最全的G418筛选稳定表达细胞系总结3

1、Feynman_R汇合度(confluenee)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表 面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们 100%匚合，也就是汇合 度 100%最近的一个实验是：3X106细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000 和1/1000和1/300到24孔板中，48小时后加g418筛选，这个时候接种了 1/300 细胞的孔会大约50%匚合，而理论上接种了 1/4000细胞的孔会4M右汇合，今 天是筛选后第9天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300孔会有20-30 个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞！所以我认为汇

2、合度对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。jia ngql同意菊花与刀对你的建议。我的感觉 G418筛选时间太长，到后来 一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议，供参考：首先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则 一旦污染就会全军覆没。一般57天后G418就可以减半维持。勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。血清浓度可以高到20%，质量要好。进行真核转染的一般程序：克隆目的基因(经测序验证)一准备真核表达载体-将目的基因插入表达载 体中-转染-筛选-鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、试剂准备1、HBS (Hepe

3、s-buffered saline ) : 876mg NaCl溶于 90ml ddHzO,加入 1M Hepes,调 pH 到 7.4,补 ddHO至 100ml, pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二、操作步骤(一) 克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5'-端分别引入酶切位点BamH和Xhol,行RT-PCR2、回收特异性扩增片段，连入 T载体。3、转化DH5x,质粒制备。4、酶切初步鉴定，测序证实。（二）真核重组表达载体的构建：pcDNA3载体带有在大肠杆菌中

4、复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌 的抗生素抗性基因，以及表达外源 DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamH和Xhol双酶切回收插入片段和pcDNA3线性片段T4连接酶连接转化DH5x质粒制备BamH和Xhol双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板G418分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度 3 复孔，设正常 对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为 200mg/Lo2、在转染实验前天接种

5、细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率 和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-808覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm，每孔1-2ml培养基3X105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘 米的细胞数量。典型贴壁细胞平板密度培养板大小生长面积（cni）大约细胞数培养基谷积（ml）组织培养皿（的0mr）286. 6X1055-66孔培养板（|）35mr）i9.553X101-212孔培养板©22.6mm41. 3X1050. 5-124孔培养板（松mr）i0. 50. 6X050. 25-0 . 53、SHG-44细胞的转染：(1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之

6、前的短时间内，更换1ml新鲜 的有血清或无血清培养基。(2) 准备不同比例的DOSPERDNA昆合物，以确定每个细胞系的最佳比例。 溶液A:用HBS稀释DNA(pcDNA3重组pcDNA3各1.5用 到总体积50 pl(30/ml)。溶液B:用HBSffi释6J脂质体到终容积50 p (120pg/ml)。混合溶液A和B,轻柔混合(不要振荡)，室温孵育 15min,以便脂质体/DNA 混合物形成。(3) 不要移去培养基，逐滴加入100 P脂质体/DNA混合物(从培养孔一边 到另一边)，边加边轻摇培养板。(4) 37 T 孵育 6hr。(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。(6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含 G418的培 养基培养。4、G418筛选：在G418筛选