微生物常规鉴定技术――生理生化试验3

1、微生物常规鉴定技术一生理生化试验录入时|'h：2010-1 1-12 9:48:24來源：青岛海博微生物生化反应是指用化学反应來测定微生物的代谢产物，生化反应常用來鉴别一些在形 态和其它方面不易区别的微牛物。因此微牛物牛化反应是微牛物分类鉴定中的亜要依据 微生物检验中常用的生化反应有：1、糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气 或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，川接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管， 若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°c培养，每天观察结

2、果，检 视培养棊颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培 养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动 力、培养物可呈弥散生长。木试验主要是检杏细菌对各种糖、醇和糖井等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别， 因而每次试验，常需同时接种多管。一般常丿ij的指示剂为酚红、漠甲酚紫，漠白里蓝和aivdrade 指示剂。2、淀粉水解试验某些细菌可以产牛分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或衙萄糖。淀粉水解后，遇碘不 再变蓝色。试验方法：以1824h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜而或平板（一个平板可分区接 种，试验数种培养物）或直接移种丁

3、漩粉肉汤中，于36±1弋培养2448h,或于20。培养5天。 然后将碘试剂直接滴浸于培养表血，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视 结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明坏、 或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酚的能力、培养时间，培养 基含有淀粉量和ph等均有一定关系。培养基ph必须为屮性或微酸性，以ph7.2最适。淀粉 琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临川时制备为妥。3、v-p试验某些细菌在葡萄糖蛋白j东水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱竣成乙 酰甲

4、基甲醇，后者在强碱环境卞，被空气屮氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋口腺屮的弧基生成 红色化合物，称v-p （ + ）反应。试验方法：1 ）0 meara氏法:将试验菌接种于通用培养基，于36±1°c培养48h,培养液lml加o meara 试剂（加有0.3%肌酸creatine或肌酸st creatinine的40%氢氧化钠水溶液）iml,摇动试管 l2min,静置于室温或36±1°c恒温箱，若4h内不呈现伊纟：、即判定为阴性。亦有主张在4850°c 水浴放置2h后判定结果者。2 ） barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1

5、°c培养4天、培养液2.5ml先加入 5°ca酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml,摇动25min,阳 性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°c恒温箱，如2h内仍不显现红色、 可判定为阴性。3 ）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管屮、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物 一接种坏，乳化接种于其中，加入5%-蔡酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min, 判定结果。不产酸的培养物不能使用。本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通 川培养基中的

6、磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。4、甲基红（methyl red）试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产牛丙酮酸，进一步分解中，rti 于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醴酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基ph 值下降至ph4.5以下，使甲基红指示剂变红。试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养j:36±1°c或30七（以 3（tc较好）35天,从第二天起,每日取培养液lml,加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色, 弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，ph范

7、鬧为4.46.0,其pk值为5.0。故在ph5.0以下，随酸度而增 强黄色，在ph5.0以上，则随碱度而增强黄色，在ph5.0或上下接近时，可能变色不够明显， 此时应延长培养时间，重复试验。5、靛基质（imdole）试验某些细菌能分解蛋白腺中的色氨酸，生成财喙。眄卩朵的存在可用显色反应表现出来。ii引 味与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰忧味，为红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1c培养24h时后，取约2ml 培养液，加入kovacs氏试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙讎或二甲苯， 摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表血后，再沿试

8、管壁徐缓加入kovacs氏试剂 数滴，在接触血呈红色，即为阳性。实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作丿|而产生阳性反应，若先川二甲苯或 乙醯等进行提取，再加试剂，则只有靛棊质或5-甲棊靛基质在溶剂屮呈现红色，因而结果更 为可靠。6、硝酸盐（nilralc）还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐 的存在可用硝酸试剂检验。试验方法：临试前将试剂的a （磺胺酸冰酷酸溶液）和b（a蔡胺乙醇溶液）试液各0.2ml 等量混合、取混合试剂约0.1 ml.加丁液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或tlomin内 呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性

9、。用一蔡胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须 有未接种的培养基管作为阴性对照。ct蔡胺具有致癌性、故使用吋应加注意。7、明胶（gelatin）液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋口水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨 基酸，失去凝胶性质而液化。试验方法：挑取1824h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于 平板培养棊。于2022°c培养714天。明胶高层亦可培养于36±1cco每天观察结杲，若因培养 温度阳而使明胶木身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化, 如确被液化，即为试验阳性

10、。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂， 若为阳性，1020min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。8、尿素酶（urease）试验有些细菌能产牛尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉 红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿索是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适ph 为 7.0。试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量接种于液体培养基管小，摇均，于36±1°c培养10、60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜而，不要到达底部，留底部作 变色对照。培养2, 4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终

11、判定，变为粉红 色为阳性。9、氧化酶（oxidase）试验氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色 素c氧化，然后此氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂12滴，阳性者kovacs氏 试剂呈粉红色深紫色，ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试 验结果。1（）、硫化氢（h?s）试验有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐 或低铁盐可生成黑色沉淀物。试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36± 1

12、76;c培养 2428h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种 于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置 36±1°c培养16天。纸条变黑为阳性。11、三糖铁（tsi）琼脂试验试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜血，置36±1°c 培养1824h,观察结果。本试验町同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄 糖被分解产酸可使斜血先变黄，但因量少，牛成的少暈酸，因接触空气而氧化，加z细菌利 用培养棊中含氮物质，生成碱性产物，故使斜而后来乂变红，底部由于是在厌氧状态下，酸 类不被氧化，所以仍保持黄色。12、硫化氢靛基质动力（sim