PCR原理及应用

1、 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, pcr)，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。pcr又称为无细胞克隆系统或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增法，它可将极微量的靶dna在数小时内特异地扩增上百万倍。 70年代初，kleppe等人就提出了pcr的工作原理。saiki（1985）和mullis（1986）两家研究室分别用改进的kleppe法获得了大量染色体dna单拷贝基因。当时的pcr技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入dna聚合酶。 1988年，由于在pcr系统引入了热稳定的taq dna聚合酶，这是从水生栖热菌（thermus aq

2、uaticus）中提取的耐热dna聚合酶。多次循环后的taq dna聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的dna的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。pcrpcr基本原理基本原理 pcr是一种选择性体外扩增dna或rna的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(denaturation):目的双链dna片段在94下解链; (2) 退火(annealing):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(extension): dna模板引物结合物在taq dna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列

3、为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的链。 pcr的三个反应步骤反复进行，使dna扩增量呈指数上升。反应最终的dna 扩增量可用计算。 c代表dna片段扩增后的拷贝数，表示扩增开始时dna模板数，p表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。pcrpcr的反应动力学的反应动力学 反应初期，靶序列dna片段的增加呈指数形式，随着pcr产物的逐渐积累，被扩增的dna 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” 这种效应称平台期，平台期受pcr 扩增效率、dna聚合酶的种类和活性及

4、非特异性产物的竞争等因素的影响。 pcrpcr扩增产物扩增产物可分为长产物片段和短产物片可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链个引物链55端之间，是需要扩增的特定片段。端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的在第一个反应周期中，以两条互补的dnadna为模板，为模板，引物是从引物是从33端开始延伸，端开始延伸， 其其55端是固定的，端是固定

5、的，3 3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长长产物片段产物片段”。pcrpcr扩增产物扩增产物 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链新合成的链(即即“长产物片段长产物片段”)结合。引物在与新链结时，结合。引物在与新链结时， 由于新链模板的由于新链模板的5端序列是固定的，端序列是固定的， 这就等于这次延伸的这就等于这次延伸的片段片段3端被固定了止点，端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的定于引物扩增序列以内、形成长短

6、一致的“短产物片段短产物片段”。不难看出不难看出“短产物片段短产物片段”是按指数倍数增加，是按指数倍数增加， 而而“长产物长产物片段片段”则以算术倍数增加，则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计，几乎可以忽略不计， 这使得这使得pcr的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯dna片段片段供分析与检测用。供分析与检测用。 pcr反应的特点n引物与模板引物与模板dna特异正确的结合特异正确的结合n碱基配对原则碱基配对原则ntaq dna聚合酶合成反应的忠实性聚合酶合成反应的忠实性n靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。灵敏度高灵敏度高pcrpcr反应特点

7、反应特点pcrpcr产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10(pg=10- 12- 12) )量级的起始待测模板扩增到微克量级的起始待测模板扩增到微克( (g=10g=10-6 -6) )水平。能从水平。能从100100万个细胞中检出一个靶细胞；在病万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，毒的检测中，pcrpcr的灵敏度可达的灵敏度可达3 3个个pfu(pfu(空斑形成空斑形成单位单位) )；在细菌学中最小检出率为；在细菌学中最小检出率为3 3个细菌。个细菌。 pcr反应用耐高温的反应用耐高温的taq dna聚合酶，一次性地将反应液加聚合酶

8、，一次性地将反应液加好后，即在好后，即在dna扩增仪上进行变性扩增仪上进行变性-退火退火-延伸反应，一般在延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。 pcrpcr反应特点反应特点简单、快速简单、快速不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，dna dna 粗制粗制品及总品及总rnarna均可作为扩增模板。可直接用临床均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的活组织等粗制的dnadna扩增检测。扩增检测。 pcrpcr反应特点反应

9、特点对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低pcrpcr反应体系优化反应体系优化pcr反应体系反应体系引物引物dntpdntpmgmg2+2+taqtaq聚合酶聚合酶模板模板反应缓冲液反应缓冲液 引物设计的引物设计的3 3条基本原则：条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发dnadna聚合反应聚合反应( (即即错配错配) )。 pcrpcr反应体系反应体系引物引物 引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp，常用的是，

10、常用的是18-27 bp，但不应大，但不应大于于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于，不适于taq dna聚合酶进行反应。聚合酶进行反应。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物的序列，否则容易导致错配。引物3端出现端出现3个以上的连续碱基，个以上的连续碱基，如如ggg或或ccc，也会使错误引发机率增加。，也会使错误引发机率增加。 引物引物3端的末位碱基对端的末位碱基对taq酶的酶的dna合成效率有较大的影响。不合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在

11、错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为a的错的错配效率明显高于其他配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱端使用碱基基a。另外，两条引物。另外，两条引物33端若互补，或者单条引物自身形成发夹结端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致构也可能导致pcr反应失败。反应失败。pcrpcr反应体系反应体系引物设计注意事项引物设计注意事项5端序列对端序列对pcr影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密

12、码子、可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. . 通常应通常应在在55端限制酶位点外再加端限制酶位点外再加1-21-2个保护碱基。个保护碱基。简并引物应选用简并程度低的密码子简并引物应选用简并程度低的密码子, , 例如选用只有一种密码子例如选用只有一种密码子的的met, 3met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。产物。两引物间最好不存在两引物间最好不存在4 4个连续碱基的同源性或互补性个连续碱基的同源

13、性或互补性引物序列的引物序列的gc含量一般为含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反，过高或过低都不利于引发反应，因为应，因为gcgc含量决定了含量决定了dnadna双链的解链温度（双链的解链温度（tmtm）。另外，上下游）。另外，上下游引物的引物的gc含量不能相差太大。含量不能相差太大。 pcrpcr反应体系反应体系引物设计注意事项引物设计注意事项 引物所对应模板位置序列的引物所对应模板位置序列的tm值在值在72左右可使复性条件最佳。左右可使复性条件最佳。tm值的计算有多种方法，如按公式值的计算有多种方法，如按公式tm4( (g+c) )2( (a+t) )，在，在oligo软件中使

14、用的是最邻近法软件中使用的是最邻近法( (the nearest neighbor method) ) 。 g值是指值是指dna双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用基对的相对稳定性。应当选用3端端g值较低（绝对值不超过值较低（绝对值不超过9），而），而5端和中间端和中间g值相对较高的引物。引物的值相对较高的引物。引物的3端的端的g值过高，容易在值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发错配位点形成双链结构并引发dna聚合反应。聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5

15、kcal/mol）易导致产生）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使pcr反应不能正常进行。反应不能正常进行。 对引物的修饰一般是在对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入入pcr产物的载体的相应序列而确定。产物的载体的相应序列而确定。 pcrpcr反应体系反应体系引物设计注意事项引物设计注意事项一般一般pcr反应中的引物终浓度为反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/l。引物过多会。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外过低则降

16、低产量。利用紫外分光光度计分光光度计, 可精确计算引物浓度可精确计算引物浓度, 在在1cm光程比色杯光程比色杯中中,260nm下下,引物浓度可按下式计算：引物浓度可按下式计算：x mol/l od260/ a(16000)+c(70000)+g(12000)+t(9600) x: 引物摩尔浓度引物摩尔浓度, a、c、g、t: 引物中引物中4种不同碱基个数。种不同碱基个数。 引物浓度计算引物浓度计算pcrpcr反应体系反应体系pcrpcr反应体系反应体系pcrpcr反应体系反应体系pcrpcr反应体系反应体系模板模板模板核酸的量与纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一，传统的dna纯化方法通常

17、采用sds和蛋白酶k来消化处理标本。sds的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，sds 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶k能水解消化蛋白质，特别是与dna结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于pcr反应。 pcrpcr反应体系反应体系模板的提取方法模板的提取方法pcrpcr反应体系反应体系pcr反应体系pcrpcr反应体系反应体系扩增效率扩增效率pcr扩增产物的分析扩增产物的分析 n凝胶电泳分析凝胶电泳分析 (1) 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 通常应用通常应用

18、12%的琼脂糖的琼脂糖 凝凝 胶，胶， 供检测用。供检测用。 (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）：）：610%聚聚 丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺凝胶 电泳分离效果较琼脂糖好电泳分离效果较琼脂糖好n酶切分析酶切分析 n分子杂交分子杂交 n测序测序 功能 引物设计引物设计限制性内切酶位点分析限制性内切酶位点分析dnadna基序基序(motif)(motif)查找查找同源性分析同源性分析常规常规pcrpcr技术及几类技术及几类pcrpcr新技术新技术q热启动热启动pcrqtouch-down pcrqrt-pcrq简并引物简并引物pcrq巢氏巢氏pcrq反向反向pcrq不对称不对称p

19、crq原位原位pcrq连接酶链反应连接酶链反应qrace-pcrqaflpq免疫免疫pcr(immunopcr(immuno-pcr)-pcr) 热启动pcr是除了好的引物设计之外，提高pcr特异性最重要的方法之一。尽管taq dna聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行pcr反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于dna工程的遗传元件的构建和操作，热启动pcr尤为有效。 限制taq dna聚

20、合酶活性的常用方法是在冰上配制pcr反应液，并将其置于预热的pcr仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动热启动pcr热启动通过抑制一种基本成分延迟热启动通过抑制一种基本成分延迟dna合成，直到合成，直到pcr仪达到变性温度。仪达到变性温度。包括延缓加入包括延缓加入taq dna聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板

21、和缓冲液，物理地隔离开。在热循或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 platinum dna聚合酶对于自动热启动聚合酶对于自动热启动pcr来说方便高效。来说方便高效。platinum taq dna聚合酶的成分为复合有抗聚合酶的成分为复合有抗taq dna聚合酶单克隆抗体的重组聚合酶单克隆抗体的重组taq dna聚聚合酶。

22、此酶在常温下活性被封闭，要在合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在94 95下加热数分钟才能够恢复下加热数分钟才能够恢复酶活性。酶活性。同经化学修饰用于热启动的同经化学修饰用于热启动的taq dna聚合酶相比，聚合酶相比，platinum酶不需酶不需要在要在94延时保温（延时保温（10到到15分钟）以激活聚合酶。使用分钟）以激活聚合酶。使用platinumtaq dna聚聚合酶，在合酶，在94进行进行2分钟就可以恢复分钟就可以恢复90的的taq dna聚合酶活性。聚合酶活性。热启动热启动pcr touch-down pcr又称降落又称降落pcr。即。即选定一个温度范围，选定一个温度范围，如如503

23、5 ，每，每降降1-2 进行进行1-2个个循环，然后在循环，然后在50度度下进行下进行15个个循环。循环。 touch-down的的原理原理：随着退火温度的降低，特异性逐随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。条带优先被扩增。 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的tm值高出值高出5-10度，然后每个循环递减度，然后每个循环递减1-2度

24、度touch-down pcrlow copy of targeted dna; high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers; rt-pcr using oligo-dt. touch-down pcr的应用范围的应用范围 rt-pcrrna的多聚酶反应（的多聚酶反应（rt-pcr）是以）是以rna 为模板，联合逆为模板，联合逆转录反应转录反应（reverse transcription，rt）与）与pcr，可用于检测单个细，可用于检测单个细胞或少数胞或少数细胞中少于细胞中少于10个拷贝的个拷贝的r

25、na模板。模板。 rna扩增包括两个步骤：扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成rna的互补的互补cdna加热后加热后cdna与与rna链解离，然后与另一引物退火，并由链解离，然后与另一引物退火，并由dna聚聚合酶催化引物延伸生成双链靶合酶催化引物延伸生成双链靶dna， 最后扩增靶最后扩增靶dnadouble strand cdnaaaaaatttttrtaaaaatttttrtrtaaaaatttttoligo dt primer is bound to mrnareverse transcriptase (rt) copies f

26、irst cdna strandreverse transcriptase digests and displaces mrna and copies second strand of cdnart-pcra. double strand dnab. denature9650c. anneal primers50d. polymerase binds72taqtaqrt-pcrcdnacdna第二链的合成方法有以下几种第二链的合成方法有以下几种: : (1) (1) 自身引导法自身引导法 合成的单链合成的单链cdnacdna 3 3 端能够形成一短的端能够形成一短的发夹结构发夹结构, ,这就为

27、第二链的合成提供了现成的引物这就为第二链的合成提供了现成的引物, ,当第一链合当第一链合成反应产物的成反应产物的dna:rnadna:rna杂交链变性后利用大肠杆菌杂交链变性后利用大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 klenowklenow片段或反转录酶合成片段或反转录酶合成cdnacdna第二链第二链, ,最后用对单链特异性最后用对单链特异性的的s1s1核酸酶消化该环核酸酶消化该环, ,即可进一步克隆。但自身引导合成法较即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用难控制反应，而且用s1s1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于致对应于mrna 5m

28、rna 5端序列出现缺失和重排端序列出现缺失和重排, ,因而该方法目前很因而该方法目前很少使用。少使用。 (2) (2) 置换合成法置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的生的cdna:mrnacdna:mrna杂交链不用碱变性杂交链不用碱变性, ,而是在而是在dntpdntp存在下存在下, ,利用利用rnarna酶酶h h在杂交链的在杂交链的mrnamrna链上造成切口和缺口。从而产生一系列链上造成切口和缺口。从而产生一系列rnarna引物引物, ,使之成为合成第二链的引物使之成为合成第二链的引物, ,在大肠杆菌在大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶的

29、的作用下合成第二链。该反应有作用下合成第二链。该反应有3 3个主要优点个主要优点: (1) : (1) 非常有效非常有效; ; (2) (2) 直接利用第一链反应产物直接利用第一链反应产物, ,无须进一步处理和纯化无须进一步处理和纯化; (3) ; (3) 不必使用不必使用s1s1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cdnacdna中的单链发夹环。中的单链发夹环。rt-pcrrt-pcr优化条件优化条件模板模板 ：作为模板的：作为模板的rna分子必须是完整的，并且不含分子必须是完整的，并且不含dna、蛋白和其、蛋白和其他杂质。他杂质。rna中即使含有最微量的中即使含有最微量的dna，经扩增后也会出

30、现非特异性，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白若未除干净，与扩增；蛋白若未除干净，与rna结合后会影响逆转录和结合后会影响逆转录和pcr；残留的；残留的rnase极易将模板极易将模板rna降解掉。降解掉。逆转录酶：逆转录酶：1)1)目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒禽类成髓细胞病毒(amv)(amv)逆转录酶和从表达克隆化的逆转录酶和从表达克隆化的moloneymoloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒鼠白血病病毒(mlv)(mlv)反转录酶。反

31、转录酶。amvamv反转录酶包括两个具有反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基若干种酶活性的多肽亚基, ,这些活性包括依赖于这些活性包括依赖于rnarna的的dnadna合合成成, ,依赖于依赖于dnadna的的 dnadna合成以及对合成以及对dna:rnadna:rna杂交体的杂交体的rnarna部分部分进行内切降解进行内切降解(rna(rna酶酶h h活性活性) )。mlvmlv反转录酶只有单个多肽反转录酶只有单个多肽亚基亚基, ,兼备依赖于兼备依赖于rnarna和依赖于和依赖于dnadna的的dnadna合成活性合成活性, ,但降解但降解rnadnarnadna杂交体中的杂交体中的

32、rnarna的能力较弱的能力较弱, ,且对热的稳定性较且对热的稳定性较amvamv反转录酶差。反转录酶差。2)普通逆转录酶反应温度为普通逆转录酶反应温度为37-42度，然而一些有丰富二级结构的度，然而一些有丰富二级结构的复杂模板或者高复杂模板或者高gc含量的模板在常温下扩增困难，需要将逆转录含量的模板在常温下扩增困难，需要将逆转录反应置于较高温度下进行改善扩增。对于较高的反应温度，建议使反应置于较高温度下进行改善扩增。对于较高的反应温度，建议使用用cmaster-rt酶，该酶在酶，该酶在37-60度的温度范围内都能保持良好的度的温度范围内都能保持良好的活性，使用活性，使用cmaster-rt酶

33、，可以增加反应产量，还可以增加逆酶，可以增加反应产量，还可以增加逆转录反应的特异性。因为，对于使用基因特异性引物（转录反应的特异性。因为，对于使用基因特异性引物（gsp）进行）进行cdna合成时，较高的反应温度允许使用合成时，较高的反应温度允许使用tm值较高的基因特异性引值较高的基因特异性引物。物。taq酶酶 普通的普通的taq酶扩增能力很强但是错配率高，虽然高产但是最酶扩增能力很强但是错配率高，虽然高产但是最大只能大只能 扩增扩增3-5kb的片段；而本身带有校读功能的高保真酶有很高的的片段；而本身带有校读功能的高保真酶有很高的保真度，不易出错，可扩增较长的片段，但是产量偏低。保真度，不易出错

34、，可扩增较长的片段，但是产量偏低。triplemaster酶则是一个高保真的混合酶酶则是一个高保真的混合酶在保留在保留taq酶的高聚合能酶的高聚合能力，保证高产的同时，还有效降低了力，保证高产的同时，还有效降低了taq的错配率，大大提高了保真的错配率，大大提高了保真性。性。rt-pcr buffer 引物：引物：(1)(1)上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的33端和下一个端和下一个外显子的外显子的55端，这样不会在基因组上扩出来。端，这样不会在基因组上扩出来。(2)(2)设计在两个离得远设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和的外显子上，这样从基因组

35、和cdnacdna上得到的片段长度不一样，可以上得到的片段长度不一样，可以一引两用一引两用。random 9mers适用于长的及具有hairpin构造的rna。适用于rrna、mrna、trna等所有rna的反转录反应 (用random 9mers合成cdna后，任何特异性的primer pair都可用于pcr反应)。oligo dt-adaptor primer适用于具有poly(a)+ tail的rna。注: 原核生物的rna、真核生物的rrna及trna (某些种类真核生物的mrna)不具有poly(a) tail。本primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后，用m13 prime

36、r m4可进行3-race。一步法：一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、taq酶、酶、4种种dntp 直接进行直接进行mrna反转录与反转录与pcr扩增。发现扩增。发现taq酶酶不仅具有不仅具有dna多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以重作用在同一体系中直接以mrna为模板进行反转录和其后为模板进行反转录和其后pcr扩扩增，从而使增，从而使mrna的的pcr步骤更为简化。所需样品量减少到最低限步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检

37、测非常有利。用一步法扩增可检测出总度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总rna中中小于小于1ng的低丰度的低丰度mrna。该法可用于低丰度。该法可用于低丰度mrna的的cdna文库文库的构建及特异的构建及特异cdna的克隆，并有可能与的克隆，并有可能与taq酶的测序技术相组合，酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。rt-pcr一步法和两步法一步法和两步法两步法：由于单管反应时两步法：由于单管反应时rt和和pcr都不能在最佳条件下都不能在最佳条件下进行并且进行并且 容易相互干扰，常只适

38、宜用基因特异引物扩增容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量较短的基因，及定量pcr。两步法则是将。两步法则是将rt和和pcr分别分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些活而且严谨，适合那些gc含量、二级结构严重的模板或含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的者是未知模板，以及多个基因的rt-pcr。rt-pcr一步法和两步法一步法和两步法兼并引物兼并引物pcr（degenerate primer）密码子的密码子的简并简并性性氨基酸密码子数氨基酸密码子数、简并引物是简并引物是指代表编

39、码单个氨基酸所有不同碱基可能指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。性的不同序列的混合物。简并度越低，产物特异性越简并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择简并性小的氨基酸，并避强。设计引物时应尽量选择简并性小的氨基酸，并避免引物免引物33末端简并，末端简并，因为因为3 3端最后端最后3 3个碱基的退火足以个碱基的退火足以在错误位点起始在错误位点起始pcrpcr；次黄嘌呤可以同所有的碱基配；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。对，降低引物的退火温度。兼并引物兼并引物pcr（degenerate primer）巢氏巢氏pcr（nested pcr） 巢氏巢氏

40、pcr需要两到三对引物，一般采用需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增第一套引物扩增15-30个循环，再用扩增个循环，再用扩增dna片段内设定的第二套引物扩增片段内设定的第二套引物扩增15-30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。套式引物却很少扩增。套式引物pcr减少了引物非特异性退火，从而减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。增加了特异性扩增，提高了扩增效率。 若将套若将套式式pcr的内外引物稍加改变，延长外引物长度（的内外引物稍加改变，延长外引物长度（25-30bp），同时缩短内引物长度（

41、），同时缩短内引物长度（15-17bp），使外引物先在），使外引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，然后改换至三温循环，使高退火温度下复性，做双温扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。反向反向pcr（inverse pcr） 反向反向pcr的目的在于扩增一段已知序列旁侧的的目的在于扩增一段已知序列旁侧的dna，也就，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧

42、合成dna。反向。反向pcr可用于研究与已知可用于研究与已知dna区段相连接的未知染区段相连接的未知染色体序列，因此又称为染色体步移。这时选择的引物虽然与色体序列，因此又称为染色体步移。这时选择的引物虽然与核心核心dna两末端序列互补，但引物两末端序列互补，但引物3端是相互反向的。端是相互反向的。 反向反向pcr的操作流程：扩增前先用限制性内切酶酶切样品的操作流程：扩增前先用限制性内切酶酶切样品dna，然后用，然后用dna连接酶连接成一个环状分子，通过反向连接酶连接成一个环状分子，通过反向pcr扩增引物的上游片段和下游片段。扩增引物的上游片段和下游片段。选择多种限制性内切酶，基本准则是选择不能

43、在选择多种限制性内切酶，基本准则是选择不能在非酶切位点切断靶非酶切位点切断靶dnadna的酶。裂解核心区的内切的酶。裂解核心区的内切酶使反向酶使反向pcrpcr只能扩增引物所定模板只能扩增引物所定模板( (依赖于引物依赖于引物) )的上游或下游区，而不裂解核心区的酶则使两侧序的上游或下游区，而不裂解核心区的酶则使两侧序列都扩增列都扩增 southernsouthern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向及反向pcrpcr的片段的末端片段的片段的末端片段 大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，所以往往需要

44、两组到三组嵌套引物所以往往需要两组到三组嵌套引物反向反向pcr（inverse pcr）不对称不对称pcr（asymmetric pcr） 不对称不对称pcrpcr的基本原理是采用不等量的引物产生大量的的基本原理是采用不等量的引物产生大量的单链单链dnadna（ss ss-dna-dna）。这两种引物分别称为限制性引物与）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为非限制性引物；其最佳比例一般为1 1：501501：100100，关键是，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于ss ss- -dnadna。 不对称不对

45、称pcrpcr反应过程：一般来说，在不对称反应过程：一般来说，在不对称pcrpcr反应中，反应中，在在 开始的开始的20-2520-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链出双链dnadna，当限量的那个引，当限量的那个引 物耗光后，随后的物耗光后，随后的5-105-10个循个循环就产生出环就产生出ssdnassdna。 产生的产生的ds-dnads-dna与与ss ss-dna-dna由于分子量不同，可以通过电由于分子量不同，可以通过电泳分离。泳分离。 一般对一般对100l pcr反应体系而言，当引物比率反应体系而言，当引物比率为为50pmo:0

46、.5pmol，经过，经过30个循环个循环 后，大约可产后，大约可产生生1-3pmol的的ssdna。ssdna的产量可用下列几的产量可用下列几种方法来估计种方法来估计:a)在在ss-dna合成过程中，掺入合成过程中，掺入32p-dntp。取。取10%的反应产物，经过琼脂的反应产物，经过琼脂 糖电泳分离后，放糖电泳分离后，放射自显影。射自显影。b)取取5%的反应物来走的反应物来走 胶，转移到膜上，并用与胶，转移到膜上，并用与ssdna互补的寡核苷酸为探针杂交。互补的寡核苷酸为探针杂交。 不对称不对称pcrssdna产物量产物量n解决不对称解决不对称pcr反应扩增效率低的方法：反应扩增效率低的方法

47、：n增加增加pcr循环的次数循环的次数n在最后五个循环中多加在最后五个循环中多加tab聚合聚合 酶酶(2u)n试一下相反的不对称引物比率。有时，试一下相反的不对称引物比率。有时，相反的不对称引物比率可能给出不相反的不对称引物比率可能给出不 同产同产量的量的ssdna。in situ pcr 原位原位pcr就是在组织细胞里进行就是在组织细胞里进行pcr反应，它结合了具有细胞定位能力的原反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的位杂交和高度特异敏感的pcr技术的优技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术一项有较大潜力的新技术.

48、 原位原位pcr是是hasse等于等于1990年建立的，实验用的年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等等.其基本方法为其基本方法为固定组织或细胞固定组织或细胞:将组织细胞固定将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶蛋白酶k消化处消化处理理:用用60ug/ml的蛋白酶的蛋白酶k将固定好的组织细胞片将固定好的组织细胞片55消化处理消化处理2h后，后，962min以灭活蛋白酶以灭活蛋白酶k.

49、pcr扩增扩增:在组织细胞片上，加在组织细胞片上，加pcr反应液，反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行板上，进行pcr循环扩增循环扩增.有的基因扩增仪带有的基因扩增仪带有专门用于原位有专门用于原位pcr的装置的装置.杂交杂交:pcr扩增扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交交.显微镜观察结果显微镜观察结果.n原位原位pcr既能分辩鉴定带有靶序列的细既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机于分子和细胞水平

50、上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值用价值.其特异性和敏感性高于一般的其特异性和敏感性高于一般的pcr. 原位原位pcr 连接酶链反应连接酶链反应(ligase(ligase chain reaction chain reaction，lcr)lcr)，是一种新，是一种新的的dnadna体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增的扩增. . 连接酶链反应是连接酶链反应是backman1997backman1997年为检出靶基因序列中的点年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申

51、报了专利突变而设计发明，并申报了专利.1988.1988年年landegrenlandegren也进行了也进行了该项研究该项研究.1988.1988年年backmanbackman等又因分离热稳定的连接酶，而申等又因分离热稳定的连接酶，而申报专利，报专利，19911991年年backmanbackman和和baranybarany分别用耐热分别用耐热dnadna连接酶进行连接酶进行了了lcrlcr试验试验. .耐热耐热dnadna连接酶可以在热循环中保持活性，提高连连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断

52、补充酶的繁琐程序琐程序. .连接酶链反应连接酶链反应(ligase(ligase chain reaction chain reaction，lcr)lcr) lcrlcr的基本原理为利用的基本原理为利用dnadna连接酶连接酶. .特异地将双链特异地将双链dnadna片片段连接，经变性段连接，经变性- -退火退火- -连接三步骤反复循环，从而使靶基因连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增序列大量扩增. .其程序为其程序为: :在模在模dnadna、dnadna连接酶、寡核苷酸引连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下(9

53、4(9495)95)使使dnadna变性，双链打开，然后降温退火变性，双链打开，然后降温退火(65)(65)，引物与，引物与之互补的模板之互补的模板dnadna结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，dnadna连接酶即可连连接酶即可连接封闭这一缺口，则接封闭这一缺口，则lcrlcr反应的三步骤反应的三步骤( (变性变性- -退火退火- -连接连接) )就就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增

54、板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增. .若连接处的靶序列有若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物物. .连接酶链反应连接酶链反应(ligase(ligase chain reaction chain reaction，lcr)lcr)ligase chain reaction (lcr)ligase chain reaction (lcr)denaturation 70cannealing and ligat

55、ion 40cdenaturation 70cligase chain reaction (lcr) lcrlcr的引物是两对分别互补的引物，引物长度为的引物是两对分别互补的引物，引物长度为20202626个，以保证引物与靶序列的特异性结合，个，以保证引物与靶序列的特异性结合，lcrlcr识别点突变的特异性高于识别点突变的特异性高于pcrpcr，其特异性首先取，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性的特异性.lcr.lcr连接反应温度接近寡苷酸的解链温度连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(tm)(tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高，因而识别单核苷酸错配的特异性极高. .lcrlcr的扩增效率与的扩增效率与pcrpcr相当，用耐热连接酶做相当，用耐热连接酶做lcrlcr只用两个温度循环，只用两个温度循环，94min94min变性和变性和6565复性并复性并连接，循环连接，循环3030次左右次左右. .其产物的检测也较方便灵敏其产物的检测也较方便灵敏. .目前该方法主要用点突变的研究与检测