中药逆转肿瘤多药耐药分子生物学机制实验探究进展

1、中药逆转肿瘤多药耐药分子生物学机制实验探究进展【摘要】总结了近年来中药逆转多药耐药的分子生物 学研究的实验概况，从逆转多药耐药的经典、非经典及多靶 点作用的角度阐述了中药的逆转作用，认为其主要是通过下 调p-gp蛋白及调控mrp、lrp、拓扑异构酶、谷胱甘肽s转 移酶、核转录因子、ca2+浓度、凋亡相关基因等介导的多药 耐药而实现，其作用多不局限于单一机制，而与其多靶点作 用有关。【关键词】中药；多药耐药；分子生物学目前，化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，而在化疗过 程中易产生肿瘤的多药耐药，大大降低了其疗效。因此，如 何解决多药耐药就成为了提高化疗疗效，改善患者生活质量 的关键问题。多药耐药

2、(multidrug resistance,mdr)是一个 多基因参与的过程，涉及多种耐药相关蛋白lo不同肿瘤 具有不同的耐药表型，可以是某种耐药基因表达，也可能是 多种耐药基因同时表达的结果，而由于中药的多靶点作用， 其可通过作用于多个耐药相关蛋白达到逆转多药耐药的作 用。目前，中药抗多药耐药的作用研究已深入到分子水平。 本文概述近年来中药在逆转多药耐药的分子水平的研究进展。1肿瘤多药耐药经典途径p-gp蛋白介导的多药耐药是研究最多，机制最为明确 的多药耐药产生途径，因此被称为多药耐药的经典途径。由 mdr1基因编码的p-gp蛋白atp依赖性的药物泵，其是通过 水解atp提供的能量，将进入细

3、胞内的药物泵出细胞，使得 细胞内药物浓度不断下降，最终使药物细胞毒作用减弱甚至 丧失出现耐药2。中药下调p-gp蛋白的实验研究较多， 下面就分体外与体内实验分别阐述。1. 1体外实验研究解霞等3对川苇嗪(tmp)逆转多 药耐药机制的研究显示mcf-7/adm细胞p-gp蛋白表达率为 (90. 60±0. 41) %,而加入非细胞毒性剂量川苇嗪后，耐药 细胞p-gp的表达率则降为(69. 10±165)% (p&lt；0. 01), 结果提示tmp能显著抑制mcf-7/adm细胞p-gp的表达。谢 长生等4 复方三根制剂对mdr细胞株k562/adr和k562/vcr

4、 逆转作用的研究，结果复方三根制剂对k562/adr作用24, 48, 72 h后p-gp蛋白表达量分别降为622±6.56, 730±4. 51, 310±1.09,而对 k562/vcr 作用 24，48, 72h 后p-gp表达量分别降为1054±83. 16 , 775 ±7. 02 , 3393 + 6. 56,与空白对照组相比，能显著下调p-gp蛋白的 表达，且有显著性差异(p&lt；0. 05),提示其逆转多药耐药 的作用可能与其下调p-gp蛋白的表达有关。许文林等5 对汉防己甲素逆转多药耐药机制的研究发现p-gp蛋白在

5、k562/adm细胞中呈现高表达，经10umol/l的汉防己甲素处 理细胞48h后，细胞平均荧光强度减弱，p-gp蛋白的表达减 少，另外经汉防己甲素作用后，k562/adm细胞中的mdr1基 因拷贝数明显下降（p&lt；0.01）o1.2体内实验研究李贵海等6粉防己碱对获得性 多药耐药小鼠s180肿瘤细胞相关蛋白的调控研究显示单纯 应用ddp的模型组，其p-gp蛋白的表达为13.13±5. 33,而 粉防己碱无毒性高低剂量组其表达分别降为7.41±3, 35和 9. 22±2. 36,且其抑制率显著提高，揭示逆转耐药的机制可 能与其降低p-gp蛋白的表达有

6、关。另据实验报道，中药三氧化二碑、eccg、甲基莲心碱、 补骨脂素等也可下调p-gp蛋白的表达而达到逆转多药耐药 的作用710。2多药耐药的非经典途径由mdr1基因编码的p-gp蛋白过度表达介导的药物外 排是产生mdr的经典机制，除此外，mdr还与多药耐药相关 蛋白（mrp）、肺耐药相关蛋白（lrp）、谷胱甘肽s转移酶、 拓扑异构酶、细胞凋亡等多种非经典机制密切相关。2. 1 mrp介导的多药耐药多药耐药蛋白1(mrp 1)属于 atp结合的盒式(atp-binding cassette, abc)运输蛋白家族 成员，它可以通过细胞膜转运多种抗肿瘤药，从而限制抗肿 瘤药进入细胞11。徐萌等12

7、用汉防己甲素逆转肺癌耐药实验研究发 现经汉防己甲素处理12, 24, 36 h后mrp蛋白表达量的表 达分别为 32. 21±4. 79, 30. 56±4. 58, 25. 55±7. 58,而对 照组则分别为 5342±7.42, 52. 98±10. 35, 60. 98±9. 37, 差异有非常显著性意义(p<0.01),提示汉防己甲素可以 下调肺癌耐药细胞mrp蛋白表达。成静等13对三氧化二 碑研究显示mrpmrna在耐药细胞a549/r中均呈过表达状态， a549/r 细胞经浓度为 0. 150,0. 375

8、,0. 750 umol/l 的 as203 作用48h后，mrpmrna的表达水平呈不同程度的降低，且随 着其浓度增加，mrpmrna表达水平逐渐下降。另外，王利等14葛根素逆转人胃癌裸鼠原位移植瘤多药耐药性的体内实验研究显示5-fu联合葛根素组mrp 蛋白阳性表达率为37. 5%,显著低于对照组生理盐水组(82. 5%)及单纯 5-fu 组(74%) (p&lt；0. 05),提示其逆转多药耐药作用与其下调mrp蛋白阳性表达率有关。2.2谷胱甘肽介导的多药耐药多药耐药的产生机制 复杂多样，其中谷胱甘肽s-转移酶活性的增强是产生多药耐 药的重要机制。肖希斌等15的研究显示k562/a

9、02细胞 gst-ji的pcr扩增带亮度较强，而经甲基莲心碱(nef)处理 组pcr扩增带亮度明显减弱，提示nef在mrna水平上抑制 gst-n基因的mrna转录，蛋白质印迹检测结果亦显示，未 经药物处理的k562/a02组的蛋白杂交带，明显强于 k562/a02+nef组，表明nef能抑制gst_ “蛋白的表达。苗立云等16青蒿琥酯逆转k562/a02细胞耐药性 机理的研究显示k562/a02细胞内gsh呈现高表达 (p&lt；0.05),经 100 u g/ml 青蒿琥酯处理 48h 后,k562/a02 细胞内gsh含量较药物处理前明显降低(p&lt； 0. 05) o

10、2.3核转录因子介导的多药耐药核转录因子 (nf-kb)在细胞增殖和凋亡中起关键调控作用，而目前有 研究显示其在多药耐药的产生中也扮演着重要的角色，陈进 伟等17 k562/a02耐药细胞nf-kb活性测定的研究发现 活化后k562/a02细胞nf-kb表达明显增强(p &lt；0. 01), 提示k562/a02细胞耐药可能与增高的nf- k b活性相关，其 研究显示经无毒性剂量葛根素处理后的k562/a02细胞的 nf-kb活性较未经葛根素处理前明显降低(p&lt； 0.01)。宋 玉成等18对盐酸千金藤素(ch)逆转eac/adr细胞多药 耐药性的机制研究发现耐药细胞中活

11、性高于敏感细胞 (p&lt；o. 05),化疗药adr可激活耐药细胞的nf- k b活性， 对敏感细胞无影响，其研究显示ch不但可抑制eac/adr细 胞中nf-kb持续性活性，而且可抑制adr对nf- k b的激活, 体内实验显示荷瘤小鼠eac/adr细胞核内nf-kb呈持续性 活化状态，adr作用2h后诱导nf-kb活化，ch与adr合用 2h后，可明显抑制adr对nf-kb活性的诱导。2.4 lrp及拓扑异构酶介导的多药耐药肺耐药相关蛋 白(lrp)与拓扑异构酶亦是近期研究较多的耐药介导介质。 lrp作用机制是通过降低药物的核质分布比率和通过囊泡、 胞吐作用将药物排出细胞19。拓

12、扑异构酶(topoii)是调 控dna拓扑状态的酶类，据研究发现，topoii质和量的改变 会直接影响与dna的结合，导致药物诱导产生的裂解复合物 形成减少，从而导致耐药。孙付军等20研究发现苦参碱 可以逆转小鼠s180肿瘤细胞获得性多药耐药，其研究表明 经其诱导后lrp、topoii小鼠瘤体中可呈稳定高表达，而给 予小鼠100mg/kg苦参碱后的瘤体中两种蛋白的表达率分别 降低为(10. 76 + 6. 28) %和(858±41) %,与对照组相比 呈现显著性(p&lt；0.01),其逆转作用可能与其调控lrp及 topoii的表达有关。季旭明等21对温下方逆转a549/

13、ddp 细胞的多药耐药的研究发现a549/ddp细胞mrp呈现髙表达, a549/ddp细胞经温下方含药血清组处理24 h后，含药血清 组+ddp能明显降低lrp表达，且与对照组比较有显著性差异 (p&lt；o. 05) o盖晓东等22柴胡逆转肝细胞癌多药耐药 的研究表明，经柴胡作用后，topoiimrna升高，揭示其逆转 多药耐药作用可能与调控topoilmrna基因表达有关。2. 5降低细胞内ca2+浓度ca2+是细胞内一个重要的 调节细胞生长、分泌和传导等机制的信使，自从tsuruo等 初次发现mdr表型的肿瘤细胞内游离ca2+浓度增高以来，许 多实验证明耐药肿瘤细胞中ca2+浓

14、度高于非耐药肿瘤细胞， 又有学者证实钙拮抗剂可逆转细胞对药物的耐药性。蔡宇等 23补骨脂素对hl60/ht耐药细胞逆转及对细胞内ca2+ 浓度影响研究发现耐药株hl60/ht细胞内ca2+浓度明显高于 敏感株hl60 (p&lt； 0. 01),而加用补骨脂素1-20 umol/l,尤 其补骨脂素10和20 umol/l两个剂量，ca2+浓度与作用时 间呈现负相关性，该动态结果说明了补骨脂素具有影响耐药 细胞hl60/ht内ca2+浓度趋势。王金华等24用粉防己碱 逆转人乳腺癌mcf-7多药耐药细胞的作用显示粉防己碱 (tet)与vcr合用处理耐药细胞，可明显地增加细胞内游 离钙的含量

15、，用 tet 20 umol/l+vcr 5 umol/l 处理 mcf-7 耐药细胞12 h,可使细胞内的游离钙比对照组增加2. 6倍。2.6凋亡相关基因介导的多药耐药bcl-2家族是细胞 凋亡的关键调控物，其中bcl-2相对分子量为26 000,蛋白 水平与肿瘤细胞的mdr相一致，其过表达的肿瘤细胞凋亡受 抑制，同时对阿霉素、长春新碱、顺钳等多种化疗药物耐药,其机制可能在于其产物可以稳定细胞生存，抑制多种因素， 包括化疗药物诱导的细胞凋亡，从而使细胞产生耐药25, 26o艾小红等27 甲基莲心碱逆转肝癌 hepg2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用发现 hepg2/t

16、hermotolerance 细胞较 hepg2 细胞高表达 bcl-2 蛋 白，而甲基莲心碱能够下调hepg2/thermotolerance细胞的 bcl-2表达。钟陆行等28参茂扶正注射液对k562/adm多 药耐药的影响研究显示k562/adm细胞bcl-2基因呈现高表 达，经10 ul/ml参茂处理后其表达为6& 39±3. 89,而正常 对照组则高达(93. 82±2. 32),由此可见参英扶正注射液可 以明显下调bcl-2表达率。3多靶点作用逆转机制整体观念是中医的基本特点之一。从现代研究的角度 看，可以体现在中药治疗肿瘤的多靶点作用。在逆转多药耐 药

17、中，中药的作用机制也并非只局限于某一点，而是一个综 合的作用，这也正是中药在逆转多药耐药研究中越来越受到 人们重视的原因之一。3. 1体外实验研究侯华新等29用板蓝根高级不饱 和脂肪酸对耐药肝癌细胞株bel-7404/adm逆转作用实验发 现p-gp. mrp蛋白在bel-7404/adm细胞中呈现高表达(与 bel-7404相比，p&lt；o. 01),经adm及无细胞毒性浓度的板 蓝根联合作用的bel-7404/adm细胞内adm含量较单独adm 作用时明显增加(p&lt；0.01)，提示其作用机制可能与其同 时降低p-gp. mrp蛋白的表达有关。王利等30榄香烯对 耐药

18、胃癌细胞的逆转实验研究发现sgc7901/vcr细胞膜和胞 浆内均有p-gp和mrp表达，为强阳性染色”+“，加入榄 香烯后sgc7901/vcr细胞也存在p-gp和mrp的表达，但 为” + “至“+”。盖晓东等31柴胡逆转肝细胞癌多药 耐药作用与相关机制的研究，结果表明柴胡逆转be 17402细 胞多药耐药显示经柴胡作用后，可明显的抑制be 17402细胞 mdrl/mrna和p-gp的表达,升高topo iimrna水平，揭示其 逆转多药耐药作用可能与调控多种耐药基因有关。3.2体内实验研究董琳等32甲基莲心碱对胃癌多 药耐药的逆转作用研究发现p-gp、mrp在sgc7901/vcr细胞

19、 中呈现高表达(p&lt；0. 05),经10 umol/l nef处理24 h 后，其阳性表达率分别下降至19.97%, 10.37%。孙付军等 33粉防己碱逆转获得性多药耐药小鼠s180肿瘤细胞p170 过度表达与调控细胞凋亡相关性研究动物实验表明，粉防己 组高、低剂量组p-gp的表达率分别为(7. 35±3. 65) %, (13. 26±4. 27) %,显著低于对照组(28. 12±9, 79) %,另 外还促进细胞凋亡相关因子fas和trail的表达，从而促进 细胞凋亡，并且明显降低耐药s180细胞的黏附因子cd54的 表达，由此可知其主要通过

20、降低mdr细胞膜p170过度表达 和促进细胞凋亡因子的表达两方面的作用来逆转多药耐药 的。4结论与展望目前，研究发现多药耐药的产生主要存在以下几个方 面的机制：®p-gp蛋白介导的耐药，另多药耐药相关蛋白 (mrp)及肺耐药相关蛋白(lrp)的异常表达也受到重视；酶 系统异常，包括gsh, gst, dna拓扑异构酶(topoii)和pkc 活性改变；®bcl-2基因高表达是抑制肿瘤细胞凋亡、导致 肿瘤耐药的重要因素。而综合国内文献发现，中药对多药耐 药的逆转作用亦是多渠道、多途径的，往往也是通过对不同 耐药途径的综合调控作用而实现的。不过，我们通过对近几年的文献研究可以发

21、现中药在 逆转多药耐药研究中亦存在一定的问题，其主要体现在以下 几个方面：研究多偏重于单体，而对复方研究较少，难以 体现中医辨证施治的特点；对机制的研究多偏重于经典途 径，而对非经典途径研究相对较少；中药对多药耐药的逆 转作用往往是多方面的，而有些文献报道多只对单个耐药相 关蛋白表达进行研究，不免存在以偏概全之嫌；亟需探索 中药研究的新方法，从而来弥补中药成分复杂给实验带来不 稳定性。总之，通过对近5年的相关文献分析，我们发现中药 在逆转多药耐药的研究中已深入到分子生物学水平。其逆转 作用往往是通过对不同的耐药蛋白的综合作用而实现的。由 于中药成分的不单一性，使其作用往往不局限于某单一靶 点，

22、而是体现于多个靶点。其是通过多靶点的综合作用，从 而可以从多角度、多层次来发挥逆转多药耐药的作用，另外 中药体现出了毒副作用小，作用显著的优点而愈加受到国内 外学者的关注。中药逆转剂的进一步研究推广势必有益于化 疗疗效的提高和晩期癌症患者的生活质量的改善。【参考文献】1 borowski e,bontemps-gracz mm,piwkowska a. strategies for overcoming abc一transporters-mediated multidrug resistance(mdr) of tumor cells j acta biochim pol,2005,52f3)

23、：609.2 ambudkar sv,dey s,hrycyna ca,ramachandra m,pastan i,gottesman mm. biochemical,cellular,and pharmacological aspects of the multidrug transporterj . annu rev pharmacol tbxicol,1999,39:361.3 解霞，郝立宏，高清波，等川苇嗪逆转肿瘤多 药耐药性及其机制的研究j 中华肿瘤防治杂 志,2009,12 (18):1368.4 谢长生，周维顺,冯正权，等.复方三根制剂对mdr 细胞株k562/adr和k562

24、/vcr逆转作用的研究j中国实 验方剂学杂志,2003,9(4):26.5 许文林，江云伟，王法春，等汉防己甲素逆转 k562/adm细胞株多药耐药性机制研究j 实用癌症杂 志,2003,18(4):347.6 李贵海，刘明霞,孙付军，等.粉防己碱对获得性 多药耐药小鼠s180肿瘤细胞p170, lrp, t0p0ii表达的调控j中国中药杂志,2005,30(16):1280.赵园园，金锋，梁军，等三氧化二神对人胃癌耐药细胞系sgc7901/adm耐药逆转及凋亡诱导作用的探讨j.中国肿瘤临床,2005,32(11):611.8 林晓贞，梁钢，黎莉，等.eccg对两株耐药肿瘤 细胞的细胞毒增敏作

25、用及抑瘤作用研究j中药药理与临 床,2006,22 (1):30.9 黄程辉，曹培国.甲基莲心碱对乳腺癌mcf-7/adr 细胞mdr逆转的研究j.肿瘤防治研 究,2007,34(5):351-354.10 蔡宇，蔡天革.补骨脂素逆转多药耐药细胞系 k562/adr耐药性研究j中国药理学通 报,2003,19(10):1164.11 degorter mk,conseil g,deeley rg, et al. molecular modeling of the human multidrug resistance protein 1 (mrp1/abcc1)biochem biophys r

26、es commun,2007,365(1):29.12 徐萌，周蓿汉防己甲素逆转肺癌化疗耐药 和凋亡的实验研究j 新中医,2006,38(6):90.13 成静，冯觉平，王亚平，等.三氧化二碑对人肺 腺癌a549/r细胞多药耐药相关蛋白表达的影响j.医药 导报,2007,26(5):457.14 王利，魏品康，秦志丰，等.葛根素注射液逆 转人胃癌裸鼠原位移植瘤多药耐药性的实验研究j 成都 中医药大学学报,2005,28(1):42.15 肖希斌，谢兆霞，秦 群.甲基莲心碱抑制 k562/a02细胞gst- n的表达j 西安交通大学学 报,2005,26(5):428.16 苗立云，张祖贻.青蒿

27、琥酯逆转k562/a02细 胞对阿霉素耐药性机理的研究j 东南大学学 报,2006,25(6):445.17 陈进伟，骆 蓉，张广森，等.k562/a02耐药细 胞nf-kb活性测定及葛根素部分逆转耐药效应的初步研究j中华血液学杂志,2006,27(7):482.18 宋玉成，夏薇，江金花，等盐酸千金藤素逆转 eac/adr细胞多药耐药性的作用及其机制j 药学学 报,2005,40(3):204.19 kawabata s, oka m, shiozawa k, et al. breast cancer resistance protein directly confers sn-38 res

28、istance of lung cancer cells. biochem biophys res commun,2001,280： 1216.20 孙付军，王宁，李贵海，等苦参碱对获得性多 药耐药小鼠s180肿瘤细胞表达产物p170、lrp及topoii表 达的影响j 中药材，2004,27(11):83821 季旭明，欧阳兵，王春燕，等温下方逆转 a549/ddp细胞的多药耐药及对膜表面蛋白表达的影响j 中国药物与临床,2006, 6(12):88522 盖晓东，曾常茜，洪敏.柴胡逆转肝细胞癌多 药耐药作用与相关机制的研究j 高等学校化学学 报,2005,26(8):1446.23 蔡宇，余绍蕾，徐炎，等补骨脂素对hl60/ht 耐药细胞逆转及对细胞内ca2+浓度影响研究j.中国药学 杂志,2006,41(12):905.24 王金华，叶祖光，孙爱续，等.粉防