干细胞与肺疾病(呼吸科内讲座)

1、20092009年年8 8月月朱建勇朱建勇 郧阳医学院附属人民郧阳医学院附属人民医院呼吸科医院呼吸科l1967年，美国华盛顿大学的多纳尔托马斯发表报告称，如果将正常人的骨髓移植到病人体内，可以治疗造血功能障碍。l1998年11月，美国威斯康星大学的科学家在美国科学杂志报告说，他们已成功地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖。l1999年12月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。l1999年12月，干细胞研究进展被科学杂志评选为该年度世界十大科学进展之首u干细胞基础知识干细

2、胞基础知识u干细胞与肺部疾病的当前研究干细胞与肺部疾病的当前研究u开展干细胞治疗肺疾病的思考开展干细胞治疗肺疾病的思考干细胞干细胞(stem cell)：l定义：干细胞是一类定义：干细胞是一类具有具有自我更新自我更新和和分化分化潜能潜能的细胞的细胞按来源分类按来源分类(1)胚胎干细胞胚胎干细胞：指胚胎早期的干细胞。这类干细胞分化：指胚胎早期的干细胞。这类干细胞分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力。如囊胚潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力。如囊胚期内细胞团的细胞期内细胞团的细胞(2)成体干细胞成体干细胞：指成体各组织器官中的干细胞，具有自：指成体各组织器官中的干细胞，具有自我更新能

3、力，但分化潜能窄，只能分化为相应我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻或相邻)组组织器官组成的细胞。如骨髓造血干细胞、间充质干细胞、织器官组成的细胞。如骨髓造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肺干细胞等神经干细胞、肺干细胞等l 根据其分化潜能大小，可分为三类根据其分化潜能大小，可分为三类全能干细胞：全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能具有形成完整个体的分化潜能(如胚胎干细胞胚胎干细胞) 多能干细胞：多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能，具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力。如骨髓造血但失去了发育成完整个体的能力。如骨髓造血干细胞，它可分化出至少十二种血细

4、胞，但不干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞能分化出造血系统以外的其它细胞单能干细胞：单能干细胞：只能向一种类型或密切相关的两只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞、肺干细胞胞、肌肉中的成肌细胞、肺干细胞干细胞形态共性干细胞形态共性：细胞呈圆形或卵圆形，：细胞呈圆形或卵圆形，体积小，核质比大，增殖力强体积小，核质比大，增殖力强干细胞的固定组织位置干细胞的固定组织位置：多数的干细胞：多数的干细胞有固定存在部位与方式有固定存在部位与方式端粒酶活性高端粒酶活性高：如造血干细胞具

5、癌细胞的端：如造血干细胞具癌细胞的端粒酶活性，增殖能力强。随着增殖与分化，端粒酶活性，增殖能力强。随着增殖与分化，端粒酶活性下降粒酶活性下降蛋白标志和免疫分子蛋白标志和免疫分子：不同干细胞有各异的：不同干细胞有各异的蛋白质标志分子，可作为确定干细胞位置、分蛋白质标志分子，可作为确定干细胞位置、分离提纯干细胞的标志。如：巢素蛋白离提纯干细胞的标志。如：巢素蛋白神经干神经干细胞；角蛋白细胞；角蛋白15表皮干细胞表皮干细胞 干细胞有干细胞有对称对称与与不对称不对称两种分裂方式两种分裂方式对称分裂：干细胞对称分裂：干细胞 分裂分裂干细胞干细胞干细胞干细胞对称分裂：干细胞对称分裂：干细胞 分裂分裂分化细

6、胞分化细胞分化细胞分化细胞不对称分裂：干细不对称分裂：干细胞胞 干细胞干细胞分化细胞分化细胞分裂分裂干细胞增殖速度较慢：干细胞增殖速度较慢：小肠干细胞的分裂小肠干细胞的分裂速度速度(Tc=11小时小时) 干细胞具有自稳定性：干细胞在个体生命干细胞具有自稳定性：干细胞在个体生命过程中自我更新并维持其自身数目恒定过程中自我更新并维持其自身数目恒定 自稳定性自稳定性是区别肿瘤细胞的本质特征是区别肿瘤细胞的本质特征干细胞的横向分化干细胞的横向分化 在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为与其组与其组织来源一致的细胞织来源一致的细胞。但有时供体干细胞会分化

7、出。但有时供体干细胞会分化出与其组与其组织来源不一致的其它细胞织来源不一致的其它细胞，这种现象称，这种现象称干细胞横向分化干细胞横向分化(trans-differentiation)。实验：小鼠肌肉干细胞实验：小鼠肌肉干细胞体外少量骨髓间质细胞培养体外少量骨髓间质细胞培养5天天接受致死量辐射的小鼠中接受致死量辐射的小鼠中各种血细胞系各种血细胞系横向分化的调控机制横向分化的调控机制与干细胞的微环境有关与干细胞的微环境有关 干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化细胞的影响，从而对新受到周围正在进行分化细胞的影响，从而对新的微环境中的调节

8、信号做出反应的微环境中的调节信号做出反应v启启 示示干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体中具有很强的可塑性中具有很强的可塑性临床上可寻找容易获得的其它组织干细胞，大临床上可寻找容易获得的其它组织干细胞，大量扩增后植入病变器官，在植入器官微环境诱量扩增后植入病变器官，在植入器官微环境诱导下向该系统细胞分化，这为干细胞治疗提供导下向该系统细胞分化，这为干细胞治疗提供了可能了可能干细胞的逆向分化（去分化）干细胞的逆向分化（去分化） 一种干细胞向其前体细胞的逆向转化一种干细胞向其前体细胞的逆向转化 干细胞巢干细胞巢(stem cell nich，壁龛）：壁龛

9、）： 干细胞在组织中的居所干细胞在组织中的居所干细胞生存的微环境干细胞生存的微环境： 指干细胞巢中控制干细胞增殖与分化的指干细胞巢中控制干细胞增殖与分化的外外部信号部信号 TGF、Wnt家族的分泌信号分子家族的分泌信号分子Notch受体受体胶原胶原氨基聚糖氨基聚糖蛋白聚糖蛋白聚糖层粘连蛋白和纤粘连蛋白层粘连蛋白和纤粘连蛋白弹性蛋白弹性蛋白细胞粘连分子细胞粘连分子u胚胎干细胞胚胎干细胞u骨髓造血干细胞骨髓造血干细胞u骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞u神经干细胞神经干细胞u表皮干细胞表皮干细胞u毛囊干细胞毛囊干细胞 1细胞治疗细胞治疗l干细胞可恢复因重大疾病而损害的细胞，这是干细胞潜在的最大优势干

10、细胞可恢复因重大疾病而损害的细胞，这是干细胞潜在的最大优势 2基因治疗基因治疗l 即通过胚胎干细胞和基因工程技术，矫正缺陷基因，即通过胚胎干细胞和基因工程技术，矫正缺陷基因，将治疗基因整合到干细胞，再将干细胞移植入人体中，将治疗基因整合到干细胞，再将干细胞移植入人体中，能够持久地发挥作用。能够持久地发挥作用。l 肺囊性纤维化病是一种基因缺陷遗传病，肺囊性纤维化病是一种基因缺陷遗传病，30岁以前致岁以前致死。若在死。若在胚胎早期干细胞中将缺陷基因修正胚胎早期干细胞中将缺陷基因修正，再将，再将修修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中， 将会生出一个健康的将会生出一个健康的婴儿婴儿l

11、 支气管肺发育不良支气管肺发育不良 3、癌症治疗、癌症治疗l设计多种方法，使特定细胞能击中特定设计多种方法，使特定细胞能击中特定癌细胞，直接破坏或改变癌细胞。癌细胞，直接破坏或改变癌细胞。 4 4、器官移植、器官移植 目前科学家已能在体外以干细胞为种目前科学家已能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病子培育成功一些组织器官，来替代病变或衰老的组织器官变或衰老的组织器官 有一天，真的会长生不老有一天，真的会长生不老! !l小鼠胚胎干细胞在含有小鼠胚胎干细胞在含有型胶原的培养基中可型胶原的培养基中可以分化成无纤毛的分泌细胞以分化成无纤毛的分泌细胞Clara Clara 细胞细胞 l在含

12、有小气道生成因子的无血清培养基中在含有小气道生成因子的无血清培养基中, ,小小鼠胚胎干细胞可以分化成鼠胚胎干细胞可以分化成型肺泡上皮细胞型肺泡上皮细胞Coraux C , Nawrocki2Raby B , HinnraskyJ , et al . Embryonic stem cells generate airway epit helial tissue. Am J Respir Cell Mol Biol ,2005 ,32 (2) 87-92.l1 Krause 等将雄鼠的骨髓干细胞注入经放射线照射等将雄鼠的骨髓干细胞注入经放射线照射后的雌鼠体内后的雌鼠体内, 在雌鼠体内在雌鼠体内20

13、%的肺泡的肺泡型细胞以及不型细胞以及不到到4%的气管上皮细胞为的气管上皮细胞为Y染色体染色体l2 Suratt等在一组同龄女性异体造血干细胞移植中发等在一组同龄女性异体造血干细胞移植中发现现,约约2. 5% 8.5 % 的肺上皮细胞和的肺上皮细胞和37. 5% 42. 3%的肺内皮细胞是男性供体来源的肺内皮细胞是男性供体来源1 Krause D S, Theise N D, CollectorM I, et al. Multi2organ,multi-ineage engraftment by a single bone arrow derived stem cell.Cell, 2001,

14、105: 3693772 Suratt B, Cool C, Serls A, et al. Hunlgn pulmonary chimerism after hematopoietic stem cell transp lantation. Am J Resp ir Crit CareMed, 2003, 168: 3 l8322lUhalUhal B B等多数研究认为等多数研究认为基底细胞基底细胞是大气道内的固有干是大气道内的固有干细胞，细胞，claraclara细胞细胞是细支气管内的固有干细胞群是细支气管内的固有干细胞群 ，肺，肺泡泡型细胞型细胞是肺泡细胞的干细胞是肺泡细胞的干细胞lDe

15、lp lanqueDelp lanque等将一个等将一个21 21 周胎儿的气管切成圆形薄片周胎儿的气管切成圆形薄片植入植入SCIDSCID小鼠皮下小鼠皮下, , 可以见到正常人气道黏膜的各种可以见到正常人气道黏膜的各种细胞演化，细胞演化，Delp lanqueDelp lanque等认为这是气道局部成体干细等认为这是气道局部成体干细胞分化的结果。胞分化的结果。l所有的肺干细胞生长更新率极低和再生能力非常有限所有的肺干细胞生长更新率极低和再生能力非常有限uCOPD、肺纤维化、矽肺、肺动脉高压、结核性肺毁损、肺纤维化、矽肺、肺动脉高压、结核性肺毁损发病率高，危害大，但目前尚无特效的治疗手段发病率

16、高，危害大，但目前尚无特效的治疗手段u现有的动物实验证明：干细胞在肺中可产生细胞因子，现有的动物实验证明：干细胞在肺中可产生细胞因子，分化成新的肺泡，重建新的气道，形成新的血管，好比分化成新的肺泡，重建新的气道，形成新的血管，好比为病人提供了新的肺叶，对这些疾病的治疗将是一种革为病人提供了新的肺叶，对这些疾病的治疗将是一种革命性的变化命性的变化u干细胞技术相对成熟，在心肌梗塞、帕金森氏症、糖尿干细胞技术相对成熟，在心肌梗塞、帕金森氏症、糖尿病方面已提供了可成功借鉴的经验病方面已提供了可成功借鉴的经验u干细胞研究是当前乃至今后相当长时间的热门领域，可干细胞研究是当前乃至今后相当长时间的热门领域，

17、可以预见谁掌握了干细胞谁将在学术和效益方面取得成功以预见谁掌握了干细胞谁将在学术和效益方面取得成功细细胞胞分分离离胚胚胎胎干干细细胞胞细细胞胞来来源源骨骨髓髓干干细细胞胞肺肺干干细细胞胞传传代代扩扩增增表表型型鉴鉴定定注注入入体体内内细细胞胞归归巢巢定定向向分分化化结结果果检检测测l胚胎干细胞：胚胎干细胞：较难得到，数量有限，需大量扩增，较难得到，数量有限，需大量扩增，必须体外诱导定向分化，异体移植存在免疫排斥必须体外诱导定向分化，异体移植存在免疫排斥l骨髓干细胞：骨髓干细胞：来源广，容易获取及扩增，不来源广，容易获取及扩增，不必须体必须体外诱导定向分化，外诱导定向分化，自体移植，不存在免疫排

18、斥问题自体移植，不存在免疫排斥问题l肺干细胞：肺干细胞：只能取材于病人呼吸道和肺组织，传代只能取材于病人呼吸道和肺组织，传代扩增能力差扩增能力差v我的思考：从骨髓中获取干细胞可能是最现实的选择l骨髓干细胞可能含有三个细胞群骨髓干细胞可能含有三个细胞群造血干细胞造血干细胞间充质干细胞间充质干细胞内皮细胞前体细胞内皮细胞前体细胞l多数动物实验利用骨髓间充质干细胞治疗肺病，也有多数动物实验利用骨髓间充质干细胞治疗肺病，也有实验进行全骨髓移植实验进行全骨髓移植v 我的想法：全骨髓，更易操作，含有内皮细胞前体细我的想法：全骨髓，更易操作，含有内皮细胞前体细胞或许有助于形成血管胞或许有助于形成血管v 我的

19、思考：我的思考：1 1、采用全骨髓时，造血干细胞对、采用全骨髓时，造血干细胞对COPDCOPD是否是否会导致红细胞增多症加重？会导致红细胞增多症加重？ 2 2、治疗肺部疾病全骨髓疗效是否更好？、治疗肺部疾病全骨髓疗效是否更好？l骨髓间充质干细胞数量少，占骨髓细胞数的骨髓间充质干细胞数量少，占骨髓细胞数的1/101/10万万l若不进行有效的扩增，将分离的干细胞直接输若不进行有效的扩增，将分离的干细胞直接输入体内，相对整个肺来讲，犹如苍海一粟，少入体内，相对整个肺来讲，犹如苍海一粟，少量的供体细胞难以产生效应量的供体细胞难以产生效应v我的顾虑：我的顾虑：若体外扩增，非常繁锁，最终要回若体外扩增，非

20、常繁锁，最终要回输人体，实验条件及安全性难以符合要求输人体，实验条件及安全性难以符合要求v我的想法：我的想法：抽吸更多骨髓，获得更多干细胞不抽吸更多骨髓，获得更多干细胞不行体外扩增，直接回输人体可能是条捷径行体外扩增，直接回输人体可能是条捷径l利用免疫沉淀印迹技术、免疫磁珠技术利用免疫沉淀印迹技术、免疫磁珠技术和流式细胞技术可进行标记物测定和流式细胞技术可进行标记物测定骨髓间充质干细胞可测粘附分子骨髓间充质干细胞可测粘附分子ICAM-1ICAM-1，CD49CD49等等肺干细胞肺干细胞sca-1sca-1、表面分子、细胞角蛋白、表面分子、细胞角蛋白、CCSPCCSP等等v我的无耐：我的无耐：行

21、细胞表型鉴定，技术要求行细胞表型鉴定，技术要求及费用高，不做实验缺乏可信度及费用高，不做实验缺乏可信度l尾静脉和腹腔注射：是当前尾静脉和腹腔注射：是当前“干细胞治疗肺疾干细胞治疗肺疾病病”动物实验中最常用的方式。动物实验中最常用的方式。l陈旧性心梗、帕金森氏病多采用病灶处局部注陈旧性心梗、帕金森氏病多采用病灶处局部注射的方式。脑瘫可采用腰穿注射。肝硬化采用射的方式。脑瘫可采用腰穿注射。肝硬化采用肝固有动脉局部灌注。肝固有动脉局部灌注。v我的思考：我的思考：1 1、局部注射？静脉点滴？气管内给药？哪种方、局部注射？静脉点滴？气管内给药？哪种方式效果最佳？式效果最佳？2 2、我们能否借助介入技术行

22、支气管动脉超选择、我们能否借助介入技术行支气管动脉超选择性叶段注入？性叶段注入？l实验表明：通过静脉输注骨髓干细胞，只有极少部分实验表明：通过静脉输注骨髓干细胞，只有极少部分到达了肺，绝大多数又归巢到骨髓到达了肺，绝大多数又归巢到骨髓 如何保证循环中足够数量的干细胞由血管内进入肺部如何保证循环中足够数量的干细胞由血管内进入肺部病灶定居分化病灶定居分化是影响疗效的关键因素是影响疗效的关键因素v我的思考：我的思考：1 1、能否利用某些病毒载体转染干细胞，使干细、能否利用某些病毒载体转染干细胞，使干细胞表面具有特殊的受体增强对肺组织的亲合力？胞表面具有特殊的受体增强对肺组织的亲合力？l实验表明：干细胞的分化受局部微环境的影响，实验表明：干细胞的分化受局部微环境的影响，进入肺组织中的干细胞有向进入肺组织中的干细胞有向4040多种肺组织细胞多种肺组织细胞自主分化的潜能自主分化的潜能l我们的任务是我们的任务是只要把足够量的干细胞送只要把足够量的干细胞送入肺组织，而不需要体外实验那样去研入肺组织，而不需要体外实验那样去研究加入何种因子去诱导究加入何种因子去诱导疗效的疗效的检测检测l动物实验中动物实验中疗效的检测：可将动物处死，检检测：可将动物处死，检测肺组织的结构变化和干细胞标记物测肺组织的结构变化和干细胞标记物l在临床实验中如何进行疗效的评定？评定？u我的思考：我的思考：血