蛋白质工程第四讲分离纯化与分析

1、第四讲第四讲 分离纯化与分析分离纯化与分析一、分离纯化是分析的重要过程：一、分离纯化是分析的重要过程：针对针对分析目的分析目的不同，对分析对象的不同，对分析对象的要求要求和采取的和采取的措施措施不同。不同。u若分析过程干扰很小，特异性很高，不需要对样品处理可直接测定。如：若分析过程干扰很小，特异性很高，不需要对样品处理可直接测定。如：抗原及其抗体检测，配体及其配基等。抗原及其抗体检测，配体及其配基等。u多数样品常常需要处理，才能满足检测的要求。如：蛋白质结构分析、多数样品常常需要处理，才能满足检测的要求。如：蛋白质结构分析、动力学（变复性）分析、酶学性质研究等，纯度要求很高、避免干扰分动力学（

2、变复性）分析、酶学性质研究等，纯度要求很高、避免干扰分析。析。为了为了保证分析保证分析的准确度，的准确度，避免避免检测体系中某些物质的检测体系中某些物质的干扰干扰，往往对样，往往对样品进行处理。品进行处理。二、分离分析的含义：二、分离分析的含义：1、分离过程本身可以是、分离过程本身可以是分析过程分析过程样品干扰严重，需通过分离再检查，样品干扰严重，需通过分离再检查，分离过程和分析过程耦合，分析性色谱技术（分离过程和分析过程耦合，分析性色谱技术（HPLC、TLC） 2、分离过程的分析、分离过程的分析优化纯化工艺优化纯化工艺分离过程管理：分离过程管理：定性分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等定性

3、分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等3、基本要求：、基本要求：客观、准确性，反映分析对象（目的物质）的真实性。客观、准确性，反映分析对象（目的物质）的真实性。4、分析方法要求：、分析方法要求：选择性（特异性）、精确度、灵敏度、重复性等选择性（特异性）、精确度、灵敏度、重复性等第一节第一节 概述概述三、如何理解分离纯化与分析（三个层次）三、如何理解分离纯化与分析（三个层次）物质的分析离不开分离：物质的分析离不开分离：分析要求样品的纯度：对样品进行分离纯化：如蛋白质、核酸等结构与分析要求样品的纯度：对样品进行分离纯化：如蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析；功能关系的分析；物质分离纯化过程离不开分

4、析检测：物质分离纯化过程离不开分析检测：分离组分的收集、纯度、含量和组分分析；即分离过程管理。分离组分的收集、纯度、含量和组分分析；即分离过程管理。分离纯化过程即是分析检测过程：分离纯化过程即是分析检测过程：电泳、电泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄层层析、薄层层析(TLC)等；等；l分析是对事物的感知，是眼睛、是手段分析是对事物的感知，是眼睛、是手段一、概述一、概述1、一般、一般原理：原理：依据分离对象（物质）的溶解度、大小在相态中的分配等特性对物质进行依据分离对象（物质）的溶解度、大小在相态中的分配等特性对物质进行分离纯化。分离纯化。2、基本程序：基本程序：样品处理、粗分和精分（例如：蛋白

5、质的分离纯化）样品处理、粗分和精分（例如：蛋白质的分离纯化）3、分类：分类：l初级分离：初级分离：沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等l精制纯化：精制纯化：吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析第二节第二节 分离与纯化分离与纯化二、初级分离二、初级分离（要求：灵活运用要求：灵活运用）l 目的目的分离对象（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。分离对象（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。l 方法及原理：方法及原理：1、沉淀分级分离、沉淀分级分离：盐析分级：盐析分级：中性盐（中

6、性盐（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白质类等等），例如蛋白酶等蛋白质类等电点分级：等电点分级：有机溶剂：有机溶剂：热沉淀：热沉淀：其它：其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、三氯乙酸、PEG、重金属等、重金属等 联合使用：联合使用：盐析盐析等电点等电点盐析原理示意图盐析原理示意图2、膜分离：膜分离： 膜分离方法及原理：透析，微滤，纳滤，超滤，反渗透，电渗析膜分离方法及原理：透析，微滤，纳滤，超滤，反渗透，电渗析 膜材料和特性：膜材料和特性： 有机膜：有机膜：（醋酸纤维素、硝基纤维素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等）（醋酸纤维素、硝基

7、纤维素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等） 陶瓷膜：陶瓷膜：陶瓷材料陶瓷材料 膜组件：膜组件：管式膜组件，平板式膜组件，螺旋卷式膜组件，中空纤维（毛细管）等管式膜组件，平板式膜组件，螺旋卷式膜组件，中空纤维（毛细管）等 应用：应用：菌体分离，小分子产物分离和回收，蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等，菌体分离，小分子产物分离和回收，蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等，膜生物反应器。膜生物反应器。3、萃取：、萃取：4、离心：、离心： 分类：分类：低速离心、高速离心、超速离心低速离心、高速离心、超速离心 分离方式：分离方式：差速离心、浮力密度离心（连续梯度、非连续梯度）差速离心、浮力密度离心（连续梯度、

8、非连续梯度）5、其它：、其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、PEG、重金属等、重金属等6、联用方法、联用方法：膜过滤膜过滤-盐析盐析等电点，离心等电点，离心萃取，离心萃取，离心-盐析盐析等电点等等等电点等等B：精制分离：精制分离色谱分离：色谱分离：（A）精制过程，纯度较高）精制过程，纯度较高（B）方法和原理：流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快，流动相为）方法和原理：流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快，流动相为平推流。平推流。（1）：吸附：吸附解吸附平衡，固定相（吸附剂）解吸附平衡，固定相（吸附剂）流动相（洗脱剂）流动相（洗脱

9、剂）分配系数不同和分配平衡。吸附分配系数不同和分配平衡。吸附解吸附解吸附再吸附的连续过程（固相和流动再吸附的连续过程（固相和流动相之间连续分配的过程）相之间连续分配的过程）l 吸附剂：吸附剂的吸附剂：吸附剂的选择选择，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。成本低廉。l 吸附剂的选择：根据吸附剂的选择：根据吸附剂性质吸附剂性质和被和被分离对象分离对象的性质选择。的性质选择。极性强极性强的吸附剂的吸附剂易吸附极性强的物质，易吸附极性强的物质，非极性强非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于便于解吸

10、附解吸附，对于，对于极性大极性大的分离对象，选择的分离对象，选择极性小极性小的吸附剂，反之亦然。吸附剂的吸附剂，反之亦然。吸附剂的选择的选择依靠经验依靠经验和和多次试验多次试验。吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等 柱层析：羟基磷灰石，柱层析：羟基磷灰石，Ca3(PO4)3OH2，HA，酸性蛋白质、酶、核酸、，酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶：含病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。皂苷类、类脂和色素等等。 薄层层析：例如，薄层层析：例如，硅胶硅胶薄层层

11、析和薄层层析和聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜薄层层析薄层层析l 硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶硅胶H（纯硅胶），能用（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂腐蚀性强的显色剂；硅胶硅胶G（10%-15%煅石膏和煅石膏和5%淀粉的硅胶）；淀粉的硅胶）；硅胶硅胶CMC（含羧甲基纤（含羧甲基纤维素）；硅胶维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶含荧光剂的硅胶H)，l 硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化测定（约测定（约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯做苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样

12、，苯做展层剂，展层剂，Rf大小苏丹黄大小苏丹黄苏丹红苏丹红.靛酚蓝，苏丹黄靛酚蓝，苏丹黄Rf）0.5，苏丹红和靛酚，苏丹红和靛酚蓝蓝Rf之差在之差在0.10.2)。l 分析程序：点样，展层，显色。分析程序：点样，展层，显色。TLC 色素指纹图谱和灰度分析色素指纹图谱和灰度分析 图图4 TLC色素指纹图谱的图像色素指纹图谱的图像灰度灰度分析曲线分析曲线Fig. 4 Intensity curve of pigment fingerprintings on TLC图图3色素的色素的TLC指纹图谱指纹图谱Fig. 3 Profile of pigments fingerprints on TLCa,

13、 Once Developing Method. b, Repeated Developing Method T1T11T11T1-4T10T9T8T7T6T5a b 重复展层法：展层剂重复展层法：展层剂1为石油醚、正己烷、异丙醇、丙酮和甲醇比例为石油醚、正己烷、异丙醇、丙酮和甲醇比例=8-10：0.75-0.95：0.2-0.30：0.8-1.0：0.25-0.35 ；展层剂；展层剂2为石油醚：正己烷：异丙醇：丙酮，比例为为石油醚：正己烷：异丙醇：丙酮，比例为10：0.95：0.22-0.25：0.38-0.41 。重复展层法呈现的重复展层法呈现的TLC指纹图谱能将指纹图谱能将CQV97菌株

14、全色素分辨成菌株全色素分辨成11条不同颜色条带的色条不同颜色条带的色素组分，从下而上依次为黄绿色、蓝绿、深蓝绿、绿色、紫色、黄色、黄色、紫色、素组分，从下而上依次为黄绿色、蓝绿、深蓝绿、绿色、紫色、黄色、黄色、紫色、红色、红棕色和橙黄色红色、红棕色和橙黄色 l 聚酰胺薄膜薄层层析：聚酰胺薄膜薄层层析：DNS氨基酸分析，氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度灵敏度10-910-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下和氨基酸或多肽在特定条件下反应。反应。DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。Edman降解试剂

15、降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯二甲氨基偶氮苯-4-异硫氰异硫氰酸酯）进行微量蛋白质序列分析（酸酯）进行微量蛋白质序列分析（210 nmol肽样品）。肽样品）。单向纸层析单向纸层析 双向纸层析双向纸层析 薄层层析薄层层析（2）凝胶过滤：排阻色谱或分子筛层析，根据分子颗粒大小进行分离）凝胶过滤：排阻色谱或分子筛层析，根据分子颗粒大小进行分离 原理：分子在筛孔中自由扩散、渗透，由于分子在筛孔中的原理：分子在筛孔中自由扩散、渗透，由于分子在筛孔中的分配系数分配系数不同不同，将分子分离。排阻的范围为，将分子分离。排阻的范围为0100%。 分配系数：分离化合物在内水和外水体积中的比例关系

16、。分配系数：分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo) Vt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和和Vg分别为床体积、外水体积、内水体分别为床体积、外水体积、内水体积和介质的体积。积和介质的体积。 分离物质的大小，分离物质的大小，0 Kav 1， Kav=0或或Kav=1，不能分离不能分离。常用介质：常用介质：交联交联葡聚糖葡聚糖（Sephadex G10G200）；）； Amersham Biosciences交联交联琼脂糖琼脂糖（Sepharose CL-4B,CL-6B）Sephacryl S 系列（聚丙烯酰胺系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）葡聚糖）Supe

17、rdex 系列系列 （高交联琼脂糖（高交联琼脂糖-葡聚糖）葡聚糖）Bio-Beads S-X系列系列 （苯乙烯（苯乙烯-二乙烯苯）二乙烯苯）Bio-Gel P系列系列 （聚丙烯酰胺）（聚丙烯酰胺） Bio-RadBio-Gel A系列系列 （琼脂糖）（琼脂糖）TSKgel SW 系列系列 （硅胶）（硅胶）TSKgel Toyopearl HW 系列，亲水性聚乙烯醇系列，亲水性聚乙烯醇 Toyo Soda TSKgel PW 系列系列 亲水性聚乙烯亲水性聚乙烯TSKgel CW-35 纤维素纤维素Cellulofine 纤维素纤维素 Chisso操作程序：操作程序： 凝胶选择和处理（型号和粒度、

18、凝胶用量、凝胶处理）凝胶选择和处理（型号和粒度、凝胶用量、凝胶处理） 凝胶柱的制备（柱选择，径长比约为凝胶柱的制备（柱选择，径长比约为1:251:100，装柱、柱鉴定），装柱、柱鉴定）， 加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测）加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测） 凝胶柱的再生和保存凝胶柱的再生和保存应用：应用： 分离纯化，脱盐和浓缩，去热源物质、分析检测分离纯化，脱盐和浓缩，去热源物质、分析检测 （定性、定量、分子量）。（定性、定量、分子量）。（3）离子交换：）离子交换：电荷大小电荷大小阳离子交换剂：，羧甲基（阳离子交换剂：，羧甲基（-O-CH2-COO-）阴离子交换剂：氨基乙级（阴离子

19、交换剂：氨基乙级（-O(CH2)2-NH3+）常用介质常用介质DEAE（二乙胺基以及）（二乙胺基以及）Cellulose DE-23 DEAECellulose DE-52DEAE- Sephadex A-50（25）DEAE-Sepharos CL-6bDEAE-Bio-Gel A CM- Cellulose DE-52CM- Cellulose DE-32CM- Sephadex C-25(50)洗脱方式，梯度洗脱，线性和非线性洗脱洗脱方式，梯度洗脱，线性和非线性洗脱应用：物质分离、测定等电点（应用：物质分离、测定等电点（PI）0100200300400500600700800900100

20、0110012003004005006007008009001000020406080100Absorbance(mAU)Retention (ml) A280 A380 A480 CNaCl(10-2mol/L) CondPeak1 Peak2Peak 3 4Peak 5 6 7Peak8Peak9分离纯化洗脱曲线和紫外吸收光谱分离纯化洗脱曲线和紫外吸收光谱图3. A菌80%盐析浮质DEAE-52层析洗脱曲线图4. A菌不同盐浓度洗脱组分吸收光谱（a、b、c）。 注：a、b、c中7个峰分别对应不同NaCl浓度，：峰3、4为0.050.10M洗脱组分，峰5、6、7为0.10.15M洗脱组分，峰

21、8为0.150.2M洗脱组分，峰9为0.200.30M洗脱峰。峰8稀释6倍。3004005006007008009000.00.20.40.6AbsorbanceWavelength/nm Peak 5 Peak 6 Peak 7 b3004005006007008009000.00.20.40.60.81.01.21.4AbsorbanceWavelength/nm Peak 8 Peak 9 c3004005006007008009000.00.10.20.30.4AbsorbanceWavelength/nm Peak 3 Peak 4 a020406080020406080100120

22、0246810Absorbance（mAU）Retention (ml) A280 A380 A480 Cond（mS/cm） Condabcdeb Retention time 47.78min Retention volume 38.167mL Flow 0.8mL/min02040608010012002060801001201401600246810Absorbance（mAU）Retention (ml) A280 A380 A480abc Cond（mS/cm） conda Retention time 73.86min Retention volume 36.916mL Flow

23、 0.5mL/min 02040608010012002040601001502002503003500246810Absorbance(mAU)Retention (ml) A280 A380 A480aba Retention time 74.30min Retention volume 37.146mL Flow 0.5mL/min cond Cond（mS/cm） 图7、8、9. 分别为A菌Peak34、Peak7和Peak8组份分子筛层析结果。图7图8图9注：图均为280nm、380nm和480nm检测波长下的洗脱曲线，此外图中绿线代表盐浓度；图7中b为主要目标蛋白，图8中a为主要目

24、标蛋白，图9中a为主要目标蛋白；图中标注各主要目标蛋白洗脱时间和洗脱体积，以及洗脱流速。A菌菌（4）疏水性相互作用色谱，利用）疏水性相互作用色谱，利用疏水作用疏水作用不同将蛋白质等不同将蛋白质等大分子分离，大分子分离， 利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水吸附剂疏水吸附剂为为固定固定相相，蛋白质等大分子与，蛋白质等大分子与疏水吸附剂疏水吸附剂之间弱疏水作用的差异进行物之间弱疏水作用的差异进行物质的分离。质的分离。 疏水吸附材料疏水吸附材料，含有苯基、辛基、丁基、醚基的吸附材料，含有苯基、辛基、丁基、醚基的吸附材料 高盐溶液中吸附能力强，降低盐度将

25、物质洗脱分离。高盐溶液中吸附能力强，降低盐度将物质洗脱分离。 成本高，实验室规模分离成本高，实验室规模分离（5）反向色谱：）反向色谱： 利用表面利用表面非极性非极性的的介质介质为为固定相固定相，极性极性有机溶剂的水溶液为有机溶剂的水溶液为流动相流动相，或极性有机溶剂（甲醇、乙腈等），进行物质分离的方法。特点是固或极性有机溶剂（甲醇、乙腈等），进行物质分离的方法。特点是固定相表面完全被非极性基团覆盖，具有强的疏水性。定相表面完全被非极性基团覆盖，具有强的疏水性。 介质：以硅胶为载体，经硅烷化连接介质：以硅胶为载体，经硅烷化连接C4、C8、C18烷基或苯基，常烷基或苯基，常用用C18硅烷化硅烷化

26、类别：类别：制备型色谱制备型色谱和和分析型色谱分析型色谱，应用：物质的分离和检测（定性和，应用：物质的分离和检测（定性和定量分析）定量分析）10203040500100200H10H11H9H8H7H6H5H4H3H2 Absorbance / mAURetention time / minH1反向反向C18层析柱层析柱液相色谱仪层析示意图样品：沼泽红假单胞菌（6）亲和层析）亲和层析 固定相：特异性吸附材料，如酶抑制剂、抗原固定相：特异性吸附材料，如酶抑制剂、抗原抗体、抗体、A蛋白、蛋白、配体配体配基、过渡金属离子（配基、过渡金属离子（Cu、Ni、Zn、Co等离子）与等离子）与O、S、N等等供

27、电子基团供电子基团形成形成配位键配位键。与蛋白质表面。与蛋白质表面组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基、半半胱氨酸的巯基胱氨酸的巯基、色氨酸的、色氨酸的吲哚基吲哚基发生亲和作用。如发生亲和作用。如Ni柱柱分离带有分离带有组氨酸标签的工程蛋白。组氨酸标签的工程蛋白。 程序：选择凝胶、专一性合成、分析鉴定、装柱上样、吸附、清程序：选择凝胶、专一性合成、分析鉴定、装柱上样、吸附、清洗、解析，柱再生洗、解析，柱再生 解析剂：低解析剂：低pH 、高盐、竞争性洗脱剂、高盐、竞争性洗脱剂、盐酸胍盐酸胍 尿素尿素等变性剂，等变性剂， 再生：再生：高浓度盐高浓度盐 应用：物质分离、测定活性应用：物质分离、测定活性四、分

28、离纯度的鉴定方法四、分离纯度的鉴定方法电泳、色谱（薄层色谱、凝胶色谱）、电泳、色谱（薄层色谱、凝胶色谱）、质谱、结晶、质谱、结晶、N-分析、熔点等分析、熔点等五、分离过程的控制及检测五、分离过程的控制及检测1、纯化方案的设计、纯化方案的设计（1）目的：从原材料中提取纯化）目的：从原材料中提取纯化目的成分目的成分（分离对象），设计方案，指导分离（分离对象），设计方案，指导分离过程。过程。（2）依据：）依据：分离对象分离对象的性质和特点（溶解度、电荷、分子大小、与配体亲和力的性质和特点（溶解度、电荷、分子大小、与配体亲和力等），结合等），结合分离纯化方法分离纯化方法的特点，对分离方法进行比较分析，

29、选择出的特点，对分离方法进行比较分析，选择出一种或一种或几种方法的组合几种方法的组合。（3）原则：）原则： 各种分离方法各有特色，操作程序简繁不一；各种分离方法各有特色，操作程序简繁不一； 考虑分离对象的特性和结构以及取材的特点，考虑分离对象的特性和结构以及取材的特点， 深入了解各种分离方法的原理和用途，合理、巧妙地设计纯化方案，深入了解各种分离方法的原理和用途，合理、巧妙地设计纯化方案， 纯化方案中，忌讳一种分离方法重复使用，纯化效率不高，反而降低回收率。纯化方案中，忌讳一种分离方法重复使用，纯化效率不高，反而降低回收率。 分离方案不是僵化的，在实验中，对方案及所选方法进行不断修正、调节、完善。分离方案不是僵化的，在实验中，对方案及所选方法进行不断修正、调节、完善。（4）分离方法的测试）分离方法的测试分离过程检测分离过程检测 定向分离、靶向分离定向分离、靶向分离都离不开分离对象的都离不开分离对象的检测与分析检测与分析2、纯化方法的评价、纯化方法的评价理论分析的局限性：理论分析的局限性：只有通过实验检验；获得提取工艺只有通过实验检验；获得提取工艺评价方法：评价方法：对分离过程的每一步收集对分离过程的每一步收集留份（洗脱留份）留份（洗脱留份）进行分析检测；进行分析检测；测定指标：测定指标：测定测定2个：测定含量和活性