淋巴细胞分离

1、淋巴细胞单核细胞L093L0921.0751,0901.030-1.035淋巴细胞分离与计数淋巴细胞分离 原理:外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加 以分离。原理红细胞外周血彳*粒细胞V单个核细胞 <PBMC）“血小板Ficoll： 1.077 + 0.001实验材料：淋巴细胞分离液肝素稀释液（生理盐水）RPMI1640 粉末实验设备 ： 1ml 移液器、移液管、 5ml 注射器、刻度吸管、 EP 管、离心机、显微镜操作流程：1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。2. 无菌采集静脉血若

2、干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每 1ml 全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液）,加盖后立即轻轻摇匀，使血液抗凝3. 稀释（外周血：稀释液=1 ： 2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀）4. 用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面 （Ficoll:稀释血=1: 2）5. 放入离心机1500r/min离心20min （注:缓慢加速1-4档个3分钟）6. 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入 5 倍以上 体积的稀释液（生理盐水），1500rpmx 10分钟离心，洗涤细胞。7. 重复洗涤一次，1500rpmX 10分钟离心。8

3、. 末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞9. 计数细胞后再调整细胞置所需浓度.10. 取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度（细胞数/ 1毫升细胞悬液）=4 个大方格内细胞总数 X 104 X 2隔释彳数）411. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。注意事项 :1. 每毫升外周血液大约可获1 X 106单个核细胞2. Ficoll 应适量，外周血应充分稀释3. 温度直接影响到 Ficoll 的比重和分离效果4. 在 Ficoll 上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面5. 吸取单个

4、核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染淋巴细胞计数：实验流程：1. 准备计数板：2. 制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液3. 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4. 计数：在显微镜下，用10X物镜观察计数板四角大方格中的细胞数5. 计算：将结果代入下式，得出细胞密度胞数 / 毫升原=（4大格细胞数之和/4 ） X 104编辑版 worddepth = 0.1 mmvofume = 1x10 4 n)iO = counted =not countedFigure 3 Grid paltH-rn <jf improv

5、ed Neubauer ruled1 haemocyfnmHr. inset shows cells (enlarged for clarity dfStrlbated over a primary squaro_ Cells that ar& witnlnr or that touch. the left or top boundary 日/白 counted, white those that touch, ar are Dutsidg, thie lower or right boundeay are not counted.注意事项：1 .取样计数前，应充分混匀细胞悬液2 .加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3 .细胞压中线时，数上不数下，数左不数右4 .本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5 .镜下计数时，细胞数过