基因克隆的一般流程ppt课件

1、基因克隆的普通流程基因的获得基因的获得PCRRT-PCR载体载体衔接衔接预备感受态细胞预备感受态细胞转化转化重组子挑选重组子挑选下游任务下游任务载体的选择n基因工程载体普通要求：基因工程载体普通要求：n能在宿主细胞中复制繁衍，有较高的自主复制才干。能在宿主细胞中复制繁衍，有较高的自主复制才干。n易进入宿主细胞，进入效率越高越好。易进入宿主细胞，进入效率越高越好。n适宜的多克隆位点适宜的多克隆位点MCS可接受外源片段，且不影响其可接受外源片段，且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。进入宿主细胞和在细胞中的复制。n易从宿主细胞中分别纯化出来，易从宿主细胞中分别纯化出来， 便于重组操作。便于重组操

2、作。n有挑选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入有挑选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被识别和分别出来。便于克隆操作。宿主细胞都能容易被识别和分别出来。便于克隆操作。n常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等重组 DNA 技术的普通流程 目的目的DNADNA的获得的获得 目的目的DNADNA与载体的衔接与载体的衔接 重组子导入受体细胞重组子导入受体细胞 重组子的挑选和鉴定重组子的挑选和鉴定实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建nNGF 基因的克隆(T-A克隆)NGF-sense: a GAGCTC aagatgctgtgcctcaa

3、gccagtNGF-antisense: at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg5 56 6pEGFP 荧光质粒表达载体质粒DNA的酶切反响结果质粒质粒 M M 酶切反响酶切反响 M M 酶切反响酶切反响pEGFP pT-NGF酶切产物凝胶回收操作步骤Gel Extraction Kit认逼真下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。按300lS1溶液/100mg凝胶参与的比例参与S1溶液，置50水浴10分钟，使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置搜集管中，9000g30秒，倒掉搜集管中的液体，再将吸附柱放入同一搜集管中。在吸

4、附柱中参与500l W1溶液，9000g15秒，倒掉搜集管中的液体，再将吸附柱放入同一搜集管中。反复一次洗柱。将吸附柱放入同一搜集管中。9000g1分钟。将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央参与30lddH2O，静置1分钟，9000g1分钟。备用。重组子的挑选n耐药性基因 n 外源质粒赋予宿主抗生素抗性n蓝白斑挑选互补景象 n lacZ plasmid 和 M15 cell strain 关于衔接酶定义：定义：ATP存在下，在存在下，在3OH和和5 P之间构成磷酸二酯键。之间构成磷酸二酯键。特性：衔接粘端的效率远高于平端。特性：衔接粘端的效率远高于平端。战略：战略：o首选不匹配粘端

5、首选不匹配粘端o次选匹配粘端，载体脱磷次选匹配粘端，载体脱磷o平端衔接，延伸时间，提高酶量平端衔接，延伸时间，提高酶量平端衔接图示匹配粘端衔接图示 不匹配粘端衔接图示衔接反响的建立 衔接反响的温度：衔接反响的温度： 粘性末端，按粘性末端，按A-T，G-C含量计算，含量计算，5。 如如 Pst ICTGCAG，12 ，EcoRIGAATTC，8。 平末端，如平末端，如EcoRGATATC，可在室温进展，可在室温进展，不超越不超越30，酶的用量要比粘性末端加大，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍倍 。 DNA量：量： 摩尔数之比摩尔数之比 载体载体:目的目的 DNA 1 : ( 13 ) 载体

6、摩尔数载体摩尔数 目的基因片段碱基数目的基因片段碱基数载体载体分量分量 目的目的DNA摩尔数摩尔数 目的基因片段分量目的基因片段分量载体载体碱基数碱基数 载体和目的基因的衔接反响 如未定量可以按回收效率75计算DNA浓度，按载体与目的基因摩尔数比1:3进展衔接。 衔接反响在灭菌的0.5ml离心管中进展。15 l体积反响体系中： 加ddH2O使终体积为 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15- 30 ng 10Ligase Buffer (已含有ATP) 1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l 悄然混匀，稍加离心, 14-16或4,O/N 。重组子转入受体细胞 体外重组的体外重组的DNADNA引入受体细胞引入受体细胞 感受态感受态: :受体细胞处于易于接受外源受体细胞处于易于接受外源 DNA DNA 的形状的形状 原理原理: :1 1遗传物质的传送遗传物质的传送 2 2受体菌的选择与改造受体菌的选择与改造重组质粒的酶切鉴定重组子的鉴定n插入片段长度大小鉴定插入片段长度大小鉴