单克隆抗体-文档资料

1、单克隆抗体单克隆抗体Monocolonal antibody1、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：）： 用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个机体多个B细胞细胞克隆克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。2、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：）： 由一个识别一种抗原表位的由一个识别一种抗原表位的B细胞细胞克隆克隆产生的同源抗

2、产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。续地无限量供应。McAb and PcAb杂交瘤技术杂交瘤技术的诞生的诞生 1975年年8月月7日日，Kohler和和Milstein在英国自然在英国自然杂志上发表了题为杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting ant

3、ibody of predefined specificity） 1984年度荣获诺贝尔生理学和医学奖年度荣获诺贝尔生理学和医学奖 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HATHAT培养基的选择培养：培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤隆化增殖的杂交瘤 细胞系细胞系 单克隆抗体生成：单克隆抗体生成：接种杂交瘤接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体水中即可得到高效价的单克隆抗体抗体种类：抗体种类：第一代抗体第一

4、代抗体 多克隆抗体多克隆抗体 （polyclonal antibody)第二代抗体第二代抗体 单克隆抗体单克隆抗体 （monoclonal antibody)第三代抗体第三代抗体 基因工程抗体基因工程抗体 （genetic engineering antibody)B B淋巴细胞淋巴细胞: :寿命短寿命短, ,分泌特分泌特异系性抗体异系性抗体骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：寿命长寿命长杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：寿命长，单寿命长，单 隆抗体隆抗体流流程程 不产生不产生IgIg的重链和轻链的重链和轻链 HGPRT-;TK- 与提供淋巴细胞的动物品系相同与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞（一）小

5、鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞系均来源小鼠骨髓瘤细胞系均来源于于BALB/c小鼠小鼠，大鼠骨髓瘤细，大鼠骨髓瘤细胞都来源于胞都来源于LOU/c大鼠大鼠建立的骨髓瘤细胞系建立的骨髓瘤细胞系 : SP2/0-Ag14， X63-Ag8.653 NSO/1 动动 物：物：BALB/BALB/c c小鼠小鼠4 48 8周龄周龄20g20g25g25g体重体重（二）免疫脾细胞（二）免疫脾细胞细胞性抗原：细胞性抗原：（1 12 2）10107 7/ /只，不加佐剂，只，不加佐剂，2 23 3周重复一次周重复一次可溶性抗原：可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂首次，完全福氏佐剂+100+100微克抗原，微克抗原，3

6、36 6周周100100200200微克抗原，融合前微克抗原，融合前3 3天，加强免疫天，加强免疫体内免疫法体内免疫法-免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了抗原就不适用了免疫小鼠免疫小鼠。淋巴细胞淋巴细胞。浆细胞浆细胞。抗原接种抗原接种免疫原特性免疫原特性抗原量抗原量接种次数接种次数间隔时间隔时间间单抗的特性单抗的特性抗体滴度抗体滴度亲和性亲和性免疫原性强免疫原性强（如细胞、细（如细胞、细菌和病毒等）菌和病毒等）10106 6-10-107 7个细胞个细胞或或1-1

7、0ug1-10ug2-42-42-42-4周周高高中等至强中等至强免疫原性中等免疫原性中等10-100ug10-100ug2-42-42-42-4周周中等或高中等或高中等或强中等或强免疫原性弱免疫原性弱A.20-400ugA.20-400ug2-42-4随后随后2-32-3每月每月2-32-3月月中等中等强强B.10-50ugB.10-50ug其后其后200-400ug200-400ug2 2其后其后4 4每月每月每天每天中等中等中等中等C.10-100ugC.10-100ug2 2其后其后4 4其后其后“休息休息”最后加强最后加强每月每月1010天天1-21-2月月中等中等中等或强中等或强表

8、表6-1 不同免疫抗原的免疫程序不同免疫抗原的免疫程序（引自刘秀梵，（引自刘秀梵，1994）培养液：培养液：RPM1640培养液培养液DMEM培养液培养液（三）细胞融合（三）细胞融合细胞融合剂：细胞融合剂：PEG:分子量分子量4000 的的PEG是最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂作用机理：作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合膜易打开而有助于细胞融合作用特点：作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEGPEG，其纯度与毒性有所不同，其纯度与毒性有所不同最早仙台病毒被用做融合剂，

9、后来发现聚乙二醇（最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题好，且避免了病毒的污染问题培养骨髓瘤细胞：培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用避免细胞返祖：定期用8-AG8-AG处理细胞处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于于-80-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中取已经免疫的取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离小鼠，摘除眼球采血

10、，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中酒精中5分钟分钟通常每只小鼠通常每只小鼠1108-2.5108个脾细胞，每只大鼠脾个脾细胞，每只大鼠脾脏可得脏可得5108-10108脾细胞。脾细胞。免疫脾细胞的制备：免疫脾细胞的制备：1 110108 8的的淋巴细胞淋巴细胞 无菌手术无菌手术常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞噬细胞其中其中MQMQ还有清除死亡细胞的作用还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过饲养存活一般不超过2 2周，不

11、影响杂交瘤细胞的纯化周，不影响杂交瘤细胞的纯化 在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为这种被加入的活细胞称为饲养细胞（饲养细胞（Feeder cells）。）。饲养细胞：饲养细胞：。饲养细胞饲养细胞融合方法融合方法a、将、将1108脾细胞与脾细胞与2107-5107骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支混合于一支50m

12、l融合管融合管中，补加不完全培养基至中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。，充分混匀。b、1000r/min离心离心5-10分钟，将上清尽量吸净。分钟，将上清尽量吸净。c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置置40水浴中预热。水浴中预热。d、用、用1ml吸管在吸管在1分钟左右（最佳时间为分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至秒）加预热至40的的50% PEG（PH 8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。，边加边轻轻搅拌。e、用、用10ml吸管在吸管在90秒内加秒内加20-30ml预热至预热至37的不完全培养基；的不完全培养基；20-37静置静置10

13、分分钟。钟。f、1000r/min 5分钟；弃去上清。分钟；弃去上清。g、加入、加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的巨噬细胞的HAT培养基至培养基至80-100ml。h、分装、分装96孔细胞培养板，每孔孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装；分装24孔板，每孔孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将；然后将培养板置培养板置37，6% CO2培养箱内培养。培养箱内培养。i、5天后用天后用HAT培养基换出培养基换出1/2培养基。培养基。j、7-10天后用天后用HT培养基换出培养基换出HAT培

14、养基；（第培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。天后可用普通完全培养基）。l、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体以上时吸出上清供抗体检测。检测。10102020天出现克隆天出现克隆HATHAT筛选筛选杂交瘤细胞在融合后杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。来，通常也称为抗体检测。融合细胞的早期培养融合细胞的早期培养常用的抗体检测方法：常用的抗体检测方法：（1）免疫酶技术）免疫酶技术免疫酶

15、技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，现已化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。广泛用于筛选和鉴定单抗。用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）用全菌抗原的用全菌抗原的ELISA用全细胞抗原的用全细胞抗原的ELISA抗体捕捉抗体捕捉ELISA试验试验ABC-ELISA试验试验Dot-ELISA试验试验免疫组化染色法免疫组化染色法（2）免疫荧光技术）免疫荧光技术间接免疫荧光法间接免

16、疫荧光法活细胞的膜荧光染色活细胞的膜荧光染色（3）间接血凝试验）间接血凝试验（4）放射免疫测定）放射免疫测定HGPRTHGPRT酶与酶与TKTK酶酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：应用液：8-8-氮氮杂杂鸟嘌呤鸟嘌呤 聚乙二醇聚乙二醇HATHAT培养基：培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断断DNA合成主要途径合成主要途径 T(Thymidine)：胸胸腺嘧啶核苷；腺嘧啶核苷；“核苷酸

17、前体核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成供细胞通过替代途径合成DNADNAHATHAT选择作用：选择作用：淋巴细胞：淋巴细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的合成的主要途径被主要途径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻SP2/O: HGPRT- ，TK-;长长命命脾细胞脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命短命(7天天)杂交杂交瘤细胞瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长长命命骨髓瘤细胞、脾细胞与骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交杂交瘤细胞

18、瘤细胞杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：长期生长繁殖长期生长繁殖利用淋巴细胞的利用淋巴细胞的HGPRT，将，将H合成为嘌呤合成为嘌呤碱并最终与碱并最终与T一起合成一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力有限稀释法有限稀释法(limiting dilution) FACS法法（fluorescence activated cell sorter）软琼脂平板法软琼脂平板法(soft agar method) 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存特点：特点：不需任何特殊

19、设备不需任何特殊设备克隆出现效率高克隆出现效率高实验室常用方法实验室常用方法方法：方法：细胞悬液通过系列稀释细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含每个培养孔含0.50.51 1个细胞个细胞有限稀释法有限稀释法每种杂交瘤细胞分装每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和和10。效率最高效率最高价格昂贵价格昂贵FACS软琼脂平板法软琼脂平板法(soft agar method)37、7.5%湿润培养湿润培养7-14天；克隆生长至天；克隆生长至2mm时，用毛细时，用毛细吸管吸出克隆，直

20、接转种于含有饲养细胞的吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大孔板，扩大培养。培养。吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。、冻存。配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15 5）x10 x106 6/ml) + /ml) + 细胞冻存液细胞冻存液(30%(30%40% 40% 牛血清，牛血清，50%50%60% RPMI-164060% RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO )10%DMSO )“慢冻慢冻”：分步冷冻，分步冷冻，30-7030-70液氮液氮 保存数年至数十年保存数年至数十年“

21、快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、复苏复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性阳性”孔，孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防

22、止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义细胞冷冻的意义（1）单克隆性的确定）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。单抗纯度鉴定等。A A、杂交瘤细胞的染色体分析、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为和，正常小鼠脾细

23、胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为为62-68，NS-1为为54-56； B 、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定 免疫扩散免疫扩散 ELISA C、单抗纯度的鉴定、单抗纯度的鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫）及免疫 转印分析（转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB（三三）单克隆抗体的性质鉴定单克隆抗体的性质鉴定（2）单抗理化特性的鉴定）单抗理化特性的鉴定抗体亲合力是

24、指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。）表示。常用的方法有竞争常用的方法有竞争ELISA、非竞争性、非竞争性ELISA、间接、间接ELISA、间接法夹心间接法夹心ELISA等等（3）单抗与相应抗原的反应性测定）单抗与相应抗原的反应性测定包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等包括各

25、类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等 三、单克隆抗体的制备三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 （一）单克隆抗体的产生（一）单克隆抗体的产生1 1 动物体内诱生方法：动物体内诱生方法：每次用每次用BALB/

26、cBALB/c或或F1F1代小鼠，（代小鼠，（5 51010）10105 5/ /只只, , 使用的动物当然首选使用的动物当然首选BALB/c小鼠小鼠 ,将杂交瘤细胞将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）腹腔注射法腹腔注射法2 2 体外培养法：体外培养法：a、悬浮培养法：、悬浮培养法：小规模悬浮培养多采

27、用转瓶培养，通过搅拌小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器反应器b、微载体培养法、微载体培养法Microcarrier：主要以交联琼脂糖或葡聚糖、主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品c、中空纤维细胞培养系统：、中空纤维细胞培养系统：由中空纤维生物反应器、培养基由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成容器、供氧器和蠕动泵等组成d、微囊化细胞培养系统：、微囊化细胞培养系统：先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此先将杂交瘤细胞微囊化，然

28、后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。高浓度的单抗。（3）杂交瘤细胞的无血清培养）杂交瘤细胞的无血清培养已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基成分的无血清培养基利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染利于单抗的纯化，有助于大规

29、模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；抗的产量；可溶性抗原：可溶性抗原：ELISAELISA抗体捕获法抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法免疫荧光法（用丙酮和甲醇按（用丙酮和甲醇按1:11:1比例固定细胞）比例固定细胞）（二）单克隆抗体的纯化（二）单克隆抗体的纯化前前5 5天进行天进行, ,预先腹腔注射预先腹腔注射pristanepristane（1 15 5）10106 6细胞细胞1 13 3w w形成腹水形成腹水腹水型单抗的纯

30、化腹水型单抗的纯化高滴度腹水高滴度腹水盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析 McAb McAb的纯化的纯化 ELISAELISA多头加样枪多头加样枪ELISAELISA。免疫荧光法免疫荧光法（四）单克隆抗体的特性（四）单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环境敏感性优点优点 ：在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法体。适用于

31、以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（五）单克隆抗体的优点与局限性（五）单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 ：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高 McAb McAb PcPcAbAb 抗原要求抗原要求 可以不纯可以不纯 纯度高纯度高得量得量 高高 低低特异性特异性 高高 低低 稳定稳定 低低 高高 沉淀反应沉淀反应 无无 有有成本成本 高高 低低McAbMc

32、Ab与与PcPcAbAb的比较的比较基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody) 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。价抗体和双特异性抗体。 将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人

33、AbAb，再经杂交瘤技术，产生，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体大量完全人源化抗体（一）人源化抗体（一）人源化抗体方法：方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人IgIg恒定恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人- -鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体特点：特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力1 1、嵌合抗体、嵌合抗体嵌合抗体嵌合抗体定义：定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（指利用基因工程技术

34、，将人抗体可变区（V V）中互补）中互补决定簇（决定簇（CDRCDR）序列改换成鼠源单抗）序列改换成鼠源单抗CDRCDR序列。重构成既具序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAbRAb亦叫亦叫“重构型抗体重构型抗体”，因其主要涉及，因其主要涉及CDRCDR的的“移植移植”，又可称为又可称为“CDRCDR移植抗体移植抗体意义：意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗2 2、改型抗体、改型抗体FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：

35、单链可变区片段单链可变区片段SdAbSdAb：单区抗体单区抗体 （二）小分子抗体（二）小分子抗体小分子抗体小分子抗体其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白融合（三）抗体融合蛋白（三）抗体融合蛋白 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿

36、瘤细胞的作用。取得杀伤肿瘤细胞的作用。（四）双特异性抗体（四）双特异性抗体 分别分离纯化两种不同的分别分离纯化两种不同的McAbMcAb，使各抗体解离为单价，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。体失去活性，产物均一性不佳。化学交联化学交联BsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤融合，产生四源杂交瘤 (quadr

37、oma)。但二次杂交瘤细胞但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAbBsAb在其中在其中的比例可为的比例可为10%10%50%50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAbBsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)(HAMA)，因此不适用于临床。，因此不适用于临床。细胞工程细胞工程BsAb 多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段, ,如如FabFab，FvFv或或ScFv,ScFv,经基因操作修饰后经基因操作修饰后, ,或体或体外组装为外组装为BsAb,BsAb,或直接表达分泌型或直接表达分泌型的的BsAbBsAb。基因工程基因工程BsAb定义：定义： 将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在完全人源性的抗体，在HIVHIV等病毒感染