核酸分子杂交技术扫盲版教学用

1、核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术扫盲版扫盲版-教学用教学用不同来源的单链核酸分子不同来源的单链核酸分子在一定在一定条件下条件下按照碱基按照碱基互补配对互补配对的原则的原则形成双链杂交体的过程形成双链杂交体的过程2、碱基不完全互补配对也能杂交、碱基不完全互补配对也能杂交1、可以是、可以是DNA, 也可以是也可以是RNA，但必须是单链，但必须是单链3、不同的分子形成的杂交体稳定性不同、不同的分子形成的杂交体稳定性不同利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术目的：目的：检测靶序列检测靶序列碱基互补：碱基互补：DNADNA与与DNADNA杂交：杂交： A=TA=T、 G

2、C ;GC ; DNA DNA与与RNARNA杂交杂交: A=U: A=U、 GC ;GC ; 基本原理：基本原理： 碱基互补、变性和复性碱基互补、变性和复性变性：变性： 升高温度至升高温度至9494左右，使核酸双链解开左右，使核酸双链解开为两条单链升高温度变性只是为两条单链升高温度变性只是一种一种方式方式复性：复性： 缓慢降低温度（缓慢降低温度（ 5252左右），变性的两左右），变性的两条单链重新形成互补双链。条单链重新形成互补双链。 hybridization DNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3

3、 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C按参与反应分子按参与反应分子DNA和和RNA的杂交的杂交DNA和和DNA的杂交的杂交放射性标记放射性标记RNA和和RNA的杂交的杂交非放射性标记非放射性标记按支持介质按支持介质原位杂交原位杂交液相杂交液相杂交按标记按标记固相杂交固相杂交菌落杂交菌落杂交斑点杂交和狭缝杂交斑点杂交和狭缝杂交Southern印迹杂交印迹杂交Northern印迹杂交印迹杂交基因芯片基因芯片固相杂交固相杂交菌落杂交菌落杂交斑点杂交和狭缝杂交斑点杂交和狭缝杂交Southern印迹杂交印迹杂交Northern

4、印迹杂交印迹杂交阳性克隆鉴定阳性克隆鉴定无需电泳和转膜无需电泳和转膜方便快捷方便快捷检测检测DNA检测检测RNA2 2、转膜：转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理Northern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点1 1、变性：、变性：RNARNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持持RNARNA处于变性状态，处于变性状态，DNADNA电泳前和电泳中不变性电泳前和电泳中不变性3 3、靶序列：、靶序列： Northern印迹印迹

5、靶核酸为靶核酸为RNARNA； Southern 印迹靶核酸为印迹靶核酸为DNA探针探针:1. 能与靶序列杂交；能与靶序列杂交；2. 能被特异性检测。能被特异性检测。寡核苷酸探针寡核苷酸探针RNA探针探针DNA探针探针优点：稳定；易得；易标记；优点：稳定；易得；易标记；杂交适宜的温度范围宽杂交适宜的温度范围宽优点：优点：DNA探针的缺点；探针的缺点；此外，杂交此外，杂交后可用后可用RNA酶水解未杂交的酶水解未杂交的RNA探针探针缺点：杂交前需变性；杂交效率较缺点：杂交前需变性；杂交效率较低（竞争）；杂交体不如低（竞争）；杂交体不如RNA稳定稳定缺点：标记复杂；不稳定（探针本缺点：标记复杂；不稳

6、定（探针本身）；杂交适宜的温度范围窄身）；杂交适宜的温度范围窄优点：短，穿透性好；可区分单碱基优点：短，穿透性好；可区分单碱基突变突变缺点：携带的标记分子少，检测时缺点：携带的标记分子少，检测时敏感性较低；应用范围较窄敏感性较低；应用范围较窄DNaseDNA聚合酶聚合酶（53核酸外切酶活性）核酸外切酶活性）DNA聚合酶聚合酶（53核酸外切酶活性核酸外切酶活性53 聚合酶活性）聚合酶活性）3dNTP1dNTP#DNaseDNA聚合酶聚合酶（53核酸外核酸外切酶活性切酶活性53 聚合酶活性聚合酶活性）模板模板DNADNA切开模板切开模板DNADNA形成一形成一到几个碱基的缺口到几个碱基的缺口掺入标

7、记基团掺入标记基团缺口平移缺口平移DNADNA模板模板引物和模板引物和模板DNADNA结合结合加入加入klenow片断、片断、3种种dNTP和和1种标记种标记dNTP引物延伸引物延伸杂交杂交信号检测信号检测1、预、预杂交杂交2、杂交杂交3、洗脱、洗脱核酸分子与固核酸分子与固相介质的结合相介质的结合1、探针的制备、探针的制备2、核酸变性、转移、固定、核酸变性、转移、固定扩增、标记扩增、标记纯化纯化检测检测为获得更好的杂交效果为获得更好的杂交效果控制条件，特异结合控制条件，特异结合洗去多余探针洗去多余探针检测标记物检测标记物核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNADNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针 1、预杂交：封闭膜上能与、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点结合的位点 预杂交液为不含预杂交液为不含DNA探针的杂交液探针的杂交液 2、杂交：液相