基因与病毒复制的关系

1、3.1 引言本实验所研究的BP基因，选自本实验室博士所做的口蹄疫病毒急性感染BHK-21细胞和持续感染BHK-21细胞的基因芯片检测结果。张虎博士已在他的毕业论文中初步验证了BP基因在口蹄疫病毒持续性感染（持感细胞）中下调，急性感染细胞（急感细胞）中上调，与芯片结果相符。我们选取BP基因做进一步的深入研究，期望能通过检测其在持感细胞不同代次中表达量随病毒变化的情况，阐明口蹄疫病毒持续感染与细胞共存的关系，也希望得到该基因影响病毒的复制和持感稳态的结果。单细胞实时荧光定量PCR技术可以在单个细胞中检测多个基因的表达情况，单细胞水平的检测可以揭示在群体情况下被平均化掩盖的关键现象，是目前用于细胞基

2、因转录谱分析的先进技术。如有研究报道，通过单细胞转录谱分析揭示人诱导多能干细胞的异质性(Narsinh et al., 2011)，细胞所处的微环境决定了细胞在病毒感染过程中表现出的异质性(Snijder et al., 2009)，这些关键现象都是在群体水平的研究中无法展现出来的问题。而单个细胞中基因表达量的绝对拷贝数更能真实的反应群体细胞之间存在的差异性，而这种差异性在其与病毒或者环境的相互作用时，是否会提供进化上的优势，也是我们研究持续感染时所感兴趣的科学问题。3.2 材料和方法3.2.1 材料1病毒与细胞系O型口蹄疫病毒来自中国农业科学院兰州兽医研究所。叙利亚仓鼠肾细胞系（BHK-21

3、）来自中国典型培养物保藏中心。持续感染口蹄疫病毒的BHK-21细胞系（PI）由本实验室黄璇博士建立并保存。2试剂细胞培养基（MEM），胰酶和磷酸盐缓冲液（PBS）均购自GIBCO公司。胎牛血清购自四季青公司。RNase-free H2O 购自TaKaRa公司。ReverTra Ace® qPCR RT Kit，THUNDERBIRD® SYBR®qPCR Mix，THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix均购自TOYOBO公司。细胞总RNA裂解液Trizol购自Invitrogen公司。苯酚，氯仿和乙醇均购自国药公司。引物，探针合成

4、自Life公司。3.仪器CO2细胞培养箱（2300型）购自Sheldon Manufacturing公司。生物安全柜（ClassBiohazad safty cabinet）购自ESCO公司。程控降温仪KRYO 560-16购自Planer公司。超低温-70冰箱和NanoDrop2000c均购自Thermo公司。普通冰箱购自伊莱克斯公司。台式小型冷冻离心机购自Eppendorf公司。荧光定量PCR仪（CFX96）购自Bio-Rad公司。PCR仪（T-Gradient Thermoblock）购自Biometra公司。毛细管购自南京泉水教学实验器材厂。显微操纵仪、显微注射仪、拉针器和磨针仪是Na

5、rashige公司的产品。倒置光学显微镜购自Olympus公司。3.2.2 方法3.2.2.1 TCID50实验将BHK-21细胞接种于96孔板中，置于37 5%CO2培养箱培养24h，汇合度至70%左右即可进行病毒接种。将收集到的持感病毒进行10倍梯度稀释。弃去96孔板中的上清液，用PBS洗两次，加入不同稀释度的病毒液100L，每个稀释度感染8个复孔。对照组用100L无血清的MEM代替病毒液，37 5%CO2培养箱孵育1h，然后补加新鲜的含5%FBS的MEM培养基100L。置于37 5%CO2培养箱培养72h后，用倒置显微镜观察细胞病变情况，并做记录。最后，按照Reed-Muench公式计算

6、TCID50值。3.2.2.2 单细胞的挑取和裂解1.单细胞贮存液的制备在挑取单细胞前，需预先分好单细胞的储存液，储存液的配置比例为5%的RNase抑制剂和95%的RNase-free H2O。将混合好的储存液分到RNase-free PCR管中，每管5L，一批32个PCR管，放入4冰箱待用。2. 单细胞的挑取所有被挑取的细胞均是在T25瓶中生长至传代汇合度，去掉培养基加入1mL胰酶消化5min细胞变圆脱落后，向培养瓶中加入9mL10% FBS的新鲜MEM培养基中和，充分吹散细胞，调整细胞浓度为104-105个/mL，然后取1mL细胞悬液于直径6cm的无菌培养皿中，进行单细胞的挑取。用拉针器和

7、磨针仪制作精细的细胞挑针，通过与显微注射仪连接的倒置显微镜可直接观察到待分离的细胞并能随时监控整个分离挑取单细胞的过程，准确快速地获得所需的单细胞样品。具体操作步骤是首先将细胞挑针与显微操纵仪的右导管相连，调节显微注射仪的平衡（balance）旋钮使提供的平衡压减小（即表现为毛细管向内吸液），然后再将挑针前端伸入培养皿中至液面下，在显微镜下挑取单个细胞。吸入一个单细胞后，将带有单细胞的挑针提起伸入RNase-free PCR管液面下，增大平衡压，将细胞吹入盛有细胞储存液的PCR管中，即完成一个细胞的挑取，当完成一批32个细胞的挑取时，一轮单细胞的挑取即完成，需马上进行后续处理。3. 单细胞的裂

8、解一批32个细胞的挑取一般控制在30min内完成，在此时间内细胞能最大限度的维持原状。首先，将单细胞样品放入PCR仪中，进行98热变性处理，使细胞膜破裂，热处理3min后再浸入液氮速冻3min。然后取出放入37水浴锅中溶解1min,如此反复循环三次。得到的裂解好的单细胞样品可暂时放置于-80冰箱保存，直至进行后续荧光定量RT-PCR的检测。3.2.2.3 单细胞技术运用于群体细胞的挑取和裂解将单细胞技术运用于群体细胞的挑取，将细胞贮存液体积等比例放大，即挑取10个细胞到50L贮存液，50个细胞到250L贮存液，贮存液的配置方法如前所述。群体细胞的裂解方法也与单细胞相同。3.2.2.4 群体细胞

9、的相对荧光定量RT-PCR检测1.逆转录取1ugRNA加入无RNA酶的PCR管中，补RNase-free H2O至7L。放入PCR仪中，65反应5min，然后置于冰上。该步骤可以破坏RNA的二级结构，增强逆转录酶的反应效率。然后每管加入反应体系：5 x RT Buffer 2L RT Enzyme Mix 0.5L Primer Mix 0.5L 总体积 10L然后混匀组分放入PCR仪中 37 °C 15 min 进行逆转录，98 °C 5 min 灭活逆转录酶。最后将cDNA置于4 °C 或 20 °C保存。2.定量PCR检测先将cDNA稀释10倍。在

10、相对荧光定量PCR中，每个样品的cDNA既要检测内参基因（GAPDH），还要检测目的基因（BP）。相对定量不需要标曲，只得到目的基因在不同细胞中表达量的相对变化情况。内参基因的检测是为了去除细胞量的影响，在这里需假设内参基因在细胞量一致的情况下，表达量是相同的。不同基因反应组分的配比和实验条件均是相同的。只是在PCR过程中，分别使用各自的引物即可。具体反应体系如下：THUNDERBIRD® SYBR®qPCR Mix 12.5LForward Primer（25M）0.5LReverse Primer（25M）0.5L cDNA样品5L RNase-free H20 6.5

11、L总体积 25LPCR反应程序为：95 1min95 15s60 1min 读取荧光值 39cycles60到95每增加0.5反应0.05s然后读取荧光信号。做相对荧光定量PCR时需绘制出每个样品的溶解曲线来确定样品是否被专一的扩增。3.2.2.5 单细胞实时荧光定量RT-PCR本实验采取两步法，首先将单细胞的RNA进行逆转录，合成其cDNA链，然后将cDNA稀释，分成三份分别检测三个不同基因（GAPDH，BP，FMDV-3D）的表达水平。引入看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为对照基因以确保分离裂解单细胞过程的真实有效。GAPDH和FMDV-3D基因的单细胞荧光定量检测方法是本实

12、验室已建立的成熟技术。检测GAPDH的引物序列为：上游引物，FP-GAPDH:5-AAGGCCATCACCATCTTCCA-3下游引物，RT-GAPDH: 5-GCCAGTAGACTCCACAACATAC -3荧光探针序列为:Probe-GAPDH:5FAM-AGCGAGATCCCACCAACATCAAATGGG-BHQ1-3扩增子的大小为87bp。检测FMDV-3D的引物序列为：上游引物，FP-3D： 5-GAACACATTCTTTACACCAGGAT -3下游引物，RT-3D： 5-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG -3荧光探针序列为：Probe-3D：5FAM-ACAAC

13、CTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA -3扩增子的大小为121bp。BP基因的序列相关信息见2.2.2.4本实验的第一步逆转录过程，运用ReverTra Ace® qPCR RT Kit逆转录试剂盒对细胞内的所有RNA进行无差别的逆转录。具体反应体系和步骤如下：先将含有5L单细胞裂解液的PCR管放入PCR仪中，65反应5min，然后置于冰上。该步骤可以破坏RNA的二级结构，增强逆转录酶的反应效率。然后每管加入反应体系：Nuclease-free H20 2L 5 x RT Buffer 2L RT Enzyme Mix 0.5L Primer Mix 0.5L

14、总体积 10L混匀组分放入PCR仪中， 37 °C 15 min 进行逆转录，98 °C 5 min 灭活逆转录酶。最后将cDNA置于4 °C 或 20 °C保存。第二步qPCR过程是在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪中进行的。样品cDNA先需加入5L Nuclease-free H20稀释混匀，标准品为体外克隆得到的质粒DNA。具体反应体系如下：THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix 12.5L Forward Primer（25M） 0.5LReverse Primer （25M） 0.5L Probe 0.25L

15、 cDNA样品/标准品 5LRNase-free H20 6.25L总体积 25LqPCR反应程序为：95 1min95 15s60 1min 读取荧光值 39cycles3.3 结果与分析3.3.1 持感细胞胞外病毒的感染性实验将PI22、PI33、PI58代次持感细胞培养时的上清液转移至T25瓶BHK-21细胞中，12h后观察持感细胞胞外病毒对正常BHK-21细胞的细胞致病变效应（CPE）。如图3-1，持续感染细胞上清液中有口蹄疫病毒感染性颗粒的释放，该持感病毒可以使正常BHK-21发生CPE。图3-1 持感细胞上清液感染正常BHK-21细胞照片(感染12h，×100)A：正常B

16、HK-21细胞，B：持感细胞PI22代次感染BHK-21细胞，C：持感细胞PI33代次感染BHK-21细胞，D：持感细胞PI58代次感染BHK-21细胞3.3.2持感细胞胞内病毒载量的检测然后，我们选取持感细胞PI32，PI48，PI63代次测定胞内活病毒的载量。取汇合度达90%的三种细胞T25瓶，弃去上清液，加入6mL无血清新鲜MEM培养基，于-80冰箱冷冻过夜。裂解细胞，收集病毒液，分管保存在-80冰箱，取一只用于TCID50的检测。结果如图3-1，三个代次持感细胞胞内均含有具有感染性的活病毒，其中PI32代次时胞内病毒载量最低，为每毫升病毒原液含102.75个活病毒。PI48代次时病毒载

17、量最高，为每毫升病毒原液含103.6个活病毒。本实验的结果还证明了持感细胞胞内的病毒具有感染正常BHK-21细胞的能力。图3-2不同代次病毒持感细胞胞内病毒载量(TCID50滴度)3.3.3单细胞与群体细胞数据平均化后的比较用单细胞技术挑取群体细胞10个和50个各三组，使用单细胞裂解方法获得细胞RNA、逆转录、荧光定量PCR测定GAPDH基因和BP基因的表达量。将单细胞的值平均化与群体细胞平均值做对比，发现如图3-3，单细胞的均值并不在群体细胞均值绘制的趋势线上，单细胞数据具有相当大的标准偏差，这是细胞异质性的表现。群体细胞的平均值无法体现细胞的异质性，单个细胞基因的表达是具有波动性的。对单个

18、细胞基因表达量的研究更能发现细胞与细胞之间的差异性，而这种差异往往被群体实验方法的随意平均化所掩盖。图3-3单细胞和群体细胞的平均基因表达（单细胞：平均值±方差；10、50群体细胞：平均值±方差）3.3.4 正常BHK-21细胞与不同代次持感细胞的形态学特征挑选的正常细胞和持感细胞都是状态良好，且具有代表意义的（图3-4）。PI28代次是持续感染建立已经稳定的早中期，在初期持续感染的建立过程中，前10代次的传代都是需要加入诱导持感形成的试剂NH4Cl的。故10代之后的细胞在很长一段时间的传代时还需一个适应的过程，即适应没有NH4Cl碱性选择环境。因此，20代次前仍然是持感细

19、胞的不稳定状态，故选取早代次持感细胞时从PI28代次开始。持感细胞在传代到末期时会发生两种情况，一种是脱毒，这种情况并不是培养方式不当产生的，Domingo实验室建立的C型口蹄疫持感细胞在传代过程中也会发生脱毒现象，该现象被认为是细胞进化的结果，脱毒后的细胞与正常细胞相比对野生型病毒和持感病毒都表现出更强的抵抗力(de la Torre et al., 1985; Herrera et al., 2008)。第二种情况是，发生致细胞病变现象(CPE)。该现象产生的原因应该是细胞与病毒共生的平衡被打破，细胞不再耐受病毒的持续感染，选择了死亡的方式。基于上述两点的考虑，我们选取的持感晚代次在PI6

20、8代次。本实验对持感细胞的研究跨越40个代次，已包括持感细胞生活周期的所有典型时期，具有代表意义。图3-4的形态学照片显示，PI28细胞，PI38细胞，PI55细胞，PI68细胞与正常BHK-21细胞的形态无明显差异，具备病毒持续感染细胞的基本特征。图3-4. 正常BHK-21与持感细胞形态学照片(×100)A:正常BHK-21细胞，B:PI28细胞，C:PI38细胞，D:PI55细胞，E:PI68细胞3.3.5正常BHK-21细胞和不同代次的持感细胞中BP基因和病毒3D基因的表达量差异病毒持感细胞随着传代的进行，病毒量在不同代次中会发生变化，本实验室黄璇博士论文中已有相关结果。首先

21、我们想知道在病毒持感群体水平，宿主细胞BP基因在不同代次之间的表达量和病毒量之间是什么关系。用实时荧光定量RT-PCR的方法检测了细胞BP基因和病毒3D蛋白的表达量，结果如图3-4显示，BP基因在PI55代次细胞中表达量最高，其次是PI38代，而PI68代次表达量最低。同时3D基因的表达与BP基因趋势一致的有PI28代次和PI68代次，表达量都是BP基因低时，3D基因的表达量也低。在所有检测的持感代次中，病毒量最高的代次是PI38代次，这与实验室黄璇博士毕业论文中所描述的持感PI36代时病毒量达到顶峰的结果相一致。这些代次的持感细胞在收取群体样品时，分别进行了单细胞的挑取。我们试图用单细胞分析

22、技术窥探宿主BP基因与病毒3D基因的关系，初步探讨BP基因与持感的建立和稳定传代之间的关系，揭示影响宿主与病毒共进化进程的内在因素。AB图3-5. 正常BHK-21细胞与持感不同代次群体细胞中BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表达量A：正常BHK-21细胞与持感不同代次群体细胞中BP基因的表达量 B：正常BHK-21细胞与持感不同代次群体细胞中3D基因的表达量3.3.6 正常BHK-21细胞与传代持感单细胞中BP基因和FMDV-3D基因的正态分布在2005年，Martin Bengtsson发表了一篇在单细胞领域造成深远影响的文章，指出来自拉格汉斯胰岛（The pancreatic islets

23、of Langerhans）的单细胞基因表达谱揭示mRNA水平的对数分布特性(Bengtsson et al., 2005)。为了呈现单细胞群体的基因表达谱，我们绘制了正常细胞与各代次持感细胞BP基因和3D基因的正态分布图(图3-6)。在对数正态分布中，随机独立性是趋于增加的，同时它们是正常分布的附加产物。细菌不同克隆之间指数生长的细菌数呈现对数正态分布就是生物系统中的一个经典例子(Limpert et al., 2001)。细胞中mRNA水平基因表达的这种变化反应了真实的生物差异（biological variability）。如图3-6，本实验研究的五组细胞两种基因的表达也均符合正态分布，

24、单细胞数据真实有效，随后对其进行统计与分析并绘制相互关系图。符合对数分布的群体其峰值与几何平均值相当，即代表大部分细胞所分布的范围。如图3-6所示，在BP基因的正态分布图中，只有PI28代次的峰值（Log2.3）在正常BHK-21（Log2）右侧，说明PI28代次时阳性细胞中BP基因的表达量比正常细胞要高。在3D基因的正态分布图中，PI38代次的峰值（Log2.6）最靠右，PI68代次的峰值（Log1.7）最靠左，几乎相差了一个数量级，它们代表了口蹄疫病毒3D基因表达量最高和最低的两个细胞代次。表3-1的数据是根据正态分布图中的细胞数统计的，显示各代次细胞两种基因的阳性率情况和单细胞平均值。所

25、有单细胞均检测了其看家基因（GAPDH）的表达，参与统计的数据均代表一个细胞内基因表达的真实情况。数据显示，正常BHK-21细胞中BP的检出率最高，有96.8%的细胞都检测到了BP基因的表达。而持感细胞中BP的检出率都比正常细胞要低，可见，病毒的存在对宿主细胞BP基因的表达是有影响的。表达病毒3D蛋白的细胞比率随着持感代次的增长而趋于稳定，在早代次持感细胞PI28中，只有66.7%的细胞检测到病毒3D蛋白，说明此时的持感细胞一个混合群体，其中即有携带病毒的持感细胞，也还存在正常未感染病毒的正常细胞。而当代次到达38代时，几乎所有细胞都能检测到病毒3D基因的表达，此时的持感细胞已可以说处于病毒与

26、细胞共生的稳定状态，高代次持感细胞病毒3D基因的检测，也得到相同的结果，证实口蹄疫病毒稳定存在于宿主细胞中，形成稳定的持续感染状态。而宿主BP基因的表达量却是随着持续感染细胞代次的升高逐渐降低的。AB图3-6. 正常细胞与各代次持感细胞BP基因和3D基因的正态分布图A：正常细胞与各代次持感细胞BP基因的正态分布图；B：正常细胞与各代次持感细胞3D基因的正态分布图表3-1正常细胞和各代次持感细胞单细胞数据统计BHK-21PI28PI38PI55PI68细胞样品总数(411)9381798771BP阳性细胞数（337）（阳性率）90(96.8%)65(80.2%)55(69.6%）72(82.8%

27、)55(77.5%）3D阳性细胞数（287）（阳性率）N/A54(66.7%）78(98.7%)87(100%)68(95.8%)BP平均（copies/cell）17321510160463D平均（copies/cell）N/A42616246682003.3.7 各代次持感单细胞BP基因与3D基因的关系分析散点图3-7是以口蹄疫病毒3D基因的表达量为X轴，以BHK-21细胞BP基因的表达量为Y轴绘制而成的。同时以PI28代次3D基因的单细胞平均值绘制一条与X轴相交的竖线，以正常细胞BP基因的单细胞平均值绘制另一条与Y轴相交的横线。如将该散点图分成四个象限，R1，R2，R3，R4。R1代表B

28、P表达量高/3D表达量低区域，R2代表BP表达量高/3D表达量高区域，R3代表BP表达量低/3D表达量低区域，R4代表BP表达量低/3D表达量高区域。扇形图则是将分布于4个区域中的细胞计数，计算出百分比含量后绘制而成的。图3-7. 传代持感单细胞BP基因相对病毒3D基因散点分布图和扇形图A、B、C、D：分别为PI28、PI38、PI55、PI68代次持感细胞的散点图；E、F、G、H：分别为PI28、PI38、PI55、PI68代次持感细胞的扇形图从图3-7中可以看出，在持感细胞PI28代次时，BP基因上调的细胞比例（图E：R1+R2）最大，有高达62.9%的细胞都分布在正常BHK-21细胞BP

29、基因均值线以上。当持感细胞传代至PI38代时，宿主BP基因的表达逐渐降低，表达量低于正常细胞均值的细胞（图F：R3+R4）占总数的78.2%。单细胞中病毒3D基因表达量高于PI28代次单细胞的均值的细胞比例（图F：R2+R4）为66.7%，单个细胞中3D基因的含量最高值达17576 copies/cell。当持感细胞代次到达PI55和PI68时，病毒与宿主细胞已趋于平衡，宿主BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表达均逐渐降低，在PI68代次时降至最低值。宿主BP基因下调细胞比例（图H：R3+R4）为95.6%，病毒3D基因下调细胞（图H：R1+R3）比例为91.2%。其中代表BP基因和3D基因均上调

30、的R2区域的细胞数在PI68代次时下降到了0。代表BP基因和3D基因均下调的R3区域所占的比例随着持感代次的增加而增加，在PI68代次中达到了86.8%。这种数据只有从单细胞水平的检测分析中才能得到。3.4 讨论本实验选取了持感细胞传代过程中具有代表性的几个代次，来深入研究持感细胞不同代次中宿主BP基因与病毒3D基因的相互关系。选取的持感细胞涵盖早中晚四个代次，横跨40代，每个代次检测的单细胞数量均在70个以上，总计检测持感单细胞样品318个，具有统计学意义。并与正常BHK-21单细胞结果，一起做了比较与分析。对每一个单细胞我们都同时检测了看家基因(GAPDH)，宿主基因（BP）和口蹄疫病毒基

31、因（3D）。看家基因的检测使单细胞的数据更可信也更有说服力，也是我们确定BP基因阴性和3D基因阴性的依据。在持感细胞不同代次中，宿主BP基因和口蹄疫病毒3D基因的表达量都符合正态分布的规律，与文献报道的相符。然后我们运用该数据将所有代次持感细胞的BP基因的表达量相对于病毒3D基因作图，得到了两个基因在持感细胞不同代次中表达量的变化情况。通过对持续感染细胞代次由低到高的跟踪检测，发现在病毒与细胞共进化的过程中，存在病毒复制效率与宿主细胞基因表达之间相互制约的过程。单细胞水平的实验结果充分证实，持感细胞在其早代次PI28代时并不是每个细胞都感染上了病毒，3D基因的阳性率为66.7%，在持感细胞群体中还存在约三分之一的未感染细胞，这些未感染细胞会被持感病毒感染，成为新的持感细胞。有诸多研究表明，在持感形成的过程中细胞起到关键性的作用，是因为细胞自