科研英文文献汇报英文MicroRNAPPT课件

1、目录ContentsoductionOthersMethodsResultsDiscussion第1页/共58页 在全世界，肺癌是癌症相关性疾病中主要的致病因。尽管手术及药物治疗水平有所提高，肺癌患者的生存率依然极低。总体来说，分期较早的非小细胞肺癌患者，无论是手术还是非手术患者均得到了控制。然而，非小细胞肺癌导致局部及远处转移的分子机制尚不清楚。 在非小细胞肺癌组织中，我们证实了microRNA-224 (miR-224) 显著上调，尤其发生转移的组织中。增加miR-224 表达水平，其通过以抑癌物质TNF-induced protein 1 (TNFAIP1) （肿瘤坏死因子介导蛋白1）及

2、SMAD4为靶点，从而促进了细胞的迁移，侵袭及增殖。与体外实验一致，裸鼠异体移植实验也证实了miR-224 在体内非小细胞肺癌中作为强力致癌的miRNA。同时，我们还发现了在非小细胞肺癌中，启动子甲基化及ERK信号参与调节miR-224的表达。上调的 miR-224通过拮抗SMAD4及SMAD4 的抑制作用，从而增强非小细胞肺癌的形成及肿瘤侵袭性。第2页/共58页全基因组miRNA测序miR-224在ADC及SCC中miR-224 明显上调体内体外相关分析细胞转染过表达及下调系统细胞系裸鼠miR-224在肺癌中的作用寻找作用靶点TNFAIP1及SMAD4的3-UTRs共转染3-UTRs及miR

3、NA 转染细胞相关分析TNFAIP1及SMAD4是否为特异性靶点TNFAIP1及SMAD4与miR-224相关性及作用miR-224以TNFAIP1 及 SMAD4的3端为作用靶点低甲基化探针相关分析miR-224与启动子甲基化的关系相关分析及细胞系佛脂醇治疗启动子低甲基化及激活的ERK信号通路介导miR-224的表达第3页/共58页非小细胞肺癌非小细胞肺癌 NSCLC（nonsmall cell Lung cancer） 非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢其癌细胞生长分裂较慢, ,扩散转移相对较晚。

4、非小细胞肺癌约占所扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的有肺癌的80%80%，约，约75%75%的患者发现时已处于中晚期，的患者发现时已处于中晚期，5 5年生存率很低。年生存率很低。MicroRNAs（miRNAs） 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNARNA，其大小长约，其大小长约20252025个核苷酸通过碱基互补配对的方式识别靶个核苷酸通过碱基互补配对的方式识别靶mRNAmRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNAmRNA或者阻或者阻遏靶遏靶mRNAmR

5、NA的翻译，参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防的翻译，参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、器官形成、细胞增殖和凋亡等。御、器官形成、细胞增殖和凋亡等。TNFAIP1（TNF-induced protein1） 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子-（Tumor Necrosis FactorTumor Necrosis Factor，简写，简写TNFTNF）是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子胞因子。而肿瘤坏死因子介导蛋白。而肿瘤坏死因子介导蛋白1 1涉及涉及DNADNA合成及凋亡合成及凋亡. .SMAD4 Smads

6、Smads家族蛋白在将家族蛋白在将TGF-(TGF-(转化生长因子转化生长因子) )信号从信号从细胞表面细胞表面受体受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用传导至细胞核的过程中起到关键性作用。按功能分为按功能分为3 3类：类：即受体活化型或通路限制性即受体活化型或通路限制性Smad(RSmad(RSmads)Smads)、共同通路型共同通路型Smad(CoSmad(CoSmad)Smad)和抑制性和抑制性Smad(ISmad(ISmads)Smads)。第4页/共58页miR-224上调在非小细胞肺癌中的功能第5页/共58页全基因组miRNA测序倍数变化的miRNAmiR-224技术路线技术路线

7、俄亥俄州立大学综合癌症中心癌症和肿瘤基因图谱miR-224在ADC及SCC中的表达原位分子杂交在有转移的肺癌中miR-224的表达生存分析miR-224与肺癌患者的预后肺癌中miR-224的表达水平及是否与转移有关转染细胞统计细胞的迁移、侵袭及增殖能力过表达及降低系统miR-224在肺癌中的作用体外转染细胞皮下注射至裸鼠过表达及降低系统miR-224在肺癌中的作用观察肿瘤体积及镜下改变体内第6页/共58页4 4例伴淋巴结转移的肺腺癌例伴淋巴结转移的肺腺癌6 6例不伴淋巴结转移的肺腺癌例不伴淋巴结转移的肺腺癌genome-wide miRNA sequencing第7页/共58页8787例例NS

8、CLCNSCLC 48 48例例NATNAT (正常正常)在在ADCADC及及SCCSCC中，中，miR-224 miR-224 明显明显上调上调Ohio State University Comprehensive Cancer Center (OSUCCC)俄亥俄州立大学综合癌症中心第8页/共58页666666例例ADCADC及及SCCSCC8686例例NATNAT相较于相较于NATsNATs，miR-224miR-224在在ADCADC及及SCCSCC中明中明显显上调上调Of the evaluable 468 primary lung ADC patients, 46 patients

9、 had matched normal adjacent tissues. Of the evaluable 198 primary lung squamous carcinoma patients, 40 patients had matched normal adjacent tissues. The Cancer Genome Atlas (TCGA) 癌症和肿瘤基因图谱第9页/共58页明确分期明确分期281281例例ADC N0ADC N0143143例例ADC N1+ADC N1+伴淋巴结转移的患者中，伴淋巴结转移的患者中，miR-224 miR-224 明显明显上调上调miR-22

10、4 expression in 281 N0 patients versus 143 N1+ patients from TCGA lung ADC dataset第10页/共58页NSCLCNSCLCNATsNATsmiR-224 miR-224 在在61% 61% 的的病例中病例中过表达过表达5151例例配对配对原位分子杂交原位分子杂交 在有转移的肺癌中，在有转移的肺癌中，miR-224miR-224表达更强表达更强 miR-224miR-224可能在有转移的肺癌中起到重要作用可能在有转移的肺癌中起到重要作用Summary of tissue micro array data for lu

11、ng cancer and corresponding normal tissue. Paired analysis represents subtraction of NAT staining score from matched lung cancer tissue scores.第11页/共58页miR-224miR-224表达与生存之间表达与生存之间并无并无明显联系明显联系642642例例NSCLCNSCLCKaplanMeier 生存分析生存分析TCGA第12页/共58页miR-224miR-224与有与有(kras)/p53 (kras)/p53 突变肺突变肺腺癌患者的不良预后腺癌

12、患者的不良预后明显相关明显相关5959例例ADCADCKaplanMeier 生存分析生存分析同样地在有(kras)/p53 突变肺腺癌患者中，相较N0组，可观察到N1+ 组 的miR-224 expression表达上调，miR-224 expression in 31 N0 patients versus 26 N1+ patients from lung ADC patients who have TP53 and/or KRAS mutations. 第13页/共58页H 1299H 1573H 460miR-224过表达 转染含转染含miR-224miR-224前体的前体的Lenti

13、-miRLenti-miR载体载体A 549miR-224下调转染含转染含miRZip-224 antimiR-224 miRZip-224 antimiR-224 结构结构的载体的载体RT-PCR第14页/共58页H1299H1573miR-224过表达过表达H1299 and H1573H1299 and H1573细胞的迁移，侵袭细胞的迁移，侵袭及增殖及增殖明显增加明显增加Cell migration assay for miR-224overexpressing H1299 andH1573 cells using transwell membranesCell invasion as

14、say for miR-224overexpressing H1299 and H1573 cellsCell proliferation assay for miR-224overexpressinglung cancer cells第15页/共58页迁移细胞计数迁移细胞计数H460Migrated cell counts after overexpressing miR-224 in H460 Migrated cell counts after knockdown miR-224 in A549 cells Migrated cell counts after overexpressin

15、g miR-224 in H1299 (e), H1573 (f),H1299及H1573第16页/共58页A549migration assay for miR-224knockdown A549 cellsCell proliferation assay for miR-224 knockdown A549 cellsMigrated cell counts after knockdown miR-224 in A549 cells.第17页/共58页H460/miR-224 对照组细胞系对照组细胞系或或 A549/miRZip224皮下注射至裸鼠侧面相较于对照组细胞， 过表达miR-22

16、4 的H460细胞系 显著增加了体内的肿瘤增长第18页/共58页下调下调A549 细胞中细胞中的的miR-224皮下注射至裸鼠侧面肿瘤体积减少在肺癌中miR-224作为致癌 miRNA . 第19页/共58页镜下第20页/共58页miR-224以TNFAIP1 及 SMAD4的3端为靶点第21页/共58页技术路线技术路线生物信息分析TNFAIP1及及SMAD4的的3-UTRs寻找靶点共转染3-UTRs及miRNA 是否为靶点免疫荧光共转染突变3-UTRs及miRNA 靶点特异性免疫荧光TNFAIP1及SMAD4是否为特异性靶点过表达及降低系统miR-224对靶蛋白的影响OSUTCGA数据库检测

17、TNFAIP1及SMAD4表达相关分析TNFAIP1及SMAD4与miR-224相关性转染细胞miR-224的促癌作用是否由于与靶基因TNFAIP1及SMAD4结合并降低抑癌作用过表达及降低系统转染SMAD4至过表达miR-224细胞评估SMAD4作用TGF-治疗miR-224是否通过以SMAD4为靶点而影响TGF-信号通路第22页/共58页3-UTRs的荧光信号持续性减低的荧光信号持续性减低3-UTRsmiR-224 mimics293T cells共转染miR-224 3-UTRs的突变形式野生型 3-UTRs的荧光信号持续性减低的趋势减弱野生型的及 突变的 TNFAIP1 and SMA

18、D4 3-UTRs 与with miR-224 mimic 共转染至 293T 细胞miRNA and 3-UTRs靶点的特异性.第23页/共58页在在H1299, H1573, 和和 H460细胞系中，细胞系中，mRNA and 蛋白质的蛋白质的TNFAIP1 and SMAD4 表达表达 减少减少过表达miR-224Western blot and quantitative RT-PCR 检测转染了表达 miR-224前体的及对照载体的肺癌胞中，TNFAIP1 及 SMAD4 蛋白及 mRNA 水平第24页/共58页在在 A549 细胞中，细胞中，TNFAIP1 及及 SMAD4 mRNA

19、蛋蛋白质水平表达增加白质水平表达增加下调miR-224Western blot and quantitative RT-PCR 检测转染了表达 下调miR-224的及对照载体的肺癌胞中，TNFAIP1 及 SMAD4 蛋白及 mRNA 水平检测miR-224 对 靶蛋白及靶 mRNA的影响第25页/共58页TNFAIP1 (P = 4.9E-15) and SMAD4(P = 2.2E-16) 表达显著降低表达显著降低TNFAIP1和 SMAD4 表达降低原发性肺鳞癌组织, TNFAIP1 和SMAD4 减少.334ADC &57NATs334ADC &57NATs 349SS

20、C &51NATs 349SSC &51NATs TCGA dataset第26页/共58页NSCLC中中TNFAIP1 (5.23E-14) and SMAD4 (2.67E-06)的表达下降的表达下降TNFAIP1 and SMAD4 expressions in 63 NSCLC patients with 48 matched NATs from OSU cohort6363例例NSCLC NSCLC &48 NATs &48 NATs 第27页/共58页111111例例NSCLC OSUNSCLC OSU 306 306例例NSCLC TGGANSCL

21、C TGGAPearson 相关分析miR-224 与TNFAIP1 and SMAD4 呈负相关OSU cohortTCGA 第28页/共58页TNFAIP1下调增加H460的迁移及增值能力 knockdown H460 cells using transwell membranesmigration assay for TNFAIP1 for TNFAIP1 knockdown H460 lung cancer cells.Cell proliferation assay Western blot analyses cell migration assay第29页/共58页TNFAIP1下

22、调增加H1299的迁移及增值能力 Cell proliferation assay for TNFAIP1 knockdown H1299 lung cancer cellsCell migration assay for TNFAIP1 knockdown H1299 cells using transwell membranes第30页/共58页在用TNF治疗后，相较H1299/miRCont 细胞，H1299/miR-224 细胞 中poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)表达水平减少Western blot analysis H1299/miR-22

23、4 and H1299/miRCont cells用及不用TNF 处理 4 hCell proliferation assay for H1299/miR-224 and H1299/miRCont cells 用及不用TNF 处理 4 h.在H1299细胞中， miR-224 明显减缓TNF介导的生长抑制 miR-224通过以 肺癌中的TNFAIP1为靶点参与 TNF介导的凋亡第31页/共58页稳定过表达miR-224的肺癌细胞中转染SMAD4H1299 and H1573 肺癌细胞中均减弱了介导的增加增殖及迁移的能力proliferation assay and migration ass

24、ay of miR-224overexpressing cells transfected with SMAD4 or empty vectorWestern blot analysis of miR-224 overexpressing cells transfected with SMAD4 (do not contain 3UTR) or empty vectorcell migration assay for miR-224 overexpressing cells transfected with SMAD4 or empty vector第32页/共58页用TGF-处理miR-22

25、4过表达组及对照组细胞 在H460细胞中，miR-224 明显损害了 TGF-介导的SMAD4细胞核转录作用 miR-224 明显减弱了TGF-介导的对细胞生长及迁移能力的抑制作用miR-224以SMAD4为靶点在TGF-信号通路中起到重要作用第33页/共58页启动子低甲基化及激活的ERK信号通路介导miR-224的表达第34页/共58页技术路线技术路线低甲基化探针检测miR-224启动子甲基化水平miR-224与启动子甲基化的关系甲基化特异高分标率溶解分析重硫酸盐序列验证TCGA数据库相关分析TCGA数据库检测ERK及miR-224表达是否相关相关分析细胞系佛脂醇治疗免疫荧光等检测miR-2

26、24是否受ERK信号通路调控第35页/共58页miR-224, miR-452及GABRE的标准化表达值从TCGA 数据库中提取出并进行Pearson 相关分析miRNA表达受表观遗传修饰及转录激活控制。 miR-224 and miR-452 位于宿主基因 -Aminobutyric Acid A Receptor (GABRE)内显子5上，并且GABRE启动子 区域有CpG 岛图式结构 显示miR224miR452GABRE的基因位点。miR-224 and miR452 位于GABRE的6内显子. TSS i显示假定的转录位点。黑色区域显示CpG 岛延伸到GABRE的外显子1正相关这三个

27、基因受相同的启动子调节第36页/共58页选择位于 CpG 岛位于启动子区域的9个甲基化探针, Pearson 相关分析相关分析ADC (n = 221) SCC (n = 125)8个探针均显示在NSCLC中与miR-224 表达的负相关miR-224 and methylation probe cg27049053 in (A) lung ADC and (B) SCC.启动子甲基化在抑制miR-224转录中起重要作用第37页/共58页甲基化特异高分标率溶解分析469NAT 489NAT A549 H647469NAT 及485NAT 细胞1030% 甲基化 ，两个肺癌细胞系中0% 甲基化m

28、elting curvesfrom each cell line -green standard meltingcurves -orange第38页/共58页重硫酸盐序列469NAT 489NAT 证实了正常肺组织中每个CpG 甲基化水平用脱甲基化试剂 5-aza-CdR处理 3 天miR-224 表达水平增加非小细胞肺癌中，miR-224启动子相关CpG岛的低甲基化水平的部分原因是由于肺癌中的miR-224 高表达。第39页/共58页前期研究我们观察到一个趋势：相较野生型的肺癌细胞系，有RAS突变的肺癌细胞系中miR-224 的表达更高。第40页/共58页188例ADC总ERK2蛋白与 mi

29、R-224表达水平之间存在显著正相关第41页/共58页用佛脂醇活化用佛脂醇活化 ERK1/2 ERK1/2H460A549相较不使用佛化醇治疗的肺癌细胞系，使用佛脂醇的细胞系中miR-224的表达均明显上调A549H460第42页/共58页用佛脂醇活化用佛脂醇活化 ERK1/2H460A549包含miR-224启动区域的荧光素酶显著增加了荧光素酶活性，在PMA 治疗后更加明显miR-224 可能被 ERK信号通路调控第43页/共58页目录ContentsoductionOthersMethodsResultsDiscussion第44页/共58页DiscussionDiscussion 大多数

30、的人类恶性肿瘤大多数的人类恶性肿瘤均与异常表达的均与异常表达的miRNA有关，有关，有一部分有一部分miRNA作为致癌因作为致癌因子，另一部分作为抑癌因子。子，另一部分作为抑癌因子。大多数报道指出，包括肝细大多数报道指出，包括肝细胞癌，结直肠癌，乳腺癌等胞癌，结直肠癌，乳腺癌等在内的实体瘤均与在内的实体瘤均与miR-224的上调有关的上调有关 最近有研究显示，最近有研究显示，miR-224在非小细胞肺癌中具在非小细胞肺癌中具有致癌的生物学价值。有致癌的生物学价值。第45页/共58页 KaplanMeier 生存分析显示生存分析显示miR-224表达与非小细胞肺癌生存率并无显著表达与非小细胞肺癌

31、生存率并无显著联系，可能由于分期不同，接受治疗不同。联系，可能由于分期不同，接受治疗不同。 亚组分析指出亚组分析指出miR-224与有与有kras/p53基因基因突变的突变的ADC患者预后差有关患者预后差有关 miR-224作为致癌的作为致癌的miRNA，通过以，通过以TNFAIP1 and SMAD4为靶点促进癌细胞的迁徙，增殖及侵袭为靶点促进癌细胞的迁徙，增殖及侵袭 TNFAIP1在在ADC及及SCC中明显下调，并且，中明显下调，并且， miR-224与与非小细胞肺癌中的非小细胞肺癌中的TNFAIP1水平呈明显负相关。水平呈明显负相关。 miR-224通通过以过以TNFAIP1为靶点，减弱

32、了由为靶点，减弱了由TNF介导的细胞生长抑制作介导的细胞生长抑制作用。用。DiscussionDiscussion第46页/共58页 SMAD4的缺失对的缺失对TGF-的信号活化起到重要作用，的信号活化起到重要作用，非小细胞肺癌的异常的非小细胞肺癌的异常的SMAD4表达机制尚未明确。在表达机制尚未明确。在非小细胞肺癌中，非小细胞肺癌中，SMAD4的缺失可能归因于的缺失可能归因于miR-224的异常表达。我们观察到，与正常组织相比，非小细胞的异常表达。我们观察到，与正常组织相比，非小细胞肺癌中的肺癌中的SMAD4呈现出下调，并且与呈现出下调，并且与miR-224呈明显呈明显负相关。肺癌细胞中，过

33、表达的负相关。肺癌细胞中，过表达的SMAD4明显减弱了明显减弱了miR-224介导的增殖和迁徙，且介导的增殖和迁徙，且miR-224通过抑制细胞通过抑制细胞核内的核内的SMAD4转录从而参与转录从而参与TGF-信号通路。信号通路。 综上，我们实验指出综上，我们实验指出miR-224介导介导的的TNFAIP1及及SMAD4减少是由于非小细减少是由于非小细胞肺癌的侵袭和过程。胞肺癌的侵袭和过程。DiscussionDiscussion第47页/共58页 miR-224的启动子区域有的启动子区域有CpG岛，岛，我们假设我们假设miR-224的表达可能涉及启动子的表达可能涉及启动子甲基化。为了验证，我

34、们采用了甲基化。为了验证，我们采用了MS-HRM分析及重硫酸盐序列方法，在正常肺组织分析及重硫酸盐序列方法，在正常肺组织中发现了甲基化，而在两个肺癌细胞系中中发现了甲基化，而在两个肺癌细胞系中并未发现。探针并未发现。探针cg27049053在肺鳞癌及在肺鳞癌及肺腺癌中的甲基化与肺腺癌中的甲基化与miR-224呈明显负相呈明显负相关。此外，用关。此外，用5-aza-CdR治疗后的肺非正治疗后的肺非正常组织显著修复了常组织显著修复了miR-224表达。表达。miR-224的上调表达可能是由于的上调表达可能是由于miR-224启动子的甲基化启动子的甲基化DiscussionDiscussion第48页/共58页 KRAS基因在肺鳞癌中很常见，为验证基因在肺鳞癌中很常见，为验证ERK信号通信号通路的活化状态是否与路的活化状态是否与miR-224的表达增加有关，我们通的表达增加有关，我们通过萤光素酶报告发现由过萤光素酶报告发现由miR-224启动子载体诱发的活化启动子载体诱发的活化ERK信号通路的荧光信号增强。而敲除信号通路的荧光信号增强。而敲除c-Jun显著减少显著减少了了miR-224启动子载体的荧光信号。同样地，由启动子载体的荧光信号。同样地，由PMA活活化的化的ERK信号增加了信号增加了miR-224的表达。在敲除的表达。在敲除c-Jun肺肺癌细胞中也观察到了癌