细胞培养概述918

1、内内 容容o细胞培养概述细胞培养概述o细胞培养细胞培养简史简史o细胞类型及其形态细胞类型及其形态o生长特点和生长过程生长特点和生长过程一 细胞培养概述医学中泛指的体外培养（医学中泛指的体外培养（in vitro）o ht-1080 人皮肤纤维肉瘤细胞株黑色素瘤细胞 单克隆细胞培养定义细胞培养定义u 优点：优点：1 1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2 2可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3 3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组

2、织化学、原位杂交、同位素标记；流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4 4应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常（肿应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常（肿瘤）；瘤）；u 缺点：缺点： 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。境中，时间久了，必然发生变化。 二 细胞简史o 动物细胞体外培养的历史可追溯到动物细胞体外培养的历史可追溯到19071907年年，美国生物学，美国生物学家家harrisonharriso

3、n在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。养法。o 在随后的近一个世纪里，随着细胞生物学、培养系统及在随后的近一个世纪里，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领城的不断丰富和完善，动物细胞培养技术培养方法等领城的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的有重要医用

4、价值的酶、生长因子、疫苗和单抗酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。大规模动物细胞培为医药生物高技术产业的重要部分。大规模动物细胞培养在生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。养在生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。细胞培养简史细胞培养简史historical events in the development of cell cultureo1878: claude bernard proposed that physiological systems of an organism can be maintained in a living system a

5、fter the death of an organism.o1885: roux maintained embryonic chick cells in a saline culture.o1897: loeb demonstrated the survival of cells isolated from blood and connective tissue in serum and plasma.o1903: jolly observed cell division of salamander leucocytes in vitro.o1907: harrison cultivated

6、 frog nerve cells in a lymph clot held by the hanging drop method and observed the growth of nerve fibers in vitro for several weeks. he was considered by some as the father of cell culture.o1910: burrows succeeded in long term cultivation of chicken embryo cell in plasma clots. he made detailed obs

7、ervation of mitosis.contd.o 1911: lewis and lewis made the first liquid media consisted of sea water, serum, embryo extract, salts and peptones. they observed limited monolayer growth.o 1913: carrel introduced strict aseptic techniques so that cells could be cultured for long periods.o 1916: rous an

8、d jones introduced proteolytic enzyme trypsin for the subculture of adherent cells.o 1923: carrel and baker developed carrel or t-flask as the first specifically designed cell culture vessel. they employed microscopic evaluation of cells in culture.o 1927: carrel and rivera produced the first viral

9、vaccine - vaccinia.o 1933: gey developed the roller tube technique.contd.o1940s: the use of the antibiotics penicillin and streptomycin in culture medium decreased the problem of contamination in cell culture.o1948: earle isolated mouse l fibroblasts which formed clones from single cells. fischer de

10、veloped a chemically defined medium, cmrl 1066.o1952: gey established a continuous cell line from a human cervical carcinoma known as hela (helen lane) cells. dulbecco developed plaque assay for animal viruses using confluent monolayers of cultured cells.o1954: abercrombie observed contact inhibitio

11、n: motility of diploid cells in monolayer culture ceases when contact is made with adjacent cells.o1955: eagle studied the nutrient requirements of selected cells in culture and established the first widely used chemically defined medium.o1961: hayflick and moorhead isolated human fibroblasts (wi-38

12、) and showed that they have a finite lifespan in culture.o1964: littlefield introduced the hat medium for cell selection.o1965: ham introduced the first serum-free medium which was able to support the growth of some cells.contd.o1965: harris and watkins were able to fuse human and mouse cells by the

13、 use of a virus.o1975: kohler and milstein produced the first hybridoma capable of secreting a monoclonal antibody.o1978: sato established the basis for the development of serum-free media from cocktails of hormones and growth factors.o1982: human insulin became the first recombinant protein to be l

14、icensed as a therapeutic agent.o1985: human growth hormone produced from recombinant bacteria was accepted for therapeutic use.o1986: lymphoblastoid ifn licensed.o1987: tissue-type plasminogen activator (tpa) from recombinant animal cells became commercially available.o1989: recombinant erythropoiet

15、in in trial.o1990: recombinant products in clinical trial (hbsag, factor viii, hivgp120, cd4, gm-csf, egf, mabs, il-2).细胞培养技术的发展细胞培养技术的发展三 细胞的形态和类型细胞来源细胞来源o 成纤维型细胞（成纤维型细胞（fibroblast-liked cells）o 上皮型细胞（上皮型细胞（epithelium-liked cells）o 其它，不定型其它，不定型 细胞生长方式和类型细胞生长方式和类型按生长方式按生长方式 贴壁型细胞（贴壁型细胞（monolayer cel

16、ls） 悬浮型细胞（悬浮型细胞（suspension cells）l 绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。浮状态下生长。按细胞形态按细胞形态(贴壁细胞）贴壁细胞） 成纤维型细胞（成纤维型细胞（fibroblast-liked cells） 上皮型细胞（上皮型细胞（epithelium-liked cells） 其它，不定型其它，不定型 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些

17、特征。形态各异反映其胚层起源。在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。 如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。细胞型。o成纤维型细胞成纤维型细胞o皮型细胞皮型细胞o游走型细胞游走型细胞o多形型细胞多形型细胞 成纤维型细胞成纤维型细胞梭形或不规则三梭形或不规则三角形角形中央有卵圆形核中央有卵圆形核胞质向外伸出长胞质向外伸出长短不同的突起短不同的突起中胚层中胚层间质起源间质起源 上皮型细胞上皮型细胞扁平不规则多角形扁平不规则多角形细胞中央有圆形核细胞中央有圆形核紧密相连单层膜样紧密相连单层膜样生长生长内、外

18、胚层细胞内、外胚层细胞如如皮肤、表皮衍生物、皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等消化管上皮等 游走型细胞游走型细胞散在生长，一般散在生长，一般不连成片不连成片细胞质经常伸出细胞质经常伸出伪足或突起伪足或突起活跃的游走或变活跃的游走或变形运动形运动羊水细胞羊水细胞培养的培养的早期早期多形细胞型多形细胞型 难以确定规难以确定规律和稳定的律和稳定的形态形态 如如神经组织神经组织的细胞等的细胞等 贴壁型细胞形态贴壁型细胞形态 由于难以确定其形态而得名。如吞噬细胞常属此类。由于难以确定其形态而得名。如吞噬细胞常属此类。o 更多精彩图片请上网搜索，如“生物秀”。l 用普通用普通显微镜显微镜观察观察，细胞功能健康

19、活跃时，呈现均质而透明，细胞功能健康活跃时，呈现均质而透明的，结构极不明显。的，结构极不明显。l 用相差显微镜用相差显微镜观察，观察，可看清细胞的轮廓和内部结构。可看清细胞的轮廓和内部结构。l 用固定染色法和特殊技术可显示细胞器等结构。用固定染色法和特殊技术可显示细胞器等结构。用用anti-vimentin和和tritc染中间丝染中间丝vimentin蛋白（红色），蛋白（红色），fitc-phalloidin染染f-actin（绿色），（绿色），dapi染核（蓝色）。染核（蓝色）。 （荧光显微镜（荧光显微镜40x ）l 一般显微镜下一般显微镜下细胞轮廓会增强，反差增大。细胞轮廓会增强，反差增大

20、。l 用相差显微镜可看用相差显微镜可看到到在胞质中出现颗粒、脂滴和空泡等，反在胞质中出现颗粒、脂滴和空泡等，反差很大的暗色小颗粒是变形的线粒体。差很大的暗色小颗粒是变形的线粒体。四 贴壁型细胞的生长特点贴壁型细胞的生长特点贴壁型细胞的生长特点o贴附和伸展贴附和伸展o接触抑制接触抑制o生长的密度限制生长的密度限制贴附和伸展（贴附和伸展（attached and strench)o 多数体外培养细胞的多数体外培养细胞的基本生长基本生长特点。特点。接触抑制接触抑制（contact inhibition）o 细胞相互接触时，将细胞相互接触时，将停止增长；停止增长；o 细胞停留在细胞周期细胞停留在细胞周

21、期的的g0g0期；期；o 正常细胞并不互相重正常细胞并不互相重叠生长，但转化的细叠生长，但转化的细胞或肿瘤细胞却可以胞或肿瘤细胞却可以继续生长导致细胞重继续生长导致细胞重叠堆积生长。叠堆积生长。生长的密度限制生长的密度限制生长过程生长过程o 单个细胞单个细胞的生长过程的生长过程细胞周期细胞周期（cell cycle）o 细胞系细胞系的生长过程的生长过程培养细胞的生命周期培养细胞的生命周期o 每代细胞每代细胞的生长过程的生长过程细胞系的生长过程细胞系的生长过程o原代培养（初代培养）期原代培养（初代培养）期o传代期传代期o衰退（老）期衰退（老）期原代培养（原代培养（primary culture）

22、期）期o 也称初代培养。o 即从体内取出组织按种培养到第一次传代阶段，一般持续14 周。o 此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。o 初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性小。o 如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（cloning efficiency）很低，即细胞独立生存性差。 原代培养原代培养 （primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 克隆克隆（clone

23、）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 细胞系细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 细胞株细胞株（cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。 原代培养期与细胞系原代培养期与细胞系 the american type culture collection (atcc)atcc（american type culture collection）为美国）为美国典型培养物保藏中心，是

24、世界上最大的保存生物种类和数量典型培养物保藏中心，是世界上最大的保存生物种类和数量最多的机构，保存微生物藻类、原生动物、细胞株等约最多的机构，保存微生物藻类、原生动物、细胞株等约29000株。细胞株价格一般在株。细胞株价格一般在4000人民币人民币/株左右，一般株左右，一般1到到2个月到货，基本上以冻存管的形式提供。个月到货，基本上以冻存管的形式提供。 the european collection of animal cell culture (ecacc) national institute of health (nih), usa national cancer institute (nci), usa细胞系资源细胞系资源传代培养期（传代培养期（ passagepassage） 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，有一定的界限，称为称为“ hayflick极限极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代年，传代12次；龟寿命次；龟