沉积物中酶的测定方法

1、沉积物中酶的测定方法水解酶一、脲酶（靛酚比色法）大多数细菌、真菌和高等植物均具有脲酶（urease）。它是一种酰胺酶（amidase），能酶促有机质分子中肽键的水解。土壤的脲酶活性与土壤的微生物数量、有机质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。此法的精确性较高，重现性较好。试剂配制：1甲苯（分析纯）210%尿素：尿素（分析纯）10g溶于100ml蒸馏水中。3柠檬酸盐缓冲液：368g柠檬酸（分析纯）溶于600ml蒸馏水中；295g氢氧化钾溶于1000ml蒸馏水；将二种溶液合并，用1mol/L氢

2、氧化钠调pH至6.7，并用蒸馏水稀释至2L。4苯酚钠溶液：A.62.5g苯酚溶于少量95%乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml，存于冰箱中。B.27g氢氧化钠溶于100ml水中保存于冰箱中。使用前，将溶液A、B各吸取20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml备用。5次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。标准溶液：氮的标准溶液：精确称取称0.4717g硫酸铵（105烘干）溶于水，稀释至1L，则得1ml含0.1mg氮的标准溶液，即100ppm。将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。标准曲线绘制：分别吸取0.5ml、1.5m

3、l、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml稀释后的标准溶液于50ml容量瓶或刻度试管中，然后加蒸馏水至25ml。再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容至50ml。1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据吸光度和溶液浓度绘制标准曲线。（溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。）分析步骤：称2-5g过20目风干土于50ml三角瓶中，加5-10滴甲苯，盖好，15分钟后加10ml 10%尿素和20ml pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在37

4、恒温箱中培养24小时，过滤。取滤液13毫升（视样品浓度定）于50ml刻度试管中，加蒸馏水至25ml，再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色皿）。反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。还需减去无土基质（尿素柠檬酸盐）。结果计算：脲酶活性以24小时内每克土中氨态氮的毫克数来表示。NH3-N（mg/1g土24h）=（浓度×稀释倍数×比色体积）÷（1000×干土重）1000为ug换算成mg二、磷酸酶（磷酸苯二钠比色

5、法）磷酸酶（phosphatase）能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着重要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况），是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5,6-7和8-10。所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的pH缓冲体系有醋酸缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），硼酸缓冲液（pH9-10）。本法测定是以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的作用下，用水解基质所生成的苯

6、酚的量来表示酶的活性。试剂配制：1甲苯（CR）2pH5醋酸盐缓冲液：（酸性土壤）A：0.2N醋酸溶液：称取1.776g冰醋酸和9.58g醋酸钠溶解，加蒸馏水定容到1000毫升。B：0.2mol/L氢氧化氨溶液：取含25%28%的氨水14.02ml稀释至500毫升。取A、B溶液各250ml用蒸馏水定容至1000ml。pH7柠檬酸盐缓冲液：（中性土壤）A：0.1M柠檬酸溶液：称21.01g柠檬酸溶于1000ml蒸馏水中。B：0.2M磷酸氢二钠溶液：Na2HPO47H2O53.63g或Na2HPO412H2O71.7g稀释至1000ml。取A溶液64ml，B溶液436ml稀释至1000ml。pH10

7、硼酸盐缓冲液：（碱性土壤）A：0.05M硼砂溶液（Na2B4O710H2O）称取19.05g硼砂溶于1000ml蒸馏水中。B：0.2M氢氧化钠：8g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。取A溶液50ml，B溶液43ml，加水稀释至200ml。3pH9.8氨性氯化铵溶液：称取20g氯化氨溶于100ml浓氨水中，储存在橡皮塞瓶中，保存于冰箱。40.5%磷酸苯二钠（Na2C6H5PO42H2O）：称5g磷酸苯二钠溶于1000ml缓冲液。52%4-氨基安替匹林：称取2g4-氨基安替匹林，先用少量水溶解，最后稀释至100ml，浑浊时用滤纸过滤后使用。（一周内有效）68%铁氰化钾溶液：称8g铁氰化钾溶于少量水

8、，定容至100ml，储存在棕色瓶中。（一周内有效）酚的标准溶液：a.原液配制：0.5g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至500毫升，储存于棕色瓶中，浓度即为1000ppm。b.工作液配制：取2.5ml原液稀释至250ml，即浓度为10ppm，储存于棕色瓶中。标准曲线绘制：分别取工作液1、3、5、7、9、11、13、15毫升于50毫升容量瓶或50毫升比色管中，加蒸馏水至25ml，再加0.25ml氨性氯化铵，0.5ml2%4-氨基安替匹林和0.5ml 8%铁氰化钾溶液，边加边摇匀，15分钟后定容，1.5h内在波长510nm处比色。(溶液的浓度分别为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3

9、.0ppm试剂与测定相同。)分析步骤：称过20目的风干土2g于50ml三角瓶中，加5-10滴甲苯，盖好瓶塞，15分钟后加0.5%磷酸苯二钠溶液20ml（对照直接加20ml缓冲液），摇匀并置37恒温培养24小时，培养结束后立即过滤。吸滤液15毫升于50ml容量瓶（或比色管）中，加蒸馏水至25ml，再加入0.25ml氨性氯化氨，0.5ml2%4-氨基安替匹林和0.5ml8%铁氰化钾溶液，边加边摇匀，15分钟后定容，在波长510nm处比色。（用1cm比色杯，显色后1.5h内稳定）每一土样设置用水代替基质的对照，还需减去无土基质。结果计算：磷酸酶活性以24小时1克土酚的毫克数表示酚（mg/1g土24h

10、）=（土样浓度×分取倍数×比色体积）÷（1000×干土重）1000：ug换算成mg氧化还原酶一、过氧化氢酶土壤过氧化氢酶是研究的最早的土壤酶，与土壤有机质含量、土壤呼吸强度和土壤微生物含量等有关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度。此方法是定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢来表示酶活性反应式为2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 5O2，此法测定结果较好。试剂配制：10.3%H2O2：按1:100将30%H2O2用水稀释。21.5mol/L的H2SO4。30.002mol/LKMnO4溶液：称

11、取高锰酸钾0.3161g，溶于1000ml无CO2蒸馏水中，储于棕色瓶中，备用。分析步骤：1称取5g过1mm筛的风干土，置于150ml三角瓶中，注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢。2同时设置对照，即三角瓶中注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢，而不加土样。3塞紧瓶塞，置于120r/min往返式摇床上，震荡30min。4随即注入5ml1.5mol/L硫酸以终止反应，用致密滤纸过滤。5取滤液25ml，用0.002mol/L高锰酸钾溶液滴定至微红色。结果计算：以单位土重消耗的0.002mol/L高锰酸钾毫升数（对照与试验测定的差）表示土壤过氧化氢酶活性，其计算式为土壤过氧化氢酶活性（m

12、lKMnO4/g干土）=V/dwt式中，V为0.002mol/L高锰酸钾毫升数（ml）；dwt为烘干土壤重量（g）。二、过氧化物酶（邻苯三酚比色法）过氧化物酶能酶在腐殖质的形成过程中具有重要作用。过氧化物酶酶促有机物质氧化成醌，可通过有色化合物（如焦性没食子酸）比色测定。试剂配制：11%1,2,3-邻苯三酚溶液：取10g1,2,3-邻苯三酚溶于蒸馏水中，并定容至1000ml。20.5%H2O2溶液。3乙醚（分析纯）。40.5mol/L盐酸。标准溶液：重铬酸钾标准溶液：取0.75g重铬酸钾溶于1000ml0.5mol/L盐酸中，此溶液相当于50ml乙醚中含5mg焦性没食子酸。取重铬酸钾标准溶液，

13、用0.5mol/L盐酸再稀释成各种浓度，然后在比色计上，于波长430nm处比色。分析步骤：1称取1g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，然后加入10ml 1%邻苯三酚溶液和2ml 0.5%过氧化氢溶液，摇匀，塞好塞子，置于30培养箱中，培养2h（活性低时刻延长培养时间）。与此同时进行12ml蒸馏水代替基质的对照。2培养结束后，取出三角瓶，加入0.5mol/L盐酸2.3ml（4 ml柠檬酸-磷酸缓冲溶液），摇匀，用乙醚将生成的焦性没食子酸抽出（如含量高时需提取多次）于50ml比色管中，合并提取液并定容，于430nm处比色。结果计算：以1g土壤，在2h内生成的焦性没食子酸的毫克数表示酶的活性单

14、位，其计算式为土壤过氧化物酶活性mg焦性没食子酸/（g干土.h） = m/(dwt.h)式中，m为2h内生成的焦性没食子酸的毫克数（mg）；dwt为烘干土壤重量（g）。三、多酚氧化酶（邻苯三酚比色法）测定土壤多酚氧化酶的活性，能在一定程度上了解土壤的腐殖化进程。土壤中基质邻苯三酚，经多酚氧化酶的酶促作用生成红紫棓精，用乙醚萃取，萃取液经紫外光谱比色，测得红紫棓精的量，即可表示多酚氧化酶的活性。试剂配制：11%1,2,3-邻苯三酚溶液：取10g1,2,3-邻苯三酚溶于蒸馏水中，并定容至1000ml。2柠檬酸-磷酸缓冲液（pH4.5）：A. 0.1mol/L的柠檬酸溶液；B. 0.2mol/L的磷

15、酸二氢钠溶液。取A液45.03ml，B液54.97ml混合即为pH4.5的柠檬酸-磷酸缓冲溶液。3乙醚（分析纯）。40.5mol/L盐酸。标准溶液：重铬酸钾标准溶液：称取0.75g重铬酸钾溶于1000ml0.5mol/LHCl，相当于50ml乙醚中含5mg红紫棓精。取重铬酸钾标准溶液，用0.5mol/L盐酸再稀释成各种浓度，然后在比色计上，于波长430nm处比色。分析步骤：1 称取1g过1mm筛的风干土样置于带磨口瓶塞的50ml容量瓶中，注入基质（1%邻苯三酚溶液）10ml，摇匀。2 将瓶置于30恒温培养箱中培养3h后，往瓶中加入4ml柠檬酸-磷酸缓冲溶液，并加乙醚至刻度。3 用力震荡容量瓶，使邻苯三酚溶液经酶促作用所生成的红紫棓精，从培养液的水相被萃取到乙醚相中。4 用分液漏斗将以上容量瓶中溶液分开，将乙醚相分离于