009,611 王慧铭 夏道宗 夏明. 香菇多糖降血脂作用及其机制的研究. 浙江中西 医结合杂志2005,10(15).12浒苔多糖的磷酸化修饰工艺13黄伟坤食品检验与分析(第5版)M北京：中国轻工业出版社，200018518714 张冉， 刘泉， 申竹芳， 等.应用-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型筛选降血糖中药J .中国药学杂志，2007，42(10) ：740-742.15 Chen H，Feng R，Guo Y，et al.Hypoglycemic effects of aqueous extract of Rhizoma Polygonati Odorati in mice and rats J .J Ethnopharmacol,2001,74 (3) ： 225-229.16 Kim YM， Jeon