在职研究生分子生物学部分课后思考题

1、基因组学与后基因组学说明人的基因组成或结构变化所引起的相关疾病。要求：1、特定某个基因名称、定位、大小及组成等基本特征。2、基因组成或结构变化的过程、结果和表型。细胞信号转导1、请叙述肝细胞对胰高血糖素或肾上腺素的反应过程。举胰高血糖素的例子：胰高血糖素与受体结合受体蛋白分子发生构象上变化受体与G蛋白s亚基结合亚基与GDP亲和力下降 与 GTP亲和力增加，GTP置换GDP-亚基变构，与、分离，同时与受体分离（G蛋白至功能状态）-活化的G蛋白与AC结合，激活之-AC催 化 ATP分解形成cAMP（第二信使）cAMP活 化cAMP依赖性蛋白激 酶A（PKA）使靶蛋白磷酸化-肝细胞糖原分解、糖异生、

2、减少对葡萄糖的利用。2、细胞膜在信号转导的过程中起到怎样的作用？细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换而影响其生物学功能，这一过程称为细胞信号转导，这是细胞对外界刺激做出应答反应的基本生物学方式。其中，水溶性信息分子如肽类激素、生长因子及某些脂溶性信息分子(如前列腺素)等，不能穿过细胞膜，需通过与膜表面的特殊受体相结合才能激活细胞内信息分子，经信号转导的级联反应将细胞外信息传递至胞浆或核内，调节靶细胞功能，这一过程称为跨膜信号转导。其过程包括：胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；通过胞内信号转导物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用传

3、递信号；信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答(如激活核内转录因子，调节基因表达)。脂溶性信息分子如类固醇激素和甲状腺素等能穿过细胞膜，与位于胞浆或核内的受体结合，激活的受体作为转录因子，改变靶基因的转录活性，从而诱发细胞特定的应答反应。细胞信号转导异常与疾病细胞信号转导异常：是指由于信号转导蛋白量或结构的改变，导致信号转导的过强或过弱，并由此引起细胞增殖、分化、凋亡或机能代谢的改变。受体的缺陷重症肌无力（myadstheniagravis）：􀂄患者体内产生了抗乙酰胆碱受体的抗体􀂄抗体与乙酰胆碱受体结合，封闭乙酰胆碱，并促使乙酰胆碱受体的分解𙦦

4、8;患者体内受体的数目明显减少􀂄通过乙酰胆碱受体进行的信号转导过程障碍，而出现病症。G蛋白功能异常􀂄霍乱：霍乱弧菌附于小肠粘膜进行繁殖而引起的急性腹泻􀂄霍乱弧菌产生的霍乱毒素，可与Gs的亚基结合􀂄亚基丧失了GTP酶活力，不能将GTP水解成GDP􀂄Gs处于不可逆激活状态,不断刺激AC生成cAMP,胞浆中的cAMP含量可增加至正常的100倍以上􀂄导致小肠上皮细胞膜蛋白构型改变，大量氯离子和水分子持续转运入肠腔，引起严重腹泻和脱水。肢端肥大症和巨人症􀂄垂体腺瘤：分泌生长激素（

5、GH）过多􀂄编码Gs的基因突变（3040%）：Gs的精氨酸201被半胱氨酸或组氨酸取代; 或谷氨酰胺227被精氨酸或亮氨酸取代􀂄突变抑制了GTP酶活性，使Gs处于持续激活状态，cAMP含量增多，垂体细胞生长和分泌功能活跃。先天性肾源性尿崩症(CNDI)遗传性疾病主要症状：肾脏集合管对抗利尿激素不起反应而致尿浓缩障碍，出现多饮、多尿和尿比重降低。患病的婴儿的肾脏缺乏产生终尿的能力，他们会遭受到严重的脱水。慢性的的脱水会引发智障碍、生长迟缓、甚至是死亡.1、试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件，及影响外源基因表达的因素。条件：编码区不含插入序列；（mRN

6、A-cDNA） 位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变； 含起始密码子、终止密码子； 转录出的mRNA必须有SD序列，调整SD序列与第一个AUG间的距离（因为会对转译效率有影响）； 产物比较稳定（如：融合蛋白、信号肽）； 选择系统偏好的简并密码。 影响因素：启动子的强弱（主要因素） 基因的剂量 RNA转译效率（SD互补、AUG-SD距离及序列、AUG前后核苷酸序列的适宜性） 密码子 表达产物的大小 产物的稳定性 2、蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类，请列举其中的一类，谈谈它的原理及应用。分类n溶解度差别：如：硫酸铵沉淀法 n分子大小不同：透析、超过滤、离心、凝胶过滤（分子筛

7、层析）n蛋白质分子带电性质不同：电泳、离子交换层析 n蛋白质吸附性质不同 ：根据蛋白质吸附性质不同的分离方法。原理：利用不同的蛋白质被吸附剂吸附的强弱不同，在洗脱中吸附弱的物质先被洗脱，吸附强的后被洗脱。吸附剂无机（活性炭、硅胶、氧化铝）有机（淀粉、聚酰胺凝胶、纤维素）。类型：吸附柱层析、吸附薄层层析。应用：可用于纯化生命物质、分离蛋白质亚基、浓缩溶液等。n蛋白质的特异性配体 3、以人GM-CSF为例，写出获得该基因工程重组蛋白纯品的流程。技术路线-表达载体的构建、 外源基因片段的分离-表达性重组体的构建-转化宿主菌-诱导表 达-表达产物的鉴定-表达产物的分离-对粒细胞作用的体内外实验。 引物

8、设计-表达载体 1.GM- CSF 全基因 PCR 扩增 提取正常人外周血粒细胞总 RNA，GM- CSF 全基因的获得，以该总 RNA 为模板，用宝生物公 司的 BeaBEST 反转录试剂盒进行反转录。以该反转录产物为模板，加入引物 P1，P2 进行 第一次 PCR。 GM- CSF 基因的获得以 GM- CSF 全基因经纯化的 PCR 产物为模板， 加入引物 P1， P2，再次 PCR GM- CSF 基因，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2.含肠激酶位点的 pThioHisA- - sTRAIL表达载体的构建 纯化后的 GM- CSF PCR 产物用 BamHI、EcoRI 双酶切。质粒 p

9、ThioHisA 用同样的酶双酶切， 胶回收酶切片段，T4 DNA 连接酶分别连接经双酶切的片段 GM- CSF 和质粒载体，转化宿主 菌 BL21，筛选阳性克隆。小提质粒，酶切鉴定重组子，并对重组子进行测序分析。 3. 诱导表达 GM- CSF 在大肠杆菌 BL21 中的诱导表达。3.0 mmol/LIPTG 诱导 6-8 h，表达达到高峰，经 薄层扫描目的蛋白约占菌体总蛋白的 39 左右。表达产物部分可溶，其余形成包涵体。融 合表达产物 SDS- PAGE 表观分子量为 32000 Dalton 左右（实际分子量为 35608.21Dalton）。 4.GM- CSF 融合蛋白的制备 工程

10、菌的培养： 挑取阳性克隆， 接种于 200mL 含 100 g/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37 培养过夜。然后以 10-20 的接种量扩大培养，IPTG 诱导。超声破碎菌体离心收获的菌体 按 0.2g/mL 重悬于 A 液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.2mol/L NaCl，5mmol/L 咪唑)，浴 中超声破碎。12,000rpm/min 离心 15min，分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE 分析目的蛋白 以可溶性还是以包涵体形式存在。 5.sTRAIL 融合蛋白的纯化 融合表达载体pThioHisA在硫氧还蛋白融和段带有组氨酸标签，用Ni2+固相化的

11、Chelating Sepharose Fast Flow填料进行亲和层析。将可溶性表达产物（超声破碎菌体的离心上清）与亲和柱结合，用2倍柱床体积以上的A液过柱，至基线平稳；用B液 (A液中加入咪唑至终浓度为50mmol/L) 梯度洗脱510个柱体积，用AKATA Explore进行检测，收集各洗脱峰。6.sTRAIL融合蛋白的肠激酶切割及纯化。7.sTRAIL融合蛋白及非融合蛋白的 Western Blot检测。RNAi的机制及应用基因表达的调控1、 什么是基因表达？试述基因表达的特点及其调控对生物体的重要性。基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序

12、中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。 特点：1）.组织特异性（tissue specificity）不同组织细胞中不仅表 达的基因数量不同，而且基因表达的强度和种类也各不相同；2）.阶段特异 性（stage specificity）细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况不同；3）. 与环境相适应 当周围的营养、湿度、酸度及个体条件变化时，生物体就要改 变自身的基因表达状况， 以调整体内执行和相应功能的蛋白质的种类、 数量， 从而改变自身的代谢活动度以适应环境。 对生物体的重要性：适应环境、维持生长、增殖和维持个体发育与分化。 生物的基因表达不是杂乱无章的，而是受

13、着精密精确调控的。生命的遗传信 息是生物生存所必须的，而且遗传信息的表达调控也是生命本质所在。2、 真核生物中，基因的表达受不同水平的调控，请列举其中三种。 A.转录前调控 ： 基因丢失； （原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物） 转录前调控，非洲爪蟾的卵母细胞中原有的 rRNA 基因约 500bp，卵裂期和 胚胎期需要大量的 rRNA ， 基因会大量复制 rRNA， 使拷贝数达到 200 万倍， 扩 增 约 4000 倍 。 基 因 扩 增 （ gene amplification ） 基 因 重 排 （ gene ； rearrangement） 。 DNA 的 甲 基 化 （ DN

14、A methylation ） 组 蛋 白 修 饰 （ Histone modification） B 转录水平的调控：转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的， 调控元件主要包括顺式作用元件和反式作用因子。 C 转录后调控：hnRNA 的选择性加工运输；mRNA 前体的选择性剪接 RNA 编辑； RNAi D.翻译调控：翻译因子的磷酸化调控；mRNA 稳定性调控 E.翻译后调控蛋白质修饰3、 为什么说转录起始的调控是基因表达调控的中心环节？因为基因表达是通过转录和翻译，将 DNA 上的遗传信息转变为 RNA 和蛋白质的过程，所以转 录是基因表达的第一步，尤其是转录起始阶段。转录起始受到严格

15、的控制，转录起始的重要元件是 启动子，它必须与 RNA 聚合酶准确地结合才有活性。此处，这个过程还将受到一系列转录因子的相 互作用，这些转录因子决定着靶因基因转录的速度和数量。因为是表达的初始阶段，可以避免那些 不需要的转录所造成的资源浪费。4、 例举说明DNA甲基化与肿瘤的关系。 通常 DNA 的正常甲基化与正常胚胎发育生长等有关，影响基因表达， 调节染色质结构，与 DNA 损伤和修复过程有密切的关系。还参与了 DNA 复制和包装及 DNA 片段的转移等。 肿瘤的甲基化状态改变包括基因组整 体甲基化水平降低、正常非甲基化 CpG 岛的高甲基化和维持甲基化模式酶 的调节失控。 DNA

16、 的甲基化修饰通过改变基因的表达， 参与了细胞的生长、 发育过程及 X 染色体失活等的调控。在细胞正常发育基因表达模式以及基 因组稳定性中起着至关重要的作用。一旦异常，在胚胎时期，基因组范围 的 DNA 甲基化模式异常会导致胚胎死亡。 而在成体中异常甲基化则意味着 疾病，告别是肿瘤的发生。癌基因甲基化被激活，抑癌基因高甲基化被沉 默。表观遗传学1、 简述CRISPR/Cas-9的基本原理及优点（与传统的基于同源重组的胚胎干细胞基因敲出相比较）。2、 为何在筛选靶基因敲除的胚胎干细胞时还需经历阴性筛选过程？简述更昔洛韦（Ganciclovir）在胚胎干细胞阴性筛选中的作用机制。细胞凋亡1、

17、60; 什么是细胞凋亡？2、   细胞凋亡有哪两条主要的途径？ 1、 原癌基因活化的机制。1） 点突变：放射线或化学致癌物引起的基因单个碱基改变。2）基因扩增：细胞通过增加基因拷贝数，使表达产物增多的过程。3）DNA重排：同一染色体上基因的重新排列组合。4）染色体异位：不同染色体断裂后重新连接不正确，如IgH基因转录活化部位和bcl2基因相连。5）病毒基因启动子及增强子的插入。2、 P53基因的作用机制。p53 的两大功能：使细胞在 G1 期停滞。当 DNA 损伤后，p53 首先诱导细胞进入 G1 期，抑制 细胞增殖，直至损伤的 DNA 修复。一旦 DNA 不能被修复，p5

18、3 就会活化那些诱导细胞凋亡的 基因转录，使细胞发生凋亡。 3、 肿瘤基因诊断的基本策略。4、 基因诊断的基本策略。1）、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因。这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。2）、检测与某种遗传标志连锁的致病基因。遗传连锁同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传-称连锁。染色体遗传连锁图用限制性内切酶酶切位点作遗传标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。定位性克隆根据遗传连锁图进行定位性克隆。比较正常和异常基因的差别，可找

19、出导致遗传病的分子缺陷。定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。3）、检测表型克隆基因。针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病）。表型克隆技术是将有关表型与基因结构结合，直接分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因进行克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因组寻找两者之间的差异序列。2、基因组错配筛选技术：寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷。5、 肿瘤基因治疗的基本策略。 抑癌基因导入癌细胞、癌基因失活或表达水平下调-阻断癌细胞繁殖。提高机体免疫力基因导入免疫系统-提

20、高免疫力。靶向治疗：（分子靶向治疗的靶点是针对肿瘤细胞的恶性表型分子，作用于促进肿瘤生长、存活的特异性细胞受体、信号传导等通道，新生血管形成和细胞周期的调节，实现抑制肿瘤细胞生长或促进凋亡的抗肿瘤作用。）6、 基因治疗的基本程序。方法：1、体外法（ex vivo): 将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经适当选择系统，将重组的受体细 胞回输患者体内，以改善症状。（普遍采用）2、体内法(in vivo): 直接将外源基因导入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞并转录、表达而发挥治疗作用。基本程序：选择目的基因-选择基因载体-选择靶细胞-基因转移-外源基因表达及检测-回输体内。 治疗基因的来源：

21、1）、野生型基因： -单基因缺陷遗传病基因-反义核酸封闭活化的原癌基因-转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤。2）、重组DNA和分子克隆技术，人工合成特异基因。 分类： 1）、病毒载体（反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）。优点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解， RNA病毒能整合到宿主染色体，表达水平高等。2）、非病毒载体 （裸DNA、脂质体）。优点： 大量生产，毒性小，低免疫性缺点：效率低。 基因治疗的受体细胞有：体细胞（骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞）、生殖细胞。 基因的导入方式有两种：间接体内疗法、直接体内疗法。 外源基因表达的检测：方法： （目的基因和标记基因的表达）原位

22、杂交、 Nouthern杂交、 RNA点杂交（检测mRNA的转录）；免疫组化染色（检测基因翻译出的蛋白质)。 将治疗性基因修饰的细胞通过不同方式回输入体内，以发挥治疗效果。线粒体1、 结合你的专业，论述线粒体与医学的关系。线粒体是营养物质最终彻底氧化分解的场所,线粒体还是合成嘧啶、血红素、铁硫簇等的场所,线粒体与细胞代谢、免疫、老化、凋亡、自噬等的信号途径密切相关。线粒体异常与遗 传异质的众多疾病相关联，累及各种器官系统，各个年龄段，几乎覆盖整个医学领域。线粒 体与自由基损伤、细胞死亡、衰老、代谢病、神经肌肉退行、心血管病、创伤、肿瘤、肥胖、 糖尿病等的关系已成为研究热点。线粒体失调与氧化损伤

23、、代谢病和老年病密切相关，天然 线粒体营养素和药物可有效发挥预防和治疗作用。 线粒体保留的少量细菌和病毒祖先成分对 抗生素敏感（如线粒体翻译对氨基糖甙类和四环素敏感）。线粒体与运动、营养和药物的更 多关系还有待深入研究。分子水平出现问题也能导致疾病， 线粒体与衰老有关。 2、 线粒体遗传有哪些特点？线粒体拥有独特的基因组及复制、 转录和翻译系统。 线粒体 DNA 是遗传系统极度简化的杰作。 仅 16.5kb 的人 mtDNA 仅编码 2 种 rRNA、 22 种 tRNA 和 13 种肽。 线粒体遗传特点： 半自主性、 高突变率、遗传密码特殊、母系遗传、遗传瓶颈、阈值效应、累加效应。线粒体拥有

24、特有的 DNA 聚合酶、RNA 聚合酶和核糖体。使用简化版遗传密码表，因类群而异，通常没有 1 度和 3 度简并密码子，有 4 个终止密码子。线粒体 DNA 是严格母系遗传。精子线粒体不能进入卵 子，即使偶尔进入，也会被降解。因此，动物体的 mtDNA 只来源于卵细胞。创伤愈合1、 简述创伤修复的基本过程及每个过程的标志性细胞行为学事件。1） 止血期：血管收缩和血凝块形成，血凝块含有大量的促炎症细胞因子和生长因子，为细胞迁移提供临时基架2） 炎症期：炎症是机体应对损伤最迅速、有效的原初反应，是保证组织正常修复和功能重建的关键，炎症细胞浸润至创伤区域（炎症期标志性特征）3） 增殖期：活化的巨噬细

25、胞吞噬、杀灭病原微生物、清除组织残骸、诱导中性粒细胞凋亡。巨噬细胞历经表型转变，成为修复型，分泌PDGF、TGF-、VEGF、FGF等大量生长因子。角化细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞迁移并增殖，血管新生，细胞外基质合成。表皮重建、肉芽组织（增殖期标志性特征）4） 重塑期：创伤激活的过程逐渐平息或停止；肉芽组织向正常结缔组织转变：细胞外基质成分改变，I型胶原蛋白取代III型胶原蛋白；创区的内皮细胞、巨噬细胞和肌成纤维细胞等不同类型的细胞经历程序性凋亡而逐渐消失；大量胶原纤维、细胞外基质蛋白组成的非细胞性疤痕组织修复创伤区域 2、简述TGF-受体的激活，及其下游经典信号通路的活化。TGF-信号传导通路是一个 包含众多成员的多功能细胞因子大家族,根据配体分子激活的不同的下游特异性通路可以分为TGF-/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS 两个亚家族通路。该信号通路的激活首先是TGF-s配体分子与受