青岛科技大学海洋生物技术期末复习

1、青岛科技大学海洋生物技术期末复习基因工程1. 基因是能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA)的DNA序列。ü 分类：根据产物的类别可以分为蛋白质基因和RNA基因（rRNA基因和tRNA基因）两大类；ü 根据产物的功能可以分为结构基因（酶和不直接影响其他基因表达的蛋白质）和调节基因（阻遏蛋白或转录激活因子）两大类。2.基因工程或称基因重组技术，是将不同生物的基因在体外人工剪切、组合,并和载体（质粒，噬菌体，病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。3.基因工程的操作包含以下步骤：· 获得目的基因·

2、构造重组 DNA 分子·转化或转染·表达· 蛋白质产物的分离纯化 4.克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。5.克隆化（cloning）包括：1.获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。2.分子克隆（DNA克隆）3. 细胞克隆个体克隆（动物或植物）6.DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源 的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子,又称基因 克隆。7.工具酶：限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 DNA连接酶 末端转移酶 Taq D

3、NA聚合酶(1)限制性核酸内切酶定义：识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。粘性末端：5´-端突出，3´-端突出 平末端:限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。目的基因：应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。1. cDNA是指经反转录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链 cDNA为模板,经聚合反应可合成双链cDNA。2. 基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息

4、的所有DNA序列。3.基因载体（vector）:能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。4.常用的载体：质粒、噬菌体DNA、病毒DNA5.载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子相对较小，一般3-10 Kb6.质粒:是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1 3个抗药性基因，以利于筛选。重组DNA技术基本原理原理部分目的基因的获取1.化学合成法:用于已知序列，或可推导出序列

5、的基因2.基因组DNA:基因组DNA文库（genomic DNA library）3.cDNA:cDNA文库4.聚合酶链反应PCR8.基因组DNA文库：存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G文库。9.cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c文库。10. PCR的基本原理原料：4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+反应过程：高温变性、低温退火、适温延伸。11.克隆载体的选择构建目的（构建gDNA或cDNA文库类型、和表达、亚克隆等不同目的）选择对应的载体；考虑载体中酶切位点是否合适；根据待克隆的目的基因片

6、段的大小选择合适的载体。（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接2. 平端连接:限制性内切酶作用产生的平端；粘端经特殊酶处理变为平端3. 同聚物加尾连接:由末端转移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。4. 人工接头:由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件：安全宿主菌、处于感受态导入方式：转化（transformation）转染（transfaction） 若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是 动/植物细胞，通常称转染。（五）重组体的筛选：重组DNA导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设

7、法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。1. 直接选择法针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。（1）抗药性标记选择（插入失活法）:将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中，则tetr基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。（2）标志补救（marker rescue） 若目的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对营养素的依赖表型来筛选。 （3）分子杂交法：利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子D

8、NA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。两种方法：原位杂交，Southern印迹 （4）酶切鉴定（5）菌落PCR （6）序列分析（六）克隆基因的表达 表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立 表达产物的检测表达产物的分离、纯化复习思考题：1. 概念：（1）克隆（2）转化（3）基因工程（4）限制性核酸内切酶（5）载体（6）G文库（7）质粒（8）c文库2. 简述基因工程的基本过程。3. 简述目的基因的主要来源或途径。参考答案：（1）人工合成（2）cDNA (3)G-DNA (4)PCR 4. 已知某一基因的DNA单链 5¢ATGGGCTACTCG3¢ (

9、1)写出DNA复制时另一条单链的核苷酸序列。 (2) 以该链为模板转录成RNA序列。（3）合成的多肽序列。 参考密码子： UAC 酪氨酸 CCG脯氨酸 CGA精氨酸 CAU组氨酸 AUG蛋氨酸 AGC丝氨酸 GUA缬氨酸 GCC丙氨酸 答案：5¢ATGGGCTACTCG3¢ DNA (1) 3¢TACCCGATGAGC5¢ DNA (2) 3¢UACCCGAUGAGC5¢ mRNA (3) 5¢CGA GUA GCC CAU3¢ N ArgVal Ala His C 多肽链5. 在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真

10、核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA？为什么要在cDNA前加上细菌的启动子？ 提示 关键点：真核生物有内含子 6. 某一质粒基因载体具有Tet抗性和Kan抗性的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl ll的切点。先用Bgl ll切割该载体进行基因克隆，问(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素？（2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？ 7.怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR限制位点中去？8.如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码蛋白的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。9.说明合成接头在基因工程中的主要作用动物基因工程1

11、.转基因动物：用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。特点：分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达。基本原理将目的基因导入实验动物的受精卵或着床前胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或胚胎细胞移植入受体动物的输卵管或子宫内，使其发育成携带有目的基因的转基因动物。制作转基因动物的主要方法n DNA显微注射法n 电脉冲导入法n 精子载体法n 逆转录病毒感染法1.显微注射法是基因转移中应用最广泛和最成功的方法之一。 显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。优点：将外源DNA

12、片段直接注入受精卵原核，使外源DNA随机整合到寄主基因组中，整合效率高，并且多数基因能够表达。缺点：受生物种类的影响；操作复杂，工作效率低。2.电脉冲导入法3.精子载体法定义：将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。精子作为外源基因的转移载体依赖于将外源基因先“装载”到精子细胞中。常用的装载方法有：脂质体介导促进精子对外源基因的吸收；电脉冲介导促进精子对外源基因的吸收；精子结合外源 DNA的机制 用精子载体法成功的获得转基因动物，精子与外源DNA共孵育期问有3个关键步骤： 与精子的结合内化入精子头部在精子基因组中的整合精子结合外源 DNA的

13、定位及去向 定位：主要位于精子头部的赤道段和顶体后区，而且主要吸附于精子头部表面，少数侵入到精子核区。 去向：穿入精子核区的外源DNA首先紧密结合在核骨架上，随后与精子细胞基因组发生重组，且重组不是随机发生，精子细胞基因组上可能存在某些优先选择的重组位点。影响精子与外源 DNA结合及结合后基因转移的因素 n较长的DNA片段与较短的DNA片段相比更容易被精子摄取n脱氧核糖核酸酶对外源DNA有降解 n较高浓度的DNA易引起胚胎的死亡n精子来源不同生殖细胞的精子由于可跟卵子形成受精卵，将它制作为外源基因转移载体来制备转基因动物，具有操作简单、耗费低、转染率高、适应性广等特点外源基因的检测1、染色体和

14、基因水平的检测（1）PCR （2）Southern印迹杂交 （3）DNA斑点杂交2、转录水平的检测（1）Northern印迹杂交 （2）RNase保护分析（3）RT-PCR3、蛋白质水平的检测 Western印迹杂交报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控. 由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术有了广泛的应用. 常用的报告基因氯霉素乙酰转移酶基因 荧光素酶基因 绿色荧光蛋白基因 细胞工程1. 定义:在细胞水平运用各种生物技术，能够达到细胞产物或细胞及组织本身的规模生产2. 分类 1. 染色体工程：按照人们需要来添加或削减一种生物的染色体

15、，或用别的生物的染色体来替换。可分为动物染色体工程和植物染色体工程两种2. 染色体组工程：整个改变染色体组数的技术3. 细胞质工程：又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建新细胞。4. 细胞融合工程:用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。可用于产生新的物种或品系及产生单克隆抗体。3. 1.原代细胞：直接从动物体机体取得细胞，加以培养。此细胞传代至10代左右 即 停止。2.细胞株 ：少数情况下，有些细胞可以传代至10代以上，甚至50代左右仍能保持原来的染色体二倍体数量及原细胞主要特征。3.细胞系：细胞株中如发生遗传突变

16、，有可能无限制的遗传下去。4. 动物细胞生长特点：帖附生长、悬浮生长5. 单克隆抗体的 制备鱼类细胞培养 1.鱼类细胞原代培养的方法包括： （1）组织块固定法 （2）机械分散法 （3）络合剂分散法 （4）酶消化法2.各种方法适用条件n 当组织量较少时，可以采用组织块固定法；n 机械分散法适于细胞间连接较松散的组织 ，如胚胎组织及幼鱼全鱼；n 络合剂分散法是用 EDTA等螯合剂将细胞间的钙 、镁离子结合掉，而使细胞间连接松散，主要用于囊胚细胞培养；n 酶消化法是 目前鱼类细胞培养中最为常用的方法，胰蛋白酶质量分数为 02505。海洋藻类基因工程 1定义 人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚

17、芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。制作 体细胞胚与藻酸钠混合后，滴入到硝酸钙或CaCl2中，20分钟后，表面聚合，形成人工种子2植物细胞杂交的主要过程如下： 原生质体的制备 原生质体的融合 杂合体的鉴别与筛选3植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较项目细胞融合原理细胞融合方法诱导手段用途植物体细胞杂交细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合离心、振动电剌激、聚乙二醇诱导克服远源杂交不亲和的障碍，获得杂种植株动物细胞融合细胞膜的流动性使细胞分散开，诱导细胞融合同上，还可用灭活的病毒诱导制备单克隆抗体脱分化(去分化)： 由高度分化的

18、植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。再分化：脱分化产生的愈伤组织重新分化成根、芽等器官的过程。原生质体材料的选择和预处理年龄：早期营养细胞 部位：靠近基部的营养细胞 预处理：消毒海水反复冲洗，直至无附着杂藻为止原生质体的融合大型海藻的细胞融合，常见的有自发融合和诱导融合酶解法去壁 纤维素酶 果胶酶人工诱导融合的方法： 物理法：离心 振动 电刺激 化学法：聚乙二醇 PEG融合细胞的筛选大型海藻杂种细胞的识别通过三种方法进行鉴定。人工标记：中性红标记法 遗传标记：叶状体的颜色因种而异融合体与双亲细胞的差异：融合体的体积比双亲原生质的体积大主要采用显微操作法从融合液中分离异源融合体，进行单独培养

19、。习题部分1 用植物组织培养技术，可以培育或生产出A.食品添加剂 B.无病毒植物 C.人工种子 D.以上三者均是2 植物体之所以具有不同的组织器官是由于A.基因选择表达的结果 B.部分基因功能丧失的结果C.分成不同基因细胞的结果 .D.外界环境影响的结果3 番茄和马铃薯杂交过程不需要的细胞结构是 A 细胞膜 B.细胞壁 C.细胞核 D.高尔基体4 杂种细胞的原生质融合是A.不同细胞的原生质直接融合在一起形成 B.并没有实现融合的两部分 C.必需通过人工诱导才能实现细胞融合 D.只有细胞核融合6 植物组织培养形成的愈伤组织进行培养， 又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为： A、脱分化 B、去

20、分化 C、再分化 D、脱分化或去分化7 下列不能作为植物组织培养的材料是：A、秋海棠的叶 B、马铃薯的块茎C、成熟的花粉 D、木质部中的导管细胞8 植物体细胞杂交尚未解决的问题有：A、去掉细胞壁,分离出有活力的原生质体B、将杂种细胞培育成植株C、让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良性D、尚未培育出属间杂种植物9不能人工诱导原生质体融合的方法是：A、振动 B、电刺激、 C、PEG试剂、 D、重压10 用动物细胞培养技术使细胞传到50代以后仍能传下的传代细胞称为（ ） A.原代细胞 B.传代细胞 C.细胞系 D.细胞株11 “生物导弹”是指（ ）A.单克隆抗体 B.带有特定药物的单克隆抗体 C

21、.杂交细胞 D.淋巴细胞12 能加快良种家畜繁殖能力的细胞工程技术是（ ）A.组织培养 B.细胞融合 C.胚胎移植 D.细胞核移植13 下列细胞中发育有癌变特点，可能在培养条件下，无限传代下去的这种传代细胞称之为（ ）A.原代细胞 B.细胞株 C.细胞系 D.胚胎细胞14 为了便于培养的动物组织细胞分散开来，配制成一定浓度的细胞悬浮液，选取来的动物组织应先用下列哪种物质处理（ ）A.胃蛋白酶 B.盐酸 C.胰淀粉酶 D.胰蛋白酶15 在动物细胞培养中，所培养的动物细胞大都取自（ ）A.中年动物器官 B.老龄器官 C.幼龄器官 D.中年动物组织16 表现型不同的母牛生育出基因型完全相同的小牛，产

22、生这一结果 最可能的原因是（ ）A.试管动物培养 B.胚胎移植 C.胚胎分割移植 D.受精卵移植17 下列细胞中，不能培养的细胞是( )A.心肌细胞 B.神经细胞 C.根的皮层细胞 D.木质部导管细胞18 有人做了如下实验：用玻璃针移除两栖类卵细胞中的细胞核，然后用玻璃微吸管将蝌蚪胸腺细胞的细胞核注入去卵核的细胞内。经特殊方法刺激，此卵细胞有可能分裂发育成蛙。请根据以上实验回答。(1)此实验属于细胞工程中的 技术，实验中卵细胞被称为 细胞；(2)由此培育出来的蛙，遗传物质是来自 ，合成蛙胚细胞DNA和蛋白质的原料来自 和 。19 现有甲、乙两个烟草品种（2n=48），其基因型分别为aaBB和

23、AAbb，这两对基因位于非同源染色体上，且在光照强度大于800勒克斯时，都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因(aa和bb)作用的结果 取甲乙两品种的花粉分别培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体，并将两者相混，使之融合，诱导产生细胞团。然后，放到大于800勒克斯光照下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。请回答下列问题：(1)甲、乙两烟草品种花粉的基因型分别为 和 ；(2)将叶肉细胞制成原生质体时，使用 破除细胞壁；(3)在细胞融合技术中，常用的促融剂是 ；(4)细胞融合后诱导产生的细胞团叫 ；(5)在大于800勒克斯光照下培养，有 种细胞团不能分化；能分化的细胞团是由

24、 的原生质体融合来的（这里只考虑2个原生质体的相互融合）；由该细胞团分化成发育成的植株，其染色体数是 ，基因型是 ；该植株自交后代中，在大于800勒克斯光照下，出现不能生长的植株的概率是 。答案：DABCC DCDCB CCDCCD 18.细胞核移植 受体 蝌蚪胸腺细胞 蛙卵细胞中脱氧核苷酸 蛙卵细胞中氨基酸 19.aB Ab 纤维素酶 聚乙二醇(PEG) 愈伤组织 2 2 甲乙 48 AaBb 7/16一、名词解释 细胞工程 基因组DNA文库 末端转移酶 精子载体法二、选择题1已知某一基因的DNA单链5，ATGGCATAG3，以该链为模板转录成的RNA序列为 （ ）A、5，ATGGCATAG

25、3， B、5，TACCGTATC3， C、5，GATACGGTA3， D、5，CTATGCCAT3，2. 下列哪一项属于克隆（ ） A、 将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B、 将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C、将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞 D、将某种瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系3. 植物体之所以具有不同的组织器官是由于 （ ） A、 基因选择表达的结果 B、 部分基因功能丧失的结果C、分成不同基因细胞的结果 D、 外界环境影响的结果4. 表现型不同的母牛生育出基因型完全相同的小牛，产生这一结果 最可能的原因是（ ）A、试管动物培养 B、胚胎移植 C、

26、胚胎分割移植 D、受精卵移植5. 通过诱变育种培育的是（ ）A、三倍体无子西瓜 B、青霉素高产菌株C、二倍体无子番茄 D、八倍体小黑麦6. 基因型为AaBb的水稻自交，自交后代中两对基因都是纯合的个体占总数的（ ）A、2/16 B、4/16 C、6/16 D、8/16三、填空题 1. 聚合酶链反应（PCR技术）是一项 的专门技术，其包括 、 和 三个步骤。 2. 细胞核移植技术操作主要包括 、 和 。 3限制性核酸内切酶识别特异序列，并在识别位点或其周围切割 的一类内切酶。 4cDNA是指经反转录合成的，与 互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。5. 制作转基因动物的主要方法是 、 、 和逆转录病毒法。6. 植物细胞培养和动物细胞培养的原理分别是 和细胞的增