流式细胞仪的原理与应用

1、流式细胞术原理和应用流式细胞术原理和应用姓 名：白小燕 专 业：微生物学一一 简简 介介流式细胞仪的特点流式细胞仪的特点=单个细胞或微粒分析=同时多参数分析=速度快：10000个细胞(微粒)/秒=统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况=分选感兴趣的细胞或微粒流路 (液流系统）流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计 （分析系统） 计算机 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英

2、玻光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为璃中央开一个孔径为430m180m的长方形孔，的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。液流系统流动室流动室Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid

3、液流系统 激光光源：目前台式机激光光源：目前台式机FCM，大多采用，大多采用氩离子气体激光器。激光氩离子气体激光器。激光(laser)是是种种相干光源，相干光源，它能提供单波长、高强度及它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为每个细胞经过光照区的时间仅为1s左右，左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照的强度有关，

4、因此细胞需要足够的光照强度。强度。 光学系统信信 号号 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 FITCFL1 FITC FL2 PEFL2 PE FL3 ECDFL3 ECD FL4 PC5FL4 PC5光学系统散射光信号 细胞大小及颗粒性FSSS光学系统光路 （滤片特性）LONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass (600/100)Transmitted 550 nm550 - 650 nm (600

5、50)Wavelengths Blocked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nm光学系统电路 电压调节 光电倍增管光电倍增管 电压电压 voltsvolts 增益增益 GainGain 信号放大方式信号放大方式检测系统 电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。 细胞DNA含

6、量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。 检测系统常用荧光染料介绍 FITC： 绿色 525nm PE： 橙黄色 575nm ECD： 橙红色 610nm PECY5： 深红色 675nm PerCP： 深红色 675nm PECY7： 深红色 755nm 7AAD： 深红色 675nm PI(碘化丙啶）： 橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发1. 单参数一维直方图 纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或散色光信号值，单位是道数。2. 双参数二维点图显示来自同一细胞的两个参

7、数与细胞数量间的关系。横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。 白血病免疫分型白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞网织红细胞 PNH诊断（诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验血小板活化试验1 流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用 细胞大小细胞大小 细胞的颗粒度细胞的颗粒度 细胞表面分子：细胞表面分子：CD 系列系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：细胞核内分子：P53 细胞功能检

8、测：细胞周期、凋亡细胞功能检测：细胞周期、凋亡2 流式细胞术的科研应用流式细胞术的科研应用 概念：白细胞分化抗原(DC)CD (cluster of differentiation)指的是分化群或分化簇。在使用CD命名细胞膜表面免疫标志的初期，他专职白细胞膜上的 抗原或抗原识别的抗体，故又称白细胞 分化抗原。目前“CD”代表的不仅仅是白细胞表面抗原，还有红细胞膜表面抗原、血小板表 面抗原、髓系细胞表面抗原及其他组织 细胞表面或细胞内的抗原等，研究方法 以流式细胞术检测法为主。1、在血液学中的应用： 2、细胞周期分析：、细胞周期分析：DNA的含量随细胞周期(G1，S，G2 ，M)的各个时期呈现出

9、周期性的变化G1期，是细胞RNA和蛋白质的合成期，即DNA合成前期,此时细胞核内DNA含量保持二倍体；进入S期后，DNA开始合成，即DNA合成期,细胞核内DNA的含量介于二倍体至四倍体之间；细胞进入G2期，即细胞分裂前期，DNA含量为四倍体,直到进入M期，即细胞分裂期,细胞分成两个子细胞, M期结束进入下一个细胞周期。1）细胞增殖周期各时相细胞数的比率: 在生物细胞核中，DNA含量随细胞增殖周期时相不同而发生 变化。因此，不同种类的细胞，其细 胞各期（G0/1期, S期, G2/M期）百分比含量是不同的。亚亚G1峰检测峰检测：凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞体 变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质浓集是由于凋亡细胞双链 DNA发生裂解所致。DNA降解后，形成长度为180-200bp的DNA片段，称凋亡小体。即在流式细胞检测上可出现亚二倍体(G1)峰值。而常规坏死的DNA分解是随机的， DNA