ELISA试剂配制及实验流程—BDY

1、ELISA试剂配制及实验流程ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。以双抗体夹心法举例说明。试剂配制：(1)包被缓冲液(PH9.6 +0.2 0.05M 碳酸盐缓冲液)：Na2CO31.59gNaHCO3 2.93g加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA）(2)洗涤缓冲液(PH7.4 0.15M PBST)： 0.05%Tween-20 0.5ml加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液：KH2PO4 0.27gNa2HPO4·12H2O 3.58gNaCl 8gKCl 0.2g加蒸馏

2、水至1000ml。(3)封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。(4)稀释液：牛血清白蛋白 0.1 % 0.1g加PBS 缓冲液100ml。(5)底物缓冲液(PH5.0)： 0.2M Na2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L) 取24.3ml 加蒸馏水至100ml。 (或Na2HPO4·12H2O 1.84g 柠檬酸·H2O 0.51g 加蒸馏水至100ml)(6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP- TMB(

3、2mg/ml水) 0.05ml 底物缓冲液 0.95ml 30% H2O2 0.001ml 总体积1ml。TMB, 1mg/ml-DMSO溶解(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）： OPD（干粉） 0.004g 底物缓冲液 10ml 30% H2O2 0.015ml 总体积10ml。 (8)终止液(2MH2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。操作步骤：1.包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为110g/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4过夜（或37温育23小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间

4、振荡。(简称洗涤，下同)。2. 封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37温育2小时。然后洗涤。3.加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37温育12小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。4. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37温育12小时。然后洗涤。5.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37温育45分钟1小时，洗涤5次。6.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37暗处温育520分钟，或室温暗处1040分钟充分变色。7.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.

5、05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。间接法操作步骤：1.包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定）， 4过夜（或37温育23小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。(简称洗涤，下同)。2. 封闭：加0.3ml封闭液于上述已

6、包被之反应孔中，置37温育2小时。然后洗涤。 3. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37温育12小时。然后洗涤。4.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37温育45分钟1小时，洗涤5次。5.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37暗处温育520分钟，或室温暗处1040分钟充分变色。6.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）7.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示

7、。测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。-罗凯明师兄-包被缓冲液（NaHCO3-Na2CO3缓冲液） 量取0.2M NaHCO3 17mL，0.2M Na2CO3 8 mL溶于75mL双蒸水中PBS(PH7.2) 称取NaCl 8.0g, Na2HPO4 12H2O 2.9g，KCl 2.0g，KH2PO4 0.2g溶于1000 mL双

8、蒸水中洗涤液（PBST PH7.2） 量取0.5mL Tween-20溶于1000 mL PBS中酶标抗体稀释液 量取4mL新生小牛血清CS溶于96mL PBST中底物液    称取OPD 4mg溶于40 mL 3%H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，临用前配制磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 量取24.3 mL 0.1M柠檬酸钠，25.7 mL 0.2M Na2HPO4，加双蒸水至100 mL明胶封闭液 称取1g明胶溶于100

9、0;mL PBS(PH7.2)中小牛血清封闭液 量取10mL小牛血清溶于90mL PBS(PH7.2)中酶反应终止液（2M H2SO4） 量取10mL浓H2SO4溶于80mL双蒸水中ELISA步骤： -根哥给的方法-1）实验材料目的抗原BSA或其他对照抗原(15ug/ml)PBS96孔ELISA板；96孔ELISA封板膜；移液枪封闭液：5%脱脂牛奶(w/v)-PBS抗血清0.1% (v/v) Tween20-PBSHRP-兔抗鼠多克隆抗体TMB(A，TMB：称取固体TMB 溶于DMSO 配成1mg/ml液体，避光保存，最好4度用前要检查其状态，若有凝固，可用手温将

10、其融化；B，底物缓冲液为0.1M 醋酸钠-醋酸缓冲液，pH6.0；使用时用底物缓冲液稀释A液至100g/ml；50ml缓冲液加入10l 30% H2O2)。稀硫酸(1M)酶标仪2）实验步骤(1). 用PBS缓冲液将抗原(目的抗原、BSA或其他对照抗原)稀释至0.2-10g/ml。(2). 每孔加入100l抗原稀释液，4包被过夜。(3).以用PBS洗3次(每次每孔200l，每次洗5min)。每孔加入200l封闭液，37封闭2h。(4). 弃封闭液，以0.1% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200l，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200l，每次洗5min)。每孔加入100l已稀释好的抗血清，37孵育2h。(5). 以0.1% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200l，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200l，每次洗5min)。6. 弃洗涤液，每孔加入100l按说明书比例稀释的HRP-兔抗鼠多克隆抗体，37孵育h。7. 以0.1% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔2