小鼠淋巴细胞自发凋亡形态的鉴定

1、小鼠淋巴细胞自发凋亡形态的鉴定实验原理：以小鼠淋巴细胞为研究对象，建立一种在光学显微镜下快速而特异识 别凋亡淋巴细胞的染色方法，为淋巴细胞凋亡的研究提供一种简便易行的 实验方法。收集小鼠了淋巴细胞制成绷胞涂片，晾干，滴加瑞氏染液染lmin, 再于瑞氏染液上加等量的pbs,混匀，染l2min,水洗晾干后用中性树 胶封片，镜检。实验设立实验组（经体外培养的淋巴细胞）和对照组（未经体 外培养的新鲜淋巴细胞），动态观察体外淋巴细胞自发凋亡情况。实验组可 见不同程度的细胞凋亡，光镜下细胞呈典型凋亡特征改变：凋亡早期细胞 形态不规则，体积变大，然后核染色质边聚、浓缩、细胞核固缩呈半球形、 环形、月牙形等，

2、继而细胞裂解成细胞纸膜包绕的核碎片，即形成凋亡小 体，凋亡细胞体积缩小，而对照组的凋亡细胞偶见。实验材料和方法6-8周龄的小鼠；rmpi1640培养基：rpmi-1640细胞培养基成分（配制时添加碳酸氢钠2000mg/l）小鼠淋巴细胞分离液（比密：1.0875）； co2培养箱；光学显微镜； 高速离心机；瑞氏染液：o.lg瑞氏粉溶于60ml甲醇溶液中；磷酸盐缓冲液：kh2po4 6.63g,na2hpo4 12h20 6.45g 溶于 1000ml 蒸 馆水中。实验步骤： 一、小鼠淋巴细胞的分离与培养取小鼠2只，引颈处死，置于75%酒精浸泡后，无菌条件下取出脾脏， 过200冃不锈钢网制成单个细

3、胞悬浮液，用小鼠淋巴细胞分离液分离后, 用含有10%fcs的1640培养液将细胞浓度调整为1x109/l、2x109/l、4 x109/l,经0.2%台盼兰拒染法证实活细胞数>95%,然后接种于12孔 细胞培养板，每孔iml,再将培养板放入37°c, 5%co2培养箱中培养，分 别于24、48、72、96、120h取出，同时台盼兰拒染法检测细胞活率。二.对照实验分离小鼠的新鲜淋巴细胞，直接涂片，染色。三瑞氏染色方法检测细胞凋亡搜集培养的细胞，用ph=6.8d的pbs洗涤一次，弃上清液，取出沉淀 细胞50ul制成细胞涂片，晾干后滴加瑞氏染液35滴，染bin,再于瑞 氏染液

4、上滴加等量的pbs液，充分混匀染l-2min,水洗，晾干，用中性树 胶封片，光镜观察至少5个视野，观察淋巴细胞结构的改变，并计数200 个细胞，计算凋亡细胞百分率。同吋，用相机对细胞进行拍摄。结果：正常淋巴细胞光镜形态的观察未经培养的小鼠新鲜淋巴细胞形态呈圆形或椭圆形，胞质很少，细胞 核大，圆形或椭圆形，染深蓝色或紫蓝色，核染色质较致密，分布均匀（图l）o凋亡淋融细胞光镜形态的观察经体外培养的小鼠淋巴细胞可出现自发性强亡，最主要的变化是细胞核染色质浓缩、固缩，并聚集在细胞边缘，随着培养时间延长，凋亡细胞 所处的时间段不同可出现不同形态的细胞。凋亡早期，细胞表面伸出长短 不一的突起，使细胞形态变

5、得极不规则（图2）；继而，核内染色质逐渐向细 胞边缘移动，光镜下可见不同形态的细胞核改变，有些细胞核固缩呈半月 形染蓝色，细胞质明显增多染淡蓝色（图3）；有些细胞核染色质紧贴细胞边 缘排列呈环行染深蓝色，而细胞核屮央由于染色质的边聚，染色明显偏淡 （图4）；或细胞核聚集在细胞的一侧边缘呈月牙形染蓝色，胞质染淡蓝色（图5）；凋亡晚期，边聚的细胞核裂解成块状或条索状染深蓝色，附着 在细胞周边，胞体中央淡染（图6）；或裂解的细胞核经细胞膜“出芽”或 “发泡”的形式，形成具有完整膜性结构圆形或椭圆形的凋亡小体，环绕 在母体细胞周边染深蓝色，细胞中央染灰蓝色或淡蓝色<图刀；细胞呈椭圆形或圆形细胞表面长出长短不一的突起，细胞呈半月形细胞质少细胞形态不规则（wright染色）（wright 染色）图1 正常小鼠淋巴细胞图2凋亡淋巴细胞图3.凋亡淋巴细胞细胞呈环形（wright细