2at2005101823234152306

1、三、酶的作用原理（一）分子过渡态和分子活化能 活泼态与常态之间的能量差，也就是分子由常态转变为活化状态（分子过渡态）所需的能量就成为活化能。可见下图祥解： 酶可降低所催化反应的活化能spesestepst反应进行方向反应能量变化无酶时所需能量有酶时所需能量差別在那里？t = transition state（二）中间产物学说 酶如何使反应的活化能降低，目前比较圆满的解释是中间产物学说。即没在催化反应时，酶首先与底物结合形成一个不稳定的中间产物es（也称中间络合物）。然后es再分解为产物和原来的酶： e+sese+p 酵素動力學的基本出發點es+p+es 的生成量與消失量相等，故平衡時 es 濃

2、度成一穩定狀態。seejuang rh (2004) bcbasics（三）酶作用专一性的机制酶作用专一性的机制 酶在催化化学反应时要和底物形成中间产物酶底物是如何形成中间产物的？先后提出了不同的学说，主要的有“锁钥学说”和“诱导契合学说”。但目前被大家所承认的是后者。它是在1958年由d.e.koshland提出的，其主要观点是：当酶与底物作用时，在底物的诱导下。酶的空间构象发生变化，使活性部位上的有关基团达到正确的排列方向，因而使酶和底物契合而形成中间产物，并引起底物发生反应。n锁钥学说锁钥学说（18941894年年emil fischeremil fischer）lock and key

3、lock and key或或模板模板学说学说（temolatetemolate）：认为整个酶分子的天然构象是认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。（酶的多底物现象、酶对正反方向的催化酶的多底物现象、酶对正反方向的催化、相对专一性相对专一性）n诱导契合学说诱导契合学说（19581958年年 d.koshlandd.koshland) )_ _induced fitinduced fit：该该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定学说认为酶表面并没有一种

4、与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状状, ,从而有利于底物的结合。从而有利于底物的结合。概括其要点：四个方面概括其要点：四个方面诱导契合学说的要点诱导契合学说的要点a.酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板板b.底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）结合）c.当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。形成正确的排列。d.在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆在酶反应过程中，

5、酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。的构象。“三点附着”学说：其观点是立体对映的一对底物虽然基团相同，但空间排列不同。这就可能出现这些基团与酶分子活性中心的结合j基团能否互补匹配的问题，只有三点都互补匹配时，酶才作用于这个底物。如果因排列不同，则不能三点匹配，酶不能作用于他。这可能是酶只对l-型（或d型）底物作用的立体构型专一性的机理。a.互补匹配，能进行作用酶底物不匹配，不能作用n在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底在

6、酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做加的效应叫做邻近效应邻近效应。n定向效应：定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于间的分子轨

7、道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。1.1.邻近效应邻近效应（proximity effectproximity effect）和定向效应和定向效应（orientation effectorientation effect）（四）使酶高效率的因素 临近定向 是指底物和酶活性部位的临近，对于双分子反应来说也包含酶活性部位上底物分子之间的临近，而互相靠近的底物分子之间以及底物分子与活性部位的基团之间还要有严格的定向（正确的立体化学排列）。这样可大大提高了活性部位上底物的有效浓度，使分子间反应近似于分子内反应

8、，同时还为分子轨道交叉提供了有利条件，使底物进入过渡时的熵变负值减小，反应活化能降低，从而大大增加了底物与酶中间产物进入过渡态的几率。jenck等人指出该效应可能使反应速度增长108倍，这与许多酶催化效率的计算是很相近 的。 实际上提高酶反应速度最主要的方法就是使底物分子进入酶的活性中心，这样可大大提高活性中心区域内的底物的有效浓度，而化学反应的速度是与浓度成正比的。 靠近效应可提高酶化学反应速度可由一个有机实验来证实。例如有机上面的成酯反应，若是分子间反应，其速度若为1的话，那么，分子内反应可为305，这就是因为分子内反应可提高反应基团有效浓度的结果。 在反应中。仅有靠近还不够，还需要反应的

9、基团彼此相互严格的定向。只有既靠近有定向，反应分子才被作用迅速形成过渡态（如下图所示）。 a.反应物的反应基团和催化基团既不靠近，也不彼此定向b.两个基团靠近，但不定向，也不利于反应c.两个基团既靠近，又定向，大大有利于底物形成过渡态，加速反应邻近与定向（轨道定向）效应的示意图 2 2。酶使底物分子中的敏感键发生变形。酶使底物分子中的敏感键发生变形（distortiondistortion）（底物形变）（底物形变）n酶酶- -底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲

10、变形，从而使底物甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成于过度态的中间产物形成, ,从而降低了反应的从而降低了反应的活化能。（活化能。（ 底物结合可以诱导酶分子构象的变化，而变化的酶分子又可使底物分子的敏感键产生“张力”，甚至“形变”，从而促进酶-底物中间产物进入过渡态。这实际上是酶与底物诱导契合的一个动态过程。羧肽酶a的x-衍射分析结果证明了“电子张力”的存在。）底物分子发生变形底物分子和酶分子都发生变形底物和酶结合时的构象变化示意图3. 3. 共价催化共价催化 （covalent catalys

11、is）n催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化共价催化。n酶中参与共价催化的基团主要包括以下酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团：亲核基团： his his 的咪唑基，的咪唑基，cys cys 的巯基，的巯基，asp asp 的羧基，的羧基，ser ser 的羟的羟基等；基等；亲电子基团：亲电子基团：h h+ + 、mgmg2+2+、 mnmn2+2+ 、fefe3+3+n某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参某些辅酶，如焦

12、磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。与共价催化作用。 共价催化可以提高反应速度的原因需要从有机模式反应的机理来理解。共价催化的最一般形式是催化剂的亲核基团（nucleophilic group）对底物中亲电子的碳原子进行攻击。亲核基团含有多电子的原子，可以提供电子，它是有效的催化剂。亲核基团作为强有力地催化剂对提高反应速度的作用可由下面亲核基团催化酰基的反应中看出：第一步，亲核基团（催化剂y）攻击含有酰基的分子，形成了带有亲核基团的酰基衍生物，这种催化剂的酰基衍生物作为一个共价中间物再起作用；第二步，酰基从亲核的催化剂上再转移到最终的酰基受体上： （1）亲核基团（y）催化的反应：

13、第一步 rx + y ry+x- （快） （酰基供体） （酰化了的催化剂） 第二步 ry +h2o roh + y+ h+ （快） 二步合并 rx + h2o roh +x-+h+ （快） （2）非催化的反应： rx +h2o roh +x-+h+ （慢） 从上面的反应可以看出，形成不稳定的共价中间物可以大大加速反应。在酶反应中可以进行共价催化的、强有力的亲核基团很多，在酶蛋白分子上至少有三种，即丝氨酸上的羟基、半胱氨酸上的巯基和组氨酸上的咪唑基。此外，辅酶中还含有另外一些亲核中心。共价结合也可被亲电子基团催化，最典型的亲电子基团就是h+，还有mg2+、mn2+及fe3+。蛋白质中的酪氨酸羟基

14、及-nh3+等也属于此类，它们可以接受电子或供出电子。 亲核基团 亲电子的基团 ch2o h 丝氨酸羟基 ch2 s h 半胱氨酸巯基 ch2c=ch hn n c h 组氨酸咪唑基 蛋白质中三种主要的亲核基团4、酸碱催化（acid-base catalysis）：这里指的是广义的酸碱催化，即指的是质子供体及质子受体的催化。发生在细胞内的许多反应类型是受广义的酸碱催化的，如羧酸酯及磷酸酯的水解、各种分子重排等。 酶蛋白中含有好几种可以起广义酸碱催化作用的功能基，如氨基、羧基、硫氢基、酚羟基及咪唑基等。如下表。其中组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功

15、能基。 广义的酸基团 广义的碱基团 cooh coo nh3+ nh2 sh s -c chhn n+h ch -c chhn n choho_ 影响酸碱催化反应速度的因素有两个。其一是酸碱的强度，在这些功能基中，组氨酸咪唑基的解离常数是6.0，这意味着咪唑基上解离下来的质子的浓度与水中的h+相近，因此它在接近于生物体液ph的条件下，即在中性条件下有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在。也就是说咪唑基既可以作为质子供体，又可作为质子受体在酶反应中发挥催化作用。因此，咪唑基是催化中最有效且最活泼的一个催化功能基；第二是这种功能基供出质子和接受质子的速度，在这方面，咪唑基又是特别突出，它供出或接受

16、质子的速度十分迅速，其半寿期小于10-10秒。而且供出和接受质子的速度几乎相等。 广义的酸碱催化具有它的独到之处，即它为在近于中性的ph下进行催化创造了条件，因为在这种接近中ph的条件下，h+及oh-的浓度太低，不足以起到催化剂的作用。例如牛胰核糖核酸酶及牛凝乳蛋白酶等都是通过广义的酸碱催化而提高酶反应速度的。 5、酶活性中心是低介电区域 酶活性中心内相对地说是非极性的，也就是说酶的催化基团被低介电环境所包围，在某些情况下，还可能排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，这是有利于酶加速反应的。 处于低介电区域的反应基团之所以增加反应是因为：水的极性和它形

17、成氢键的能力使它成为一种具有高度作用力的分子，水的介电常数非常高（达80），它的高极性使它在离子外形成定向的溶剂层，产生自身的电场，结果就大大减弱了它所包围的离子间的静电相互作用或氢键作用。 結合結合区区可避免水分子干可避免水分子干扰扰在避開水分子的干扰下，分子間的离子键才容易產生。-+（）需要金属的酶分类：（）需要金属的酶分类：（1 1）金属酶）金属酶metalloenzymemetalloenzyme: :含紧密结合的金属离子。如含紧密结合的金属离子。如fefe2+2+、fefe3+3+、cucu2+2+、znzn2+2+、mnmn2+2+（2 2）金属）金属- -激活酶（激活酶（meta

18、l-activated enzymemetal-activated enzyme）: :含松散结含松散结合的金属离子，如合的金属离子，如nana+ + k k+ + mgmg2+ 2+ caca2+2+（2 2）金属离子的催化作用）金属离子的催化作用：n许多氧化许多氧化- -还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。因子起着传递电子的功能。n许多激酶的底物为许多激酶的底物为atp-mgatp-mg2+2+复合物。复合物。n金属离子通过水的离子化促进亲核催化。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。6. 6. 金属离子的催化作用金属离

19、子的催化作用7. 7. 多功能催化作用多功能催化作用n酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态最佳反应状态。n 同时几个基元催化反应协同作用，例如胰凝同时几个基元催化反应协同作用，例如胰凝乳蛋白酶的乳蛋白酶的“电荷中继网等。电荷中继网等。不同的酶，起作用的因素可能是不同的，可以受一种或多种因素的影响。(五）

20、某些酶的活性中心及其作用原理（简介）1、溶菌酶 这是第一个主要用x-射线衍射法阐明其全部结构与功能的酶。 溶菌酶lysozyme，ec3.2.1.17存在于鸡蛋清及动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。这种多糖是n-乙酰氨基葡萄糖（nag）-乙酰氨基葡萄糖乳酸（nam） 的共聚物，其中的nag及nam通过-1，4糖苷键而交替排列。溶菌酶的最适小分子底物为nag-nam交替出现的六糖，以 a、b、c、d、e、f表示。溶菌酶为具有129个氨基酸残基的单肽链蛋白质，含有四对二硫键。 从酶的表面来看，酶的结构不很紧密，大多数极性基团分布在酶的表面，便于与溶

21、剂结合；而非极性基团隐藏在酶的内部，整个酶分子中有有一狭长的凹穴。试验证明，最适小分子底物与酶结合时，正好是与酶分子中的长行凹穴相嵌合，酶分子凹穴中的35位谷氨酸及52位的天冬氨酸是活性中心的氨基酸残基。 经研究发现，溶菌酶在进行催化时有两大特点： （1）当溶菌酶与底物结合后，其构象发生较大的改变，这为诱导契合理论提供了强有力的证据，也表示了酶的催化是受底物的靠近及定向效应的影响。（2）活性中心的天冬氨酸和谷氨酸具有协同作用而引起糖苷键的水解。其协同作用表现在两个方面： a.广义的酸碱催化：酶活性中心的谷氨酸处于非极性区，呈不解离状态，即使在ph较高的条件下，它也还是以非离子化的cooh形式存

22、在，当与底物作用时，它可提供一个质子进行酸碱催化。 b.酶可使底物分子的d环发生变形，结果底物d环中的c1变成正碳离子c1+，底物因此而变成转变态。 溶菌酶对细菌细胞壁的破坏过程如下： 首先溶菌酶的分子接触细胞壁，与六个暴露在外的氨基糖残基结合，这时d糖构象发生变形，从正常的椅式变为能量较高的半椅式或船式构象，然后35上的谷氨酸起着广义的酸碱催化剂的作用，提供一个质子给糖苷键的氧原子与d环c1间的糖苷键断开，而c1上带上正电荷，成为一个正碳离子。 处在极性区的天冬氨酸在通常的ph下都是以离子化的 coo的形式存在，甚至在ph很低的情况下也是如此。天冬氨酸起着稳定d环正碳离子的作用，协调c1o间

23、糖苷键的断裂。在天冬氨酸的负电荷影响下正碳离子c1+可以稳定，直到环境中水分子的oh与他结合时为止，水中h+则与谷氨酸35结合，使谷氨酸35恢复非离子化形式。至此一次反应完成，细胞壁被打开一个缺口（p398-399）。 2.胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶（chymotrypsinchymotrypsin）的作用机理的作用机理三条肽链的折叠三条肽链的折叠酶活性中酶活性中心的心的残基：残基：asp102his57ser195 这个酶是研究的最早最彻底的一个酶，他的活性中心由ser195、his57、asp102组成，分子量是25，000。 其证据是来源于与二异丙基氟磷酸（dfp）对酶进行化学修饰得出了丝

24、氨酸，并且证明是底物的结合部位；用tpck（n-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮）证明了组氨酸。tpck是是该酶的最适底物类似物，对胰凝乳蛋白酶有专一性不可逆抑制作用，降低酶活性。试验证明它是与57位上的组氨酸的咪唑基结合的，并证明组氨酸位于催化部位。 现在用高分辨率的x-射线衍射分析直接证明了，三个氨基酸残基在三维结构中确实靠的很近：4258245182组57丝195天冬102 此外还证明酶分子中只有8个氨基酸残基形成螺旋构象，与血红蛋白和肌红蛋白相比，螺旋区少的多。作用机理： 活性中心的这三种氨基酸残基可构成一个氢键体系，他们的排列使组氨酸的咪唑基成为天冬氨酸羧基及丝氨酸羟基间的桥梁。ser19

25、5由于his57及asp102的影响而成为很强的亲核基团，易于供出电子。这个氢键体系又可称为电荷中继网（chargerelay network）asp102co hn n hoser195hcchis57cho或asp102coh或oser195o胰凝乳蛋白酶中的电荷中继网：催化三联体（p409）ab胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶（chymotrypsinchymotrypsin）ec3.4.4.5 ec3.4.4.5 的活性中心的活性中心asp102-his57-ser195 功能：在动物功能：在动物小肠中催化蛋白小肠中催化蛋白质的水解质的水解氢键体系氢键体系- -电荷中继网电荷中继网在大部分情况

26、下，中继网中的天冬氨酸以离子化形式coo，丝氨酸以非离子化形式ch2oh存在（a）。在少数但也是重要的情况下，可以有b的阵势，这种阵势是由于asp102从ser195吸引一个质子所造成的，象接力赛跑那样，质子先从ser195传递到his57，再由his57传递到asp102上。 在这个 酶的催化反应中，组氨酸咪唑基起着广义酸碱催化剂的作用，先促进ser195的羟基亲核地附着到底物敏感肽键中的羰基碳原子上，形成共价的酰化中间物，再促进酰化的es中间物上的酰基转移到水或其他的酰基受体（如醇、氨基酸等）上。通过这个电荷中继网，进行酸碱催化及形成共价中间物，增加的催化速度约为非催化水解反应的103倍。

27、 胰凝乳蛋白酶对多肽底物的水解的全过程分为两个大的阶段：一是水解反应的酰化阶段。其二是水解反应的脱酰阶段。（p410）。 除了胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有“天冬氨酸组氨酸丝氨酸”电荷中继网的酶还有胰蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶等，所以他们可能有很类似的催化机理。此外，来自胰脏的这几种蛋白酶的酶原在激活时发生相似的构象变化，因此它们的酶原激活机理都可能是十分接近的。x-射线晶体衍射法及化学分析指出，来自于胰脏的三种酶的三维结构也很相似，一级结构中有40%的氨基酸的排列顺序也是相同的，特别有意思的是三者活性中心的丝氨酸附近的氨基酸序列则是完全一样的，其序列均为： glyaspserglygl

28、ypro（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶） 三者在结构及机理上表现出极大的相似性，但是在专一性上又表现出很大的差异。x-射线表明这种差异是由底物结合部位在结构上的微少差异引起的。三者的结合部位都有一个“口袋”，但是又有所不同：胰凝乳蛋白酶的非极性口袋可供芳香族（或大的非极性脂肪族）侧链伸入；胰蛋白酶也有一个口袋，口袋底部没有丝氨酸，而有一个天冬氨酸，他在非极性口袋的底部，可与伸入的带电荷的赖氨酸或精氨酸侧链形成一个较强的静电键；弹性蛋白酶的口袋稍短一些，而且因为口袋上部有两个较大的氨基酸缬氨酸及苏氨酸挡住，而不象胰凝乳蛋白酶口袋上方是两个甘氨酸，因此只能让丙氨酸这样的小分子进入。如下图：coo glyglyseraspvalthr胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 弹性蛋白酶 三种胰脏蛋白酶的底物结合部位（p408） 胰脏分泌出来的三种酶在氨基酸序列等方面表现出极大的相似性，反映出他们起源于共同的祖先，但又表现出不同的专一性。这种来自共同祖先，通过基因改变而得到不同专一性的结果，称为同源的“趋异进化”。另有一些酶，他们的来源各异（一个