分子诊断刘斌

1、分子诊断在病理诊断中的应用兰州军区总医院病理科兰州军区总医院病理科 刘刘 斌斌 肿瘤的发生根本原因是由于基因的异常改变引起。随着分子生物学的发展，特别是人类基因组计划的顺利实施、人类基因组序列的剖析、相关基因功能的识别，对肿瘤的发生、发展及转归机制有了更深入的了解，使人类除了能更早期发现及诊断肿瘤外，还可预测人群或个体发生肿瘤的风险（肿瘤易感性）、病因检测、肿瘤的恶性特征、对特定治疗手段的反应（疗效预测）、转移复发的可能与早期发现等，进行肿瘤诊断、分类、判断预后及指导治疗。 如今检测癌患者的基因状态有很多方法： ihc，fish，cish，southern blot，pcr，real time

2、 pcr。现如今fish技术已应用于实体瘤、血液肿瘤、产前产后多个领域。 荧光原位杂交荧光原位杂交fluorescence in situ hybridization 原理原理利用dna碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链dna(探针)和与其互补的目标样本的dna(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况fish检测类型 基因过表达的检测 基因突变及其检测 基因的易位与重排 染色体数目的检测 端粒酶与肿瘤的关系检测一.基因过表达检测1.对her2的检测检测方法检测方法检测指标检测指标优点优点缺点缺点ihcher2蛋白费用低光镜即可观察结果准确性差，判断主观性强

3、，假阳性、阴性率高cishher2 dna光镜即可观察结果对低倍扩增及染色体非整倍扩增检测灵敏度下降fishher2 dna对于低倍、高倍及染色体非整倍性扩增检测准确性高，灵敏度特异性好，结果判断比较客观，是her2基因检测的“金指标”相对费用较高其中fish是fda批准的方法，被誉为“金标准”。ich赫赛汀 fish技术对her2基因的检测 her-2基因为致癌基因，位于17q11.2-q12 可编码跨膜蛋白，基因有扩增的乳腺癌对三苯氧胺不敏感。 her-2基因扩增是决定herceptin是否有效的关键性指标。赫赛汀赫赛汀(herceptin)(herceptin)抗肿瘤机制抗肿瘤机制阻断异

4、常信号转导阻断异常信号转导增强抗体依赖性细增强抗体依赖性细胞毒作用胞毒作用乳腺癌和胃癌中her2基因的扩增比率 所做乳腺癌中her2基因检出阳性率为65%；胃癌中her2基因检出阳性率为35.7%。标本her2总数阳性例数乳腺癌2617胃癌145总计40例2.非小型细胞肺癌中egfr基因扩增的检测 egfr扩增egfr无扩增 nsclc中egfr基因扩增鳞癌扩增为鳞癌扩增为80%80%左右，腺癌与大细胞癌为左右，腺癌与大细胞癌为60%60%左右左右基因扩增能引起基因扩增能引起egfregfr酪氨酸激酶活化，激发其下游一系列信酪氨酸激酶活化，激发其下游一系列信 号传导途径，促进肿瘤发生发展，基因

5、扩增与酪氨酸激酶抑制号传导途径，促进肿瘤发生发展，基因扩增与酪氨酸激酶抑制 剂的敏感性相关剂的敏感性相关基因扩增病人用药有效率达基因扩增病人用药有效率达38.9%38.9%，无扩增的病人用药有效率，无扩增的病人用药有效率在在9.8%9.8% egfr功能 egfr在多种上皮性肿瘤高表达, 其过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关, 最终导致细胞的转化、增殖, 抵抗细胞凋亡、促进细胞生存, 与肿瘤的发生、发展、临床分期、生存期、预后和对治疗反应相关。tkgene transcriptioncell cycle progression抗凋亡抗凋亡canceratpe

6、gfregfr变异变异目前应用于nsclc的靶向治疗药物 吉非替尼吉非替尼(gefitinib, zd-1839,商品名iressa 2003 fda approved) 厄洛替尼厄洛替尼 (erlotinib,osi-774,商品名tarceva 2004 fda approved) 西妥昔单抗西妥昔单抗: : (cetuximab fda 2004 approved) 二.基因突变及其检测real-time检测基因突变原理taqman taqman 探针的机理探针的机理:dna:dna聚合酶在延伸阶段把探针切碎，产荧光基团和聚合酶在延伸阶段把探针切碎，产荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光

7、得以检测。荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测。egfr基因突变基因突变 突变率在33%左右，其中腺癌高达48%（董强刚等 2006） 东方亚裔明显高于高加索人种、女性高于男性、非吸烟高于吸烟 egfr19、21外显子的突变占95%左右 egfr 变异使egfr 酪氨酸激酶atp结合位点的某些关键基团发生重构, 使得小分子酪氨酸激酶抑制剂更易与之结合，增强了与atp竞争性抑制剂的相互作用 全球突变型nsclc用iressa/tarceva有效率约80%； 无突变nsclc用ressa/tarceva有效率约10%。 real-time检测检测 egfr 19、21突变突变k-rask-ras基因

8、突变的检测基因突变的检测kras基因属于ras家族的一员，包括k-ras,n-ras,h-ras具有gtp酶活性，活化状态与gtp结合，失活与gdp结合，绝大部分细胞是与gdp结合的非活化状态参与调节细胞生长、增殖、分化与凋亡15-20%的nsclc存在ras基因突变，其中90%以上是k-ras突变，12号密码子的突变占80%以上。而腺癌的病人突变占30%，k-ras突变与吸烟密切相关，终生未吸烟的未发现k-ras基因突变与egfr基因突变存在排斥性是gefitinib与erlotinib原发耐药的分子标记之一 在直肠癌中k-ras基因突变的患者不会从egfr单抗靶向治疗中获益，k-ras野生

9、型患者对cetuximab/erbitux（爱必妥）和panitumumab/vectibix（维克替比）单药或与基础化疗联合治疗的反应率显著大于突变型患者。野生型 现临床通常将egfr和k-ras基因联合检测，来针对非小细胞肺癌进行靶向治疗，对拟行tki治疗的患者，可以首先检测kras突变状态，排除阳性后对kras阴性者进行egfr突变检测；若egfr突变阳性，选择tki治疗。 三.基因的易位与重排1.慢性淋巴细胞白血病（cll）检测 通过对p53、rb1、d13s25、atm基因以及12号染色体检测来判断预后。 2.慢性粒细胞白血病（cml）检测bcr/abl融合基因1.辅助诊断cml2.

10、指导格列卫用药3.药物使用效果评估4.骨髓移植效果评估bcr/abl基因融合正常细胞3.急性早幼粒细胞白血病（m3）检测pml/rara融合基因。 指导全反式维甲酸(all trans-retinoic acid，atra) 用药atra治疗机制是靶向降解pml/rara融合蛋白，促进阻滞在早幼粒细胞阶段的白血病细胞分化成熟。pml/rara融合基因正常细胞3.性染色体骨髓错配移植检测 用于监测性染色体错配的骨髓移植效果 女性患者骨髓移植前 女性患者骨髓移植后四.染色体数目的检测 不明原因流产中较为常见的有x单体，发生率约为20%；16号三体，发生率约为16%；18号三体，发生率约为3%；21三体，发生率约为5%；22三体，发生率约为5%。进行染色体检测可以为下一胎妊娠遗传咨询提供资料。 21三体13三体 其它项目一一. .基因重排在淋巴瘤诊断中的应用基因重排在淋巴瘤诊断中的应用它在淋巴瘤的分型、疗效评价、预测复发和预后评估等方面有重要的临床意义。二二. .端粒酶与肿瘤的关系检测端粒酶与肿瘤的关系检测 由于terc（telomerase of rna component ）基因编码端粒酶的rna组分，维持端粒的长度，该基因的扩增使得端粒稳