核酸分子杂交

1、目目 录录核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理目目 录录 目目 录录目目 录录4 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以以DNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础 指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程过复性处理后，形成异源双链的过程 目目 录录分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 液相杂交目目 录录6一、一

2、、Southern 印迹可用于分析基因印迹可用于分析基因拷贝数的变化拷贝数的变化 由由E. M. Southern在在1975年提出年提出 可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化 基本操作过程包括基本操作过程包括 待测待测DNA样品的制备和基因探针的标记；样品的制备和基因探针的标记； 待测待测DNA样品的电泳分离；样品的电泳分离； 电泳分离的电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的经变性、转移、固定到合适的固相支持物；固相支持物； 特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自片段杂交，放射自显影或显色检测目的显影或显色检测目的DNA的存在。的存在。 目目 录录

3、7Southern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液利用这一技术可进行克隆基因利用这一技术可进行克隆基因DNADNA的酶切图谱分析，的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。及限制性片段长度多态性分性等。目目 录录8二、二、Northern 印迹和印迹和RT-PCR可用于可用于分析基因转录水平的变化分析基因转录水平的变化 Northern blot是将是将RNA从凝胶中转印到硝从凝

4、胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方的常用方法；法； RT-PCR是以是以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNA、再以、再以cDNA为模板进行特异性扩增，为模板进行特异性扩增，进行进行RNA定性或定量分析的一种方法；定性或定量分析的一种方法； 二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化 。目目 录录 Northern Northern 印迹是印迹是应用应用DNADNA探针检测特异探针检测特异mRNAmRNA的，主要用于分析的，主要用于分析mRNAmRNA的转录或的转录或mRNAmRNA分子大小，其方法类似于分子大小，其方法

5、类似于SouthernSouthern印印迹杂交。迹杂交。目目 录录三、斑点印迹杂交三、斑点印迹杂交(dot blotting)(dot blotting) 狭缝印迹杂交（狭缝印迹杂交（slot blottingslot blotting） 将分离的RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 用于基因组中特定基因及其表达产物的定性和定量研究，不能测定分子量的大小。目目 录录11四、原位分子杂交技术可用于基因及其四、原位分子杂交技术可用于基因及其表达产物的定位分析表达产物的定位分析 原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）

6、 将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（的检测技术称为原位杂交（hybridization in hybridization in situ)situ)。 可用于基因及其表达产物的定位分析。可用于基因及其表达产物的定位分析。目目 录录 原位裂解细胞，不需要分离原位裂解细胞，不需要分离DNADNA，RNARNA或蛋白质样品，或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用

7、于目的基因的筛选或检测某可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的类细胞或组织中是否存在某一特定的DNADNA、RNARNA或蛋白质或蛋白质序列。序列。特点特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态目目 录录核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交

8、 杂交结果检测目目 录录14箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置荧光原位杂交（荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH） 目目 录录五、液相杂交五、液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。针除去，即得到杂交后的核酸分子。 RNARNA酶保护分析法酶保护分析

9、法 核酸酶核酸酶S1S1保护分析法保护分析法目目 录录1、RNA酶保护分析法原理酶保护分析法原理 RNaseA和和RNaseT1专一水解杂交体系中的单专一水解杂交体系中的单链链RNA，不水解探针，不水解探针RNA与待测与待测RNA互补形成互补形成的双链的双链RNA，使杂交分子得到保护，称，使杂交分子得到保护，称RNA酶酶保护分析法。保护分析法。2 2、核酸酶、核酸酶S1S1保护分析法原理保护分析法原理 核酸酶核酸酶S1S1在一定条件下专一水解杂交体系中的在一定条件下专一水解杂交体系中的单链单链DNADNA和单链和单链RNARNA，不水解，不水解DNADNA探针与待测探针与待测RNARNA杂杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶酶S1S1保护分析法保护分析法目目 录录 六、固相杂交六、固相杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交