质谱培训教材

1、The world leader in serving scienceThermo Scientific China- Demo Center -LTQ 液质联用仪液质联用仪培训教材培训教材The world leader in serving science质谱基本常识质谱基本常识第一章第一章3“The basis in MS (mass spectrometry) is the production of ions, that are subsequently separated or filtered according to their mass-to-charge (m/z) rat

2、io and detected. The resulting mass spectrum is a plot of the (relative) abundance of the produced ions as a function of the m/z ratio.”（质谱的基础是产生离子，这些离子随后按质荷比大小被分离过滤并被检测。得到的质谱图是产生离子质荷比的相对丰度图谱。）Niessen, W. M. A.; Van der Greef, J., Liquid ChromatographyMass Spectrometry: Principles and Applications,

3、1992, Marcel Dekker, Inc., New York, p. 29.什么是质谱？什么是质谱？4 怎样理解质谱怎样理解质谱5LC-MS & LC-MSnTime 时间Response 响应Chromatogram 离子流图m/zm/zMSMS-MS6总离子流图总离子流图7Mass Spectrometry “Simplified” (GMSD)GenerateIon ProductionIon OpticsLinear Ion TrapElectron MultiplierMoveSelectDetect8GenerateIons（产生离子）Move Ions（离子传输

4、）SelectIons（选择离子）DetectIons（检测离子）Sample In(样品引入)Data Out（数据输出） 质谱简化流程质谱简化流程9Atmospheric Pressure Ionization大气压下离子化离子源类型:lElectrospray Ionization (ESI) 电喷雾电离电喷雾电离 大多数情况下是液态过程lAPCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) 大气压下化学电大气压下化学电离离 气相过程lAPPI (Atmospheric Pressure Photo-Ionization) 大气压下光离子化大气压

5、下光离子化- 气相过程离子源作用:lDesolvate sample flow for introduction into mass spectrometer. 去溶剂lBaffle the first vacuum region of the MS from atmospheric pressure in the source. 真空过渡lIonize the analyte or transport ion in solution to the gas phase. 离子化1.Pump away neutrals and opposite charged ions which would

6、otherwise interfere with the analysis of the desired polarity. 去除干扰离子产生离子产生 (API)10Chemistry Considerations 化学考虑化学考虑ESI:离子在液相产生有益于热不稳定化合物的分析有益于中等到高极性化合物分析 有益于大分子（蛋白 / 多肽）APCI/APPI:离子在气态产生 不利于热不稳定化合物的分析 有益于低极性到中等极性化合物分析 适合小分子 (steroids-类固醇，甾体化合物) 适合含有发色基团的化合物 (APPI)11Electrospray - Basic LayoutIon Tr

7、ansfer Tube 金属毛细管ESI Needle+/- 5 kVTaylor Cone 泰勒锥Solvent evaporation and Ion desolvation 溶剂蒸发和去溶剂溶剂蒸发和去溶剂电喷雾电离过程电喷雾电离过程12Auxiliary Gas辅助气辅助气喷雾束喷雾束5kVESI 喷嘴横截面喷嘴横截面喷嘴喷针13w 碱性分子 M+H+ (-NH2) w 酸性分子M-H- (-COOH, -OH) 正负离子扫描选择正负离子扫描选择练习：请为这两个化合物选择合适的扫描方式练习：请为这两个化合物选择合适的扫描方式14Atmospheric Pressure Chemical

8、 Ionization (APCI) 大气压下化学电离大气压下化学电离 通过电晕放电达到气相电离电离过程分以下三步1. 高压电晕针作用于载气高压电晕针作用于载气(N2)和挥发的和挥发的HPLC溶剂，产生初级离子。溶剂，产生初级离子。 O2 + e- O2+. + 2e- N2 + e- N2+. + 2e-2. 通过一系列复杂反应，初级离子和溶剂分子产生溶剂离子，如通过一系列复杂反应，初级离子和溶剂分子产生溶剂离子，如 H3O+ ， OH- 。3. 溶剂离子和分析物反应产生正离子模式下的溶剂离子和分析物反应产生正离子模式下的 (M+H)+ 或负离子模式下的或负离子模式下的 (M-H)- 。 H

9、3O+ + Analyte (Analyte + H)+ + H2O OH- + Analyte (Analyte H)- + H2O15Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) 大气压下化学电离大气压下化学电离 2004 Dr. Paul Gates, University of Bristol16Atmospheric Pressure Photo-Ionization (APPI) 大气压下光离子化电离大气压下光离子化电离利用APCI探针去溶剂通过UV光源离子化电离过程有以下两步1. 分析物分子与分析物分子与UV光源作用（氪灯产生光源

10、作用（氪灯产生10和和10.6ev光子）。如光子）。如果分析物的电离势能低于光子能量果分析物的电离势能低于光子能量hv，分析物分子分析物分子M被电离成被电离成分子离子分子离子M+ 。 M + hv M+ + e-2. 分析物离子有可能从质子溶剂（如果存在）那得到质子形成分析物离子有可能从质子溶剂（如果存在）那得到质子形成离子离子M+H+ 。 M+ + S M+H+ + S-H17 灵敏度 图谱质量 速度“3D”“3D” vs. “2D” 线性离子阱线性离子阱18LTQ 二维线性离子阱二维线性离子阱60 m3/hr300L/sec400L/sec15 L/sec三端 口的分子涡轮泵Probe离子

11、透镜离子透镜线性离子阱线性离子阱Detector 1Detector 219可互换的离子源探针 (图中所示是ESI探针)离子源探针位置调节器APPI 探针入口Ion Max 源源20Ion Max 离子源离子源离子传输毛细管离子传输毛细管入口电喷雾喷针离子传输毛细管离子传输毛细管入口电喷雾喷针 ESI喷嘴喷嘴 ESI 探针探针电喷雾针离子传输毛细管ESI喷嘴ESI探针21Ion Max 源设计源设计 : ESI 探针探针ESI探针特征： 固定的喷射角度（60度） 增加鞘液接口（精确质量测定和柱后修饰应用） X, Y, Z 方向调节更加便于优化液相 入口鞘液入口 ESI 喷针22样品管外壁聚酰亚

12、胺涂层会吸收某些溶剂而变长样品管截面要平齐以保证好的喷雾状态样品管缩进ESI喷针里1mm处得到最好喷雾效果鞘气ESI NeedleESI Needle样品聚酰亚胺聚酰亚胺石英管石英管ESI 喷针ESI NeedleESI Needle样品聚酰亚胺聚酰亚胺石英管石英管ESI 喷针ESI 喷针鞘气鞘气鞘气ESI 喷针样品管延长样品管延长23石英毛细管吸收溶剂溶胀图例石英毛细管吸收溶剂溶胀图例24 ESI探头探头 切面图切面图喷嘴ESI 喷针熔融石英毛细管喷嘴ESI 喷针金属针 1 mm 1 mm25Metal Needle KitStainless Steel Needle SizeTypeSol

13、vent Flow Rate(mL/min)Part No 34-Gauge(30 mM ID)Low flow0.5 - 1070111-6208032-Gauge(50 mM ID)High flow5 - 40070111-6201326 ESI探头探头 切面图切面图喷嘴ESI 喷针熔融石英毛细管喷嘴ESI 喷针金属针 1 mm 1 mm27Spray Voltage : 4 5 kV“Ion Max” ESI 源操作条件源操作条件28APCI 探针探针29Ion Max 离子源设计离子源设计 : APCI 探针探针离子传输毛细管离子传输毛细管APCI探针探针电晕针电晕针离子传输毛细管离

14、子传输毛细管离子源接口离子源接口30Ion Max 离子源设计离子源设计 : APCI 探头探头APCI 探头特征探头特征 : 可移动喷雾器可移动喷雾器 新陶瓷加热器新陶瓷加热器 自我清洁功能自我清洁功能 内表面温度超过内表面温度超过1000C 外置热电偶外置热电偶 源室没有塑料材料源室没有塑料材料 喷嘴组件易于更换喷嘴组件易于更换 X, Y, Z 三维可调三维可调液相入口液相入口陶瓷气化器陶瓷气化器气化器气化器电源接头电源接头 31“Ion Max” APCI 源源 操作条件操作条件液体流速 (mL/min)离子传输管温度. (C)*鞘气压力 (arb)辅助气压力(arb)蒸发室温度 (C)

15、电晕针放电电流 (mA)200250255350+4 (-10*)1000250455450+4 (-10*) 当你改变离子传输毛细管（或金属毛细管）的温度时一定要优化透镜电压当你改变离子传输毛细管（或金属毛细管）的温度时一定要优化透镜电压* 负离子模式负离子模式32APCI 操作注意事项操作注意事项 确保APCI探针的蒸发温度足够大，喷雾区域没有液滴沉降 蒸发温度： 400-450C （针对流速为400-1000uL/min) 可以适当降低金属毛细管的温度 仔细检查鞘气流速 辅助气流量可以先设到0 进高浓度的样品可能会导致污染和记忆效应 定期加热离子源（自动清洗）33APCI Summary

16、 - 小结小结分析物性质分析物性质: * 低到中等极性* 高质子亲和力* 高气相酸度* 1200 da典型流速典型流速 : 0.2 - 2.0 ml/min比ESI更能容忍缓冲盐仅产生单电荷离子！软电离技术典型应用：药物，农药，类固醇及含氮染料34Comparison of ESI and APCI 二者比较二者比较35Comparison of ESI and APCI 二者比较二者比较36PAHs APPI 质谱图质谱图 37金属毛细管正常位置取出金属毛细管真空锁定小球真空锁定真空锁定38Ion Max 离子源室设计离子源室设计改进排出口设计，便于大气压电离废气排出电晕放电鞘 陶瓷和不锈钢

17、陶瓷和不锈钢; 垂直置于壁 上气化溶剂冷却后不被凝结所改进的不锈钢的废液所改进的不锈钢的废液排出部件探针垂直安装液滴直接进入废液排出口，即使氮气用完，也不会在腔室内累积溶剂。也不会在腔室内累积溶剂。非塑料外壳非塑料外壳便于观看的两个视角39钛制成的新型钛制成的新型Skimmers :直径较大，提高灵敏度 钛材料更有利于保持skimmer的热平衡，不锈钢材料会逐渐冷却所以可作为加热器Ion Max 源源 : Skimmer40离子吹扫口离子传输管无需工具装配/拆卸Tube Lens-管路透镜钛制skimmerL0Q00Sweep Gas吹扫气接口Q0API Stack 装配示意图装配示意图The

18、 world leader in serving scienceLC-MS条件优化条件优化第二章第二章42 Sample concentration 样品浓度 Choice of column and solvents 柱子型号和溶剂 Flow rates and their effects 流速及影响 LC/MS 条件优化条件优化 43样品信息样品信息 你需要得到尽可能多的样品信息！你需要得到尽可能多的样品信息！目标分析物的信息包括以下目标分析物的信息包括以下分子式, 结构 (官能团)分子量溶解性, pKa稳定性, 储存是否有标准品浓度水平和范围基质信息基质信息:类型, 状态 (液体, 固体

19、)溶解性不同成份44样品预处理样品预处理 提高灵敏度提高灵敏度 去除基质干扰 离子抑制 建立去除基质干扰的方法 (SPE, 萃取, 过滤等) 进样浓度 与进样量和柱内径有关45l1 L/min - 1mL/minl最佳使用流速最佳使用流速: 200 L/minl一般来说一般来说, 高流速需要高的毛细管温度和气体流速。高流速需要高的毛细管温度和气体流速。l200 m mL/min - 2mL/minlOptimal Flow Rate: 500 L/min 一般来说，高流速需要更高的鞘气和辅助气流量，但不需要提一般来说，高流速需要更高的鞘气和辅助气流量，但不需要提高毛细管温度高毛细管温度LC 建

20、议流速建议流速46液相柱液相柱(标准装柱填料直径标准装柱填料直径 5.0m mm)最适合的流速最适合的流速 (线性速度线性速度)流速流速 柱子直径柱子直径1.0 mL/min 4.6 mm 0.5 mL/min 3.0 mm 0.2 mL/min 2.1 mm 50 mL/min 1.0 mm 10 mL/min 毛细管4720使用窄内径的柱子可以提高分离效果使用窄内径的柱子可以提高分离效果48LC 添加剂添加剂 酸酸l 不要使用无机酸 (可能会导致腐蚀)l 推荐使用醋酸和甲酸 碱碱l 不要使用碱金属碱 (可能会导致腐蚀)l 推荐使用氢氧化铵和氨水 表面活性剂表面活性剂 清洁剂和其他表面活性剂

21、会产生离子抑制 三氟醋酸三氟醋酸(TFA)l 可以提高液相的分离度，但是在质谱正负离子模式下会产生离子抑制作用 三乙胺三乙胺/三甲胺三甲胺 (TEA/TMA)l 有助于形成负离子49增加增加TFA用量用量(乙腈乙腈:水水=50:50) 对质谱信号强度的影响对质谱信号强度的影响0.000.050.100.150.200.250.30020406080100% of Control Response% TFA本结果是两次实验的平均值. *注: 不加TFA的结果是不确定的，因为在溶液无法肽段质子化。对照样品是 50/50/0.1, 甲醇/水/甲酸(N=6, 平均信号强度 = 1.10 x106 co

22、unts.* S. Baldwin, K. Stoney, K. Wheeler, I. Mychreest. “Low pH Solvent Alternatives to TFA Solvents and Their Effect on HPLC/ESI-MS of Peptides”, Poster Paper Presented at ASMS 96.50液质联用中缓冲盐使用的注意事项液质联用中缓冲盐使用的注意事项 (pH)l 当使用非挥发性的盐时, 一定要使用吹扫挡锥（sweep cone）。 l 尽量避免使用如下的非挥发性盐 碱金属磷酸盐 硼酸盐 柠檬酸盐l 经常使用缓冲盐需要定期

23、清洗金属毛细管51质子给体质子受体提高色谱分离形成负离子时提高色谱分离缓冲液乙酸甲酸氢氧化铵氨水溶液三氯乙酸 ( 0.02% v/v)三氟乙酸 ( 0.02% v/v)三乙胺( 0.02% v/v)三甲铵 ( Mass Lists；2. 添加 Reject masses；输入 Reject masses (用一级全扫描模式采集一个空白数据，在Qual Browser里查看该数据得到)185Building Double Play: Scan Event Two选择Scan Event Activation2. 设定 Activation Type，Default Charge State， I

24、solation Width和 Normalized Collision Energy186Building Double Play: Scan Event Two选择 Scan Event Current Scan Event设定 Minimum signal threshold (counts，绝对强度)；用一级全扫描模式采集一个空白数据，在Qual Browser里查看该数据得到；确定两处均设为1；187实验总结实验总结188常用常用 Data Dependent LCQ Experiments 设定Big 3:步骤:一级全扫描 对最强的离子，第二强的离子以及第三强的离子做数据相关Dat

25、a Dependent (dd) MS2优点/缺点:MS2花费时间很长能采到峰顶点位置的信号Double Play with Dynamic Exclusion:步骤:一级全扫描 启用Dynamic Exclusion，对最强的离子做数据相关Data Dependent (dd) MS2 优点/缺点:为分析共流出物提供可能可能丢失出峰的顶点位置189Dynamic Exclusion 共流出物的共流出物的MS & MS2190Dynamic Exclusion1. 选择 Global Dynamic Exclusion2. 设定 Repeat count, Repeat duratio

26、n, Exclusion list size, Exclusion duration和 Exclusion mass width *以上设置导致以上设置导致0.2分钟内采集了三分钟内采集了三次次 MS/MS 图谱，图谱，0.3分钟后该排分钟后该排除离子获得释放除离子获得释放 *Exclusion Mass Width中中Low和和High的设置可以是不对称的，的设置可以是不对称的，High的设定较宽，可以包含同位的设定较宽，可以包含同位素峰素峰191Divert Valve 操作操作192方法总结方法总结193Data Dependent Triggers数据相关采集系列数据相关采集系列Dat

27、a Dependent MS/MSFull scan MS followed by MS/MS of the most intense ion fragmentNth Order Double Play Perform MS/MS on the top “N” most intense ions (up to 199)Dynamic Exclusion Prevent an ion from triggering a subsequent data dependent scan for a pre-selected length of timeData Dependent Triple Pla

28、yFull scan MS followed by Zoom scan and MS/MS of the most intense ion. Nth Order Triple PlayPerform Triple Play experiment on the top “N” most intense ionsData Dependent Neutral Loss MS3 Trigger MS3 scan on only the MS/MS product ions with the pre-defined neutral lossData Dependent Ion TreePerform M

29、Sn on up to 25 species to any level between MS2 and MS10Ion Mapping Automatically generate a 3-D MS/MS map of the fragmentation pathwayData Dependent Zoom MapPerform MS/MS on the precursor ions with intensities above the threshold in an MS ZoomScan Isotopic Data Dependent Scan Trigger a scan if isot

30、ope mass difference and intensity ratio criteria are satisfied Charge State ScreeningSpecify the charge state of the ion of interest for the data dependent scanThe world leader in serving science第九章第九章Xcalibur - - Sequence Setup195Xcalibur Home Page Sequence Setup打开打开 Sequence Setup, 点击点击 View Seque

31、nce Setup View 也可点击也可点击 Sequence Setup196创建序列创建序列1. 双击添加双击添加 Instrument Method2. 如果此路径下没有该文如果此路径下没有该文件夹件夹, 你可以输入文件夹名，你可以输入文件夹名，该文件夹将会创建该文件夹将会创建3. 设定设定File Name (无无空格空格), Position和和 Inj Vol如果你的样品数比较少，从如果你的样品数比较少，从 Sequence Setup 主页建序列更方便主页建序列更方便运行序列需要提供的基本信息运行序列需要提供的基本信息: : File Name, Path, Inst Meth

32、, Position, Inj Vol197创建序列创建序列热键热键 F2 ，可以编辑该文本，可以编辑该文本右击并选择右击并选择 Open File可可以打开以打开Instrument File198用新序列模板创建序列用新序列模板创建序列如果你需要运行大量的样品如果你需要运行大量的样品, 使用使用 New Sequence Template 创建序列会比较方便创建序列会比较方便1.点击点击 New199新序列模板新序列模板1. 选择选择Base File Name, Path, & Instrument Method3. 选择起始的选择起始的 Vial Position2. 输入输入

33、 unknown 样品的样品的个数个数4. 如果你已经有如果你已经有 Processing Method, 在上面指定好，在上面指定好， 你可你可以添加以添加Standards, Blanks 以及以及 QCs。会自动生成包括。会自动生成包括processing method相关信息相关信息的序列的序列200新序列模板新序列模板一旦你在一旦你在New Sequence Template界面点击界面点击 OK , 文件名会自动根据文件名会自动根据Base File Name自动往下递增自动往下递增201新序列模板新序列模板If you want to type a new File Name:2

34、. 选择选择 Edit 点点击击 Fill Down1. 输入输入 File name202改变序列中改变序列中 Column Arrangement1.选择选择Change 点击点击 Column Arrangement2. 从左边的从左边的Available Columns选择需要的内容选择需要的内容4. 点击点击 Move Up 或或者者Down改变显示次改变显示次序序3. 点击点击 Add203改变用户标签改变用户标签1. 选择选择 Change 并点击并点击 User Labels2. 改变改变 labels204改变改变 Tray 当前配置的自动进样器能够使用的当前配置的自动进样器

35、能够使用的所有进样架列表所有进样架列表1. 选择选择 Change 点击点击 Tray Name2. 选择使用的选择使用的Tray型号型号205将序列输出到将序列输出到Excel1. 选择选择 File，点击，点击Export Sequence206将序列输出到将序列输出到Excel1. 选择需要输出的选择需要输出的内容并点击内容并点击Browse2. 命名该文件命名该文件3. 序列文件将输出序列文件将输出为为 .csv格式格式207输出序列示例输出序列示例确保重新将该序列导入确保重新将该序列导入Xcalibur, 第一行必须包含文本第一行必须包含文本 Bracket Type=n where

36、 n=1-4. 每个数字代每个数字代表特定的表特定的 bracket 类型类型:1= Overlapped, 2= None, 3= Non-overlapped, 4= Open208从从Excel中导入序列中导入序列2. 选择你需要输入选择你需要输入的内容，点击的内容，点击 Browse 找到输入找到输入文件文件1. 选择选择 File 并点击并点击 Import Sequence209运行序列运行序列1. 可以选择可以选择 Run One Sample 或或 Run Sequence210运行序列运行序列显示在显示在Instrument Configuration界面配置的所有仪器界面配

37、置的所有仪器允许自动处理样品数据允许自动处理样品数据如果没选如果没选, 序列将不序列将不会运行，除非你点会运行，除非你点击击 Actions Start Analysis确认这些行是待运行的确认这些行是待运行的可以优先运行提交的序列可以优先运行提交的序列选择在序列运行前选择在序列运行前或后仪器的运行方或后仪器的运行方法法211信息条信息条Acquisition Queue-Sequence ProgressStatus通过点击通过点击 View and unchecking Info View打开或关闭打开或关闭Info View Status 键显示所有键显示所有配置仪器的状态配置仪器的状态

38、提交序列后提交序列后, 就会出现在就会出现在Acquisition Queue。点击。点击Sample旁边的方框，框内打勾，旁边的方框，框内打勾，键盘上再点击键盘上再点击Delete键即可删键即可删除该样品除该样品212实时图谱查看实时图谱查看1. 选择选择 View ，点击，点击 Real Time Plot View如果你更改了该页面的一些设定如果你更改了该页面的一些设定, 点击点击解锁键，重新监测实时数据采集解锁键，重新监测实时数据采集The world leader in serving science第十章第十章Qual Browser定性浏览器定性浏览器214打开打开 Qual B

39、rowser, 你可以在你可以在 Xcalibur Homepage右击右击 Qual Browser , 打开原始数据或序列打开原始数据或序列打开打开Qual Browser215Qual Browser 主界面主界面Info Bar放大按钮，可以放大色谱图或质谱中某段区域放大按钮，可以放大色谱图或质谱中某段区域主要工具主要工具最多每个窗口一次最多每个窗口一次可以显示可以显示 16 个个cells， 每个每个cell 最多包含最多包含 8个个 plots右上角有右上角有Cell的标志的标志216在在 Qual Browser界面打开文件界面打开文件2. 选择选择 replace (当前当前

40、window, cell 或或 plot), add a new window or plot (默认是增加一个新窗口默认是增加一个新窗口), 选择输出的选择输出的Layout1. 点击点击 File 选择选择 Open (也可以打开也可以打开序列或结果文序列或结果文件件)217The Info BarThe Cell Info 页页面提供对应面提供对应Cell中中每个每个Plot 信息信息 如果你打开的是序如果你打开的是序列或结果文件，将列或结果文件，将分别出现在分别出现在Info Bar的第二页和第的第二页和第三页三页当你对色谱峰进行积当你对色谱峰进行积分时，会出现分时，会出现Integr

41、ation页面。页面。 你你可以改变积分参数获可以改变积分参数获得合理的积分得合理的积分218The Info Bar Elemental Composition2. 设定分子式的限定条件设定分子式的限定条件3. 改变使用的元素改变使用的元素, 右击选择右击选择 Add Isotopes，直接从元素周期表界面进，直接从元素周期表界面进行选择行选择1. 输入质量数或在质谱图某个质量数上输入质量数或在质谱图某个质量数上右击，选择右击，选择 Generate Formula from Mass4. 点击点击Calculate ，表格中即，表格中即出现分子式信息出现分子式信息Info Bar之之Ele

42、mental Composition帮助你计算最符合某个质量数（来自于质帮助你计算最符合某个质量数（来自于质谱图）的化学分子式谱图）的化学分子式219Isotope Simulator同位素拟合同位素拟合同位素拟合页面允许用户建立一个化学分子式同位素分布质谱图 定性浏览器信息栏定性浏览器信息栏220Isotope Simulator 同位素拟合同位素拟合allows you to create a simulated spectrum for a chemical formula enteredThe Info Bar Isotope Simulator2. 设定参数设定参数 输入化学分输入化

43、学分子式子式3. 点击点击new4. 出现该化学分子式的精出现该化学分子式的精确质量数，确质量数， 拟合的图谱出拟合的图谱出现在新的窗口现在新的窗口221Info Bar MSn Browser 页面显示并帮助你分析页面显示并帮助你分析 MSn 实验数据实验数据The Info Bar MSn Browser2. 点击显示隐点击显示隐藏信息藏信息1. 如果如果MSn browser页面页面不显示任何数据不显示任何数据 ，激活质，激活质谱图谱图3. 可以双击得到平均可以双击得到平均（Average）或复合的质）或复合的质谱图谱图(Composite Spectrum)4. 也可以右键选择也可以右

44、键选择 Include individual scans222Qual Browser Layouts2. 保存保存Layout或将该或将该Layout设置为默认格式设置为默认格式1. 根据需要设定好根据需要设定好 cells, plots, integration等等。等等。3. 选择选择Layout格式打开格式打开后续文件后续文件223放大放大1. 激活激活cell2. 平行平行X轴或轴或Y轴拖动鼠轴拖动鼠标或在目标区域拖动成标或在目标区域拖动成方框方框224将色谱图中某个峰取平均质谱图将色谱图中某个峰取平均质谱图1. 激活质谱激活质谱图图2. 鼠标拖过对应色谱峰鼠标拖过对应色谱峰 得到平

45、均质谱图得到平均质谱图3. AV 告诉你几次扫描的平均告诉你几次扫描的平均 (如：如： AV: 7 = 七次扫描的平均质谱图七次扫描的平均质谱图)225从色谱图中提取某个离子从色谱图中提取某个离子1. 激活色谱图激活色谱图2. 也可以直接鼠标拖过质谱峰得到也可以直接鼠标拖过质谱峰得到鼠标拖动质量范围的鼠标拖动质量范围的EIC或者鼠标或者鼠标点击质谱峰得到该质量数的提取离点击质谱峰得到该质量数的提取离子流图。窗口大小根据子流图。窗口大小根据chromatogram里里Ranges中中Mass Tolerance的设定自动调整的设定自动调整226右击右击Chromatogram -Peak Det

46、ection1. 右击右击 chromatogram 选择选择 Peak Detection2. 选择选择 Toggle Detection in This Plot 或或in All Plots3. Info Bar 显示积分参数显示积分参数227右击右击Chromatogram -AutoFilterAutoFilter 可以自动显示可以自动显示 scan filters (目标物分析有用目标物分析有用)，第一张图，第一张图(上上) 没有任何没有任何Scan Filter。 其他图其他图对应在方法里设定的对应在方法里设定的 scan filters (最最多同时显示多同时显示 8 张图张图

47、)228右击右击Chromatogram - Chromatogram Ranges1. 右击右击 chromatogram 选择选择 Ranges229右击右击Chromatogram -Chromatogram Ranges点击添加点击添加 plots (最最多多8个个)点击选择文件点击选择文件改变检测器改变检测器, 积分算法和积分算法和延迟时间延迟时间230Chromatogram Ranges Scan Filter点击向下箭头选择任何更加特点击向下箭头选择任何更加特定的定的Scan Filter可以在此输入可以在此输入Scan Filter (如，如， Full ms, Full m

48、s2, Full ms3等。等。 依次逐个依次逐个显示所有显示所有 MS, MS2和和MS3扫描扫描)。layout 可以保存为默认格式，这样即使可以保存为默认格式，这样即使 scan ranges 改变改变, 也没有必要改变也没有必要改变Scan Filter。 如果如果Scan Filter处是空白处是空白, 将显示采集的所有扫描，不管是将显示采集的所有扫描，不管是 MS，还是，还是 MSn)231Chromatogram Ranges Plot Types1. 点击更换点击更换 Plot typeTIC 每次每次Scan所有离子叠加的色谱图所有离子叠加的色谱图Base Peak 每次每次

49、Scan最强离子提取的色谱图最强离子提取的色谱图Base Peak色谱图会使色谱图会使 Full ms 数据通常看起来更好一些，数据通常看起来更好一些， 因为大量的噪音被去除因为大量的噪音被去除232Chromatogram Ranges Extracted Ion Chromatogram1. Scan filter选为选为 Full ms或者删除或者删除 Scan filter 查看所有查看所有Scan3. 在在 Range(s) 框输入质量数或质量数范围。如果需要输入多个质量数，范围将根据框输入质量数或质量数范围。如果需要输入多个质量数，范围将根据Automatic processing

50、里里mass tolerance的设定来决定的设定来决定2. 可以选择可以选择Mass Range (TIC) 或或 Base Peak在在Chromatogram Ranges界面有多种方式可以提取离子界面有多种方式可以提取离子233Chromatogram Ranges Neutral Fragment1. 删除删除 Scan filter2. 选择选择 Neutral Fragment3. 输入输入 Neutral Fragment 质量数质量数Neutral Fragment Plot type将显示所有符合你设定中性丢失的碎片离将显示所有符合你设定中性丢失的碎片离子子 ( (从从MS

51、 到到 MS2) )234Chromatogram Ranges Automatic Processing1.对色谱图对色谱图施加平滑参数施加平滑参数平滑点数必须是奇数平滑点数必须是奇数235右击右击Chromatogram -Display 选项选项1. 右击右击 chromatogram 并选并选择择 Display Options Display 选项可以修改色谱图显示外观选项可以修改色谱图显示外观 (如如Style, Color, Labels, Axis & Normalization)Xcalibur 当前设定的显示当前设定的显示结果结果236右击右击Spectrum -S

52、pectrum List（质谱图列表）（质谱图列表） Spectrum List包括质谱包括质谱图中每个离子的图中每个离子的 m/z, 绝对绝对强度和相对强度强度和相对强度237右击右击Spectrum - Scan Header Scan Header允许查看信息允许查看信息如如 scan mode, ion injection time, scan time等，和色谱等，和色谱上的每一次上的每一次Scan相关联相关联 （使（使用主工具栏上的箭头浏览每次用主工具栏上的箭头浏览每次Scan的信息）的信息）238右击右击Spectrum -Tune and Instrument MethodsT

53、une 和和 Instrument 方法方法包含在包含在Raw File中。当选中。当选择择 Instrument Method，首先显示的是质谱方法，首先显示的是质谱方法， 点击键盘上的向下键或主点击键盘上的向下键或主工具栏工具栏 键浏览液相键浏览液相泵和自动进样器的方法泵和自动进样器的方法239右击右击Spectrum -Spectral Subtraction1. 对目标峰取平均质谱图对目标峰取平均质谱图2. 右击右击 spectrum 选选择择 Subtract Spectra - 2 Ranges3. 在该峰前后拖动鼠标选择被扣除的区域在该峰前后拖动鼠标选择被扣除的区域240右击右击

54、Spectrum - Spectrum Ranges1. 右击右击 spectrum 选选择择 Ranges241右击右击Spectrum -Spectrum Ranges这里同样可以设定这里同样可以设定Subtract Spectrum242在图谱中添加备注在图谱中添加备注1. 添加文本添加文本, 点点击击 Display ，选，选择择 Annotate2. 输入备注文输入备注文本框本框3. 点击激活的点击激活的Cell添添加该文本框加该文本框243Chromatogram 拷贝拷贝1. 到到 Edit Copy Cell 拷拷贝当前激活的贝当前激活的Cell2.Cell 可以贴到其他的可以

55、贴到其他的 Office程序程序 (Microsoft Word, Powerpoint, Excel, etc.)The world leader in serving science第十一章第十一章定量处理流程定量处理流程245定量数据处理定量数据处理 Quantitative Processing1.数据处理方法建立数据处理方法建立Processing Setup输入已知化合物用来识别设定峰检测/积分参数选择校准/质量控制类型，水平，重量选择先前色谱峰处理2.样品序列处理样品序列处理/重新处理重新处理Sample Processing/Reprocessing输入新的序列方法参数确定校准

56、文件和定标类型处理/重新处理数据3.定量浏览器定量浏览器Quan Browser查看定量结果评价标准曲线，质量控制和标识使用不同参数重新计算峰面积分析详细定量信息246定量处理建立定量处理建立Xcalibur Homepage 点击点击 Processing Setup 按钮开始按钮开始设置定量处理方法设置定量处理方法247定量选项定量选项1. 点击点击 Options3. 选择选择 LC4. 选择选择 Calibration Options5. 选择实验是内标法还是选择实验是内标法还是外标法外标法2. 点击点击 Chromatography By248打开一个原始数据帮助建立定量处理方法打开

57、一个原始数据帮助建立定量处理方法1. 点击点击 File2. 点击点击 Open Raw File249定量处理定量处理 Identification1.选择选择 并输并输入组分名入组分名2. 选择选择Detector type和和Peak Detection algorithm积分算积分算法法3. 选择选择 scan filter 和和trace type4. 点击点击 OK 更新更新 chromatogramChromatogram 根据根据 scan filter和和trace type 更新更新250定量处理定量处理 Identification1. 输入输入 Expected RT

58、(min)Window (sec) = 组分洗脱允许的组分洗脱允许的RT窗口范围窗口范围如果有内标，你可以把内标作为如果有内标，你可以把内标作为RT Reference*注注: 如果你使用的内标法如果你使用的内标法, ISTD 必须首先设定，因为其他目标组分要参考该内标。必须首先设定，因为其他目标组分要参考该内标。 对于其他的组分对于其他的组分, 你可以选择你可以选择 Adjust using 并并 选择选择 ISTD 名称名称.2. 点击点击 OK更新更新色谱图色谱图251定量处理定量处理 Detection1. 点击点击 Detection2. 改变积分参数得到改变积分参数得到满意的积分效

59、果满意的积分效果3. 点击点击OK 更新更新色谱图色谱图252定量处理定量处理 - Calibration 内标建立内标建立1. 点击点击 Calibration2. 选择选择 ISTD3. 输入内标输入内标数量和单位，数量和单位，也可忽略不也可忽略不设此项设此项253定量处理定量处理 - Calibration 目标物建立目标物建立1. 选择选择Target compound如果使用如果使用 ISTD, 在此选择内标在此选择内标2. 选择校正曲线的权重选择校正曲线的权重3. 对于校正曲线原点的处理对于校正曲线原点的处理254定量处理定量处理 Levels1. 点击点击 Levels2. 输入

60、每个校输入每个校正正Level的名称的名称3. 输入每个校正输入每个校正Level的的具体量具体量4. 输入每个质控输入每个质控QC level的名的名称称name ， amount和和% Test 255Copying Levels to All Target Compounds Levels页面只需输入一个目标组分的信息。右击页面只需输入一个目标组分的信息。右击并选择并选择 Copy Levels to All Target Components可以将可以将Level的信息拷贝到其他组分的信息拷贝到其他组分256定量批处理定量批处理点击点击 Sequence Setup 按钮打开序列按钮打开序列文件并在批处理前添文件并在批处