扬州大学广陵学院高效液相色谱法

1、1第三章 高效液相色谱法High Performance Liquid ChromatographyHPLC23液相色谱仪4北京瑞利北京瑞利5 高效液相色谱是在高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率效率 和实现了和实现了自动化自动化 操作。操作。3 - 1概述6概述概述经典经典LC与与HPLC比较比较HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便特点：高压

2、、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便HPLC:7 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相固定相和流动相组成固定相和流动相组成。 液相色谱的固定相可以是液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定吸附剂、化学键合固定相、离子交换树脂或多孔性凝胶；相、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂流动相是各种溶剂。 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。离子交换作用或分子尺寸大小的

3、差异进行分离。 3 - 1概述一、液相色谱分离原理一、液相色谱分离原理8 液相色谱分离的实质是液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）样品分子（以下称溶质）与溶与溶剂剂（即流动相或洗脱液）（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的以及固定相分子间的作用作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 3 - 1概述9二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用液相色谱所用基本概念基本概念：保留值、塔板数、塔保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相液相色谱所用色谱所用基本理论

4、基本理论：塔板理论与速率方程也与气相塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。色谱基本一致。 但由于在液相色谱中以但由于在液相色谱中以液体液体代替气相色谱中的代替气相色谱中的气体气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件仪器设备和操作条件也与气相也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：主要有以下几方面：10 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、

5、分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析的有机物能用气相色谱分析； 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约离分析，大约占有机物的占有机物的 80%

6、。 二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较1.1.应用范围不同应用范围不同11 因为：因为： （1 1）气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，与样品分子）气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而而在液相在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素择性增加了一个因素。（2 2）液相色谱固定相类型多）液相色谱固定相类型多, ,如如离子交换色谱和排阻色谱等离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不能。作为分

7、析时选择余地大；而气相色谱并不能。 （3 3） 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择于色谱分离条件的选择. .二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较2.2.液相色谱能完成难度较高的分离工作液相色谱能完成难度较高的分离工作123. 由于液体的扩散系数比气体的小由于液体的扩散系数比气体的小105倍，因此，溶质倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。4. 液相色

8、谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，且回收是定量的，适合于大量制备适合于大量制备。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。充的。13 综上所述，高效液相色谱法具有综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高高柱效、高选择性、灵敏度高、分析速度快、重复性好、应选择性、灵敏度高、分析速度快、重复性好、应用范围广等优点。用范围广等优点。该法已成为

9、现代分析技术的重该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 3- 1概述143 3 2 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱仪一般可分为高效液相色谱仪一般可分为5 5个主要部分：个主要部分： 梯度淋洗系统梯度淋洗系统 高压输液系统高压输液系统 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 15高压输液系统，进样系统，分离系统和检测记录系统高压输液系统，进样系统，分离系统和检测记录系统16贮液器贮液器高压泵高压泵检测器检测器梯度淋梯度淋洗装

10、置洗装置色谱柱色谱柱压力表压力表进样器进样器馏分馏分收集器收集器 首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器的流动相将样品同时带入色谱柱进品时，流经进样器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。高压输液系统，高压输液系统，进样系统，分进样系统，分离系统和检测离系统和检测系统系统201

11、7 由于所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力由于所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。系统。 它是仪器最重要的部件：由它是仪器最重要的部件：由储液器、储液器、高压输液高压输液泵泵* * *、过滤器、压力脉动阻力器过滤器、压力脉动阻力器等组成。等组成。1.1.溶剂储液器溶剂储液器 （1）储液器：）储液器： 一般由玻璃、不锈钢或塑料制成，容一般由玻璃、不锈钢或塑料制成，容量为量为0.52 L，用来储存足够数量、符合要求的流，用来储存足够数量、符合要求的流动相。动相。一一.高压输液系统高压输液系统 3 32

12、2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪18（2）流动相脱气）流动相脱气l 流动相在使用前必须进行脱气处理，以除去溶解的流动相在使用前必须进行脱气处理，以除去溶解的气体，防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检气体，防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低产生气泡。可能影响基线，影测器时，因压力降低产生气泡。可能影响基线，影响分析。响分析。常用的脱气方法有如下几种：常用的脱气方法有如下几种：吹氦气脱气：吹氦气脱气：此法适用于所有溶剂，脱气效果好。此法适用于所有溶剂，脱气效果好。但国内氦气价格较贵，使用较少。但国内氦气价格较贵，使用较少。抽真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流抽真空脱

13、气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相。动相。此法适用于单一溶剂体系脱气此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂。对多元溶剂体系，先脱气再混合，以保证混合后的比例不变。体系，先脱气再混合，以保证混合后的比例不变。19（2）流动相脱气：）流动相脱气：超声波脱气：超声波脱气：将欲脱气的流动相放于超声波清将欲脱气的流动相放于超声波清洗器中，用超声波振荡洗器中，用超声波振荡1015min。使用方便，。使用方便，脱气效果差。脱气效果差。加热回流法：加热回流法：最彻底的脱气方法，脱气效果好。最彻底的脱气方法，脱气效果好。混合流动相不能用。混合流动相不能用。在线真空脱气法：在线真空脱气法：以上几种方法均为离

14、线脱气以上几种方法均为离线脱气法，现在使用的在线真空脱气装置，法，现在使用的在线真空脱气装置，适用于多适用于多元溶剂体系，元溶剂体系，脱气效果明显优于上述几种。脱气效果明显优于上述几种。20 高压输液泵是高压输液泵是将流动相以高压形式连将流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用由于液相色谱仪所用色谱柱径较细色谱柱径较细，所填固定相粒度很小所填固定相粒度很小，因此，对流动相的，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。谱柱

15、，就需要高压泵注入流动相。2.高压输液泵高压输液泵21l对高压输液泵的要求：对高压输液泵的要求：（1）流量稳定：）流量稳定：非常重要。因为流量的稳定性直非常重要。因为流量的稳定性直接与保留时间的准确性有关。接与保留时间的准确性有关。（2）输出流量范围宽：）输出流量范围宽：对内径对内径45mm的常规柱，的常规柱，最常用的流量范围为最常用的流量范围为0.52mL/min（3）有足够的输出压力：）有足够的输出压力：使使流动相能高速通过颗流动相能高速通过颗粒很细的色谱柱（粒很细的色谱柱（10m），通常其压力范围为：），通常其压力范围为：150450105 Pa（4）密封性好，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀。

16、）密封性好，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀。2.高压输液泵高压输液泵22 常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵恒流泵和恒压泵两种。两种。 恒流泵恒流泵特点是在一定操作条件下，特点是在一定操作条件下，输出流量保输出流量保持恒定持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵恒压泵是指能保持是指能保持输出压力恒定，输出压力恒定，但其流量则但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差。随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差。 它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍。使用较普遍。恒流泵分机械注射泵和恒流泵分机械注

17、射泵和机械往复泵机械往复泵* * *两种两种23机械往复泵机械往复泵： 马达驱动的偏心轮使柱塞在液缸内往复运动，在马达驱动的偏心轮使柱塞在液缸内往复运动，在进出口单向阀的配合下完成吸液和排液动作。进出口单向阀的配合下完成吸液和排液动作。242进样系统进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约（约5-30cm5-30cm），所以柱外展宽较突出。引起），所以柱外展宽较突出。引起柱外展宽因素主要包括柱外展宽因素主要包括进样系统、连接管道进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。及检测器中存在死体积。 进样系统是引起柱前展宽的主要因素，进样系统是引起柱前展宽的主要因素

18、，因此因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 25准备状态准备状态进样状态进样状态流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品出口样品出口样品入口样品入口流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品环样品环263 分离系统分离系统色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与柱管与固定相固定相两部分。故金属管用得较多。一般色谱柱长两部分。故金属管用得较多。一般色谱柱长5 530cm30cm，内径为，内径为4 45mm5mm。 一般在分离柱前备有一个一般在分离柱前备有一个前置柱前置柱，前置柱内填，前置柱内填充物和分离

19、柱完全一样，保护色谱柱，保证分离技充物和分离柱完全一样，保护色谱柱，保证分离技术的性能不受影响术的性能不受影响。27 对色谱柱的要求：柱效高，选择性对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速度快等。好，分析速度快等。 使用色谱柱注意事项：使用色谱柱注意事项：1. 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。防止堵塞。2. 加前置柱。加前置柱。3. 用后要保护好。用后要保护好。284检测系统检测系统 HPLC与与GC一样，要求一样，要求检测器灵敏度高，重现检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广

20、，线性范围宽等优点。用范围广，线性范围宽等优点。 HPLC检测器很多，一般按照用途分为两类：检测器很多，一般按照用途分为两类：通用型和选择性检测器。通用型和选择性检测器。通用型检测器：总体检测器通用型检测器：总体检测器，它对试样和洗脱液它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器示差折光，电导检测器等。等。选择性检测器：溶质性检测器，选择性检测器：溶质性检测器，它仅对被分离组它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器紫外、荧光、电化

21、学检测器等。等。29 HPLC中应用最广泛的检测器。中应用最广泛的检测器。它的原理基于待它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。比尔定律。高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1） 紫外光度检测器紫外光度检测器（UV） 优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于的变化不敏感，适用于梯度淋洗梯度淋洗，线性范围宽，线性范围宽，适用于痕量分析。适用于痕量分析。30高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1）

22、紫外光度检测器紫外光度检测器（UV） 缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。下无吸收。31光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器l 二极管阵列检测器是一种新型紫外吸收检测器，二极管阵列检测器是一种新型紫外吸收检测器，可同时进行可同时进行吸光度、时间和波长的三维检测吸光度、时间和波长的三维检测，通过计算机处理，画出三维立体山峰形状的图通过计算机处理，画出三维立体山峰形状的图形。形。32 l 示差折光示差折光检测器是一种通用型检测器。它的作检测器是一种通用型检测

23、器。它的作用原理是用原理是纯流动相与包含样品的流动相之间的纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，折射率不同，检测器把这种差值检测出来，给检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。出信号，信号的大小与样品含量成正比。l 纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵敏度越高。器灵敏度越高。 l 通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，敏感，不能用于梯度淋洗不能用于梯度淋洗。 （2）示差折光检测器示差折光检测

24、器33（3）荧光检测器荧光检测器l 荧光检测器是一种专用型检测器，具有高灵敏度荧光检测器是一种专用型检测器，具有高灵敏度和高选择性，检测灵敏度比紫外高和高选择性，检测灵敏度比紫外高100倍。应用倍。应用较多，仅次于紫外吸收。它用于能激发荧光的化较多，仅次于紫外吸收。它用于能激发荧光的化合物。合物。l 工作原理是：工作原理是：用紫外光照射某些化合物时它们可用紫外光照射某些化合物时它们可受激发发出荧光，测定发出的荧光即可定量。受激发发出荧光，测定发出的荧光即可定量。34 它包括它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置馏分收集以及数据处理等装置

25、。其中梯度淋洗装。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。 HPLC梯度淋洗与梯度淋洗与GC中的程序升温一样。中的程序升温一样。 对于某些复杂样品，组分的对于某些复杂样品，组分的k k范围很宽，用一范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。就是度淋洗。就是组成流动相的两种或两种以上不同的组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、溶剂按一定程序改变配比、极性、pHpH、离子强度、离子强度，通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因通过流动相极性的变化来改

26、变待分离样品的选择因子和子和t tR R，提高分离效果和分析速度。提高分离效果和分析速度。5、附属系统、附属系统35优点优点可提高分离度、缩短分离时间和提高分离精度可提高分离度、缩短分离时间和提高分离精度363-3高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相 一、固定相一、固定相 l固定相以承受高压能力来分类，可分为固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性刚性固体和硬胶固体和硬胶两大类。两大类。 刚性固体：刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受以二氧化硅为基质，可承受7.01081.0109Pa的高压。的高压。 硬胶：硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，

27、它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为可承受压力上限为3.5108Pa。 37二、流动相二、流动相 由于流动相是液体，它对组分有亲和力，并参由于流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。接影响组分的分离度。1.1.对流动相溶剂的要求：对流动相溶剂的要求： （1 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。和良好的选择性。 （2 2）溶剂要与检测器匹配）溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测对于紫外

28、吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。要长。 对于示差折光检测器，要求选择与组分折光率对于示差折光检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。38（3）高纯度）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生不稳，或产生“伪峰伪峰”。痕量杂质的存在，将使紫。痕量杂质的存在，将使紫外截止波长值增加外截止波长值增加50100 nm。（4）化学稳定性好

29、）化学稳定性好 不能选与样品发生反应或聚合不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。的溶剂。(5)低粘度低粘度 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。但粘度过低的溶剂也不宜采用，例戊烷、利于分离。但粘度过低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。响分离。 20392. 流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 流动相流动相在液相色谱中显得特别重要在液相色谱中显得特别重要显显著改变组分分离状况。流动相又称为：淋洗液，著改变组分分离状况。流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。洗脱剂。 流动相极

30、性流动相极性亲水性固定液常采用疏水性流亲水性固定液常采用疏水性流动相，非极性固定液选用极性流动相。动相，非极性固定液选用极性流动相。 403. 流动相的组成流动相的组成按组成不同可分为单组分和多组分；按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈、水。醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或

31、增加选择性，以改进分离或调调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。整出峰时间。41 根据分离机理不同，液相色谱可分为：根据分离机理不同，液相色谱可分为： 液固吸附色谱法液固吸附色谱法 液液分配色谱法液液分配色谱法 化合键合相色谱法化合键合相色谱法 * 离子交换色谱法离子交换色谱法 分子排阻色谱法分子排阻色谱法3-4高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择42一、液一固吸附色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)(LSAC)l液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂的表面存在吸附中心。定相，吸附剂的表面存在吸附中心。l液固

32、色谱实质是根据物质在固定相上的液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。吸附作用不同来进行分离的。 3-4高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择433-4高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择二、液一液分配色谱法（二、液一液分配色谱法（LLPC） 在液在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体液色谱中，流动相和固定相都是液体,它它适用于各种样品类型的分离和分析适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。非离子型的化合物。1分离

33、原理分离原理 液液分配色谱的分离原理是液液分配色谱的分离原理是根据物质在两种根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。配系数。使各种复杂组分分离。使各种复杂组分分离。 44 2、固定相、固定相 由于液液色谱中由于液液色谱中流动相流动相参与选择竞争，参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液最常用的强极性固定液，一氧二丙腈一氧二丙腈，极性的极性的聚乙二醇聚乙二醇，非极性的非极性的角鲨烷角

34、鲨烷等。等。453流动相流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互流动相尽可能不与固定相互溶，溶，而且而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为为正相分配色谱正相分配色谱和和反相分配色谱反相分配色谱*。 如果采用如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其它适用于极性化合物的分离。

35、其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 如果采用如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，它适用于非极性化合物的分离，其其流出顺序与正相色谱恰好相反。流出顺序与正相色谱恰好相反。 46三、化学键合相色谱法（CBPC） 采用采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。简称键合相色谱。 它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面。它代替了固定液的机械涂渍

36、，表面。它代替了固定液的机械涂渍，可以认为它的出现可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的。它是目前应用最广泛的一种固定相。一种固定相。 由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子分离容量因子k k值范围宽值范围宽的样的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。因此它适用于种类繁多样品的分离。471键合固定相类型键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，

37、几乎都用用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶硅胶。利用硅胶表面的硅醇基利用硅胶表面的硅醇基(Si(Si一一OH)OH)与有机分子可成与有机分子可成键键, ,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1 1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C C8 8和和C C1818）和苯）和苯基等基等（2 2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰基、醚和醇等。如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3 3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，如作为阴离子交换基团的胺基，季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等. .4

38、82反相键合相色谱法 此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如如硅胶一硅胶一C18H37、硅胶一苯基、硅胶一苯基等；流动相是采用极等；流动相是采用极性较强的溶剂，如性较强的溶剂，如甲醇甲醇水、乙腈一水、水和无机水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等。盐的缓冲溶液等。 它多用于分离多环芳烃等它多用于分离多环芳烃等弱极性弱极性化合物；化合物；若采若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；可用于分离极性化合物；若采用水和无机盐的缓冲若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易解离的样品

39、，如有机液为流动相，则可分离一些易解离的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。高，能获得无拖尾色谱峰的优点。 493. 正相键合相色谱法正相键合相色谱法 此法是以极性的有机基团，此法是以极性的有机基团，CN、NH2、双羟、双羟基等键合在硅胶表面作为固定相；而以非极性或基等键合在硅胶表面作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。合物。 这种色谱方法主要

40、用于这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。504. 离子性键合相色谱法 l 当硅胶为基质，化学键合各种离子交换当硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一基团，如一SO3H 、COOH等时，就等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与其分离原理与离子交换色谱类同。离子交换色谱类同。 51 以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱的最大优点是：键合相色谱

41、的最大优点是： 通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）各种类型化合物（非极性、极性和离子型）；由于；由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有约有8O8O的分的分离问题是用键合相色谱法解决离问题是用键合相色谱法解决。 此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。52 53四、离子交换色谱法（IEC

42、） l离子交换色谱法是利用不同待测离子对固离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。可测定定相亲和力的差别来实现分离的。可测定溶液中阳离子和阴离子。溶液中阳离子和阴离子。l凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。离子交换色谱法进行分离。l它不仅它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。广。 541离子交换原理离子交换原理RSO3-H+M+RSO3-

43、M+ H+阴离子交换：阴离子交换： RNR3+Cl-+ X-RNR3+X-+ Cl-阳离子交换：阳离子交换：一般形式：一般形式： R一一AB RBA55 2 2固定相固定相 作为固定相的离子交换剂，有阳离子和阴离子作为固定相的离子交换剂，有阳离子和阴离子之分。再根据官能团的解离度大小还有强弱之分之分。再根据官能团的解离度大小还有强弱之分563 3流动相流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是离子交换色谱法所用流动相大都是一一定离子强度的缓冲溶液。定离子强度的缓冲溶液。通过改变流动相通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和中盐离子的种类、浓度和pH值可控制值可控制k值，值，改变选择性。改变选择性。57五、凝胶色谱法（SEC）l 凝胶色谱法凝胶色谱法主要用于较大分子的分离，它是基于试主要用于较大分子的分离，它是基于试样分子的样分子的尺寸和形状不同尺寸和形状不同来实现分离的。来实现分离的。l 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级