草鱼烂尾病病原细菌Y2的分离鉴定与中西药物敏感性分析

1、武汉轻工大学毕业论文2013届毕业论文题目：草鱼烂尾病病原细菌Y2的分离鉴定与中西药物敏感性分析姓 名 蔡庐山 学 号 090702228 院（系） 动物科学与营养工程学院 专 业 水产养殖学 年 级 2009级 指导教师 刘洪明 武汉轻工大学制2013 年 05 月目 录摘 要11、前言22、材料与方法92.1细菌分离92.2病原菌的生理生化鉴定92.3待测细菌WH125的分子生物学鉴定112.4 细菌的药物敏感性测定123、结果133.1病鱼症状133.2病原菌的生理生化鉴定133.3分子生物学鉴定结果163.4菌种判定183.5药敏试验结果184、讨论19参考文献22草鱼烂尾病病原细菌Y

2、2的分离鉴定摘要本文从实验室患病草鱼身上分离得到一株致病菌，通过对细菌分离培养与纯培养、形态与菌落特征、理化特性等表观分类学指征鉴定的测定；同时择代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定，测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树；以表型性状鉴定结果，及细菌发育学分析的结果，进行分离菌的种属判定。结果表明所检鱼病的致病菌为草鱼烂尾病病原细菌Y2。同时还对该病菌进行了药物敏感性测定，明确了该菌对各种中西药的敏感性，为治疗由草鱼烂尾病病原细菌Y2所引起的水产动物疾病提供了理论基础。关键词：草鱼烂尾病病原细菌Y2 16S rRNA 药物敏感性Isolatio

3、n and identification of pathogenic bacteria Y2 of Grass carp tail rot AbstractIn this paper, a pathogenic bacteria strains were isolated from laboratory sick grass carp. Cultivation of bacteria and pure culture, morphology and colony characteristics, physical and chemical properties such as apparent

4、 taxonomical indications identified measurement. In addition, molecular identification of analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene were applied, the 16S rRNA gene were sequenced and the phylogenetic tree representing genetic relatedness among the isolates and publicly available 16S r

5、RNA gene sequence from GenBank database was constructed; the results showed that the isolates were Aeromonas veronii. The Antimicrobial susceptibilities of selected strains to antimicrobial agents were determined, Results show that the pathogenic bacteria for grass carp fish disease are lousy tail d

6、isease pathogen bacteria Y2, and the sensitive agents were selected in this study, For treatment of grass carp lousy tail disease caused by pathogenic bacteria Y2 aquatic animal diseases provides a theoretical basis Keywords: Grass carp lousy tail disease pathogen bacteria Y2 16S rRNA Antimicrobial

7、susceptibility test (AST)241前言烂尾病是一种常见病，无论是在养鱼池、水族箱、网箱、网围、网栏、水库中养殖的草鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼、鳗鲡、暗纹东方鲀、鲤、鲫等多种淡水鱼都经常可以发生。只要鱼尾部被擦伤，或被寄生虫等损伤后，鱼体抵抗力下降，水质又较污浊，养殖密度高，水中病原菌又较多时，就容易暴发流行，引起鱼种大批死亡。随着鱼类的养殖面积不断扩大，养殖生产中的病害时有发生，根据“2009年中国水产养殖动植物病情监测报告”初步统计，全国鱼类因病害造成的直接经济损失达到52.42亿元，因此加强对鱼类病害的研究十分必要1。近十多年来，随着研究技术的发展，该领域的研究工作日益活

8、跃，细菌性疾病常导致养殖和野生鱼类的大量死亡，因此对鱼类细菌性疾病的研究一直是鱼病学主要的研究领域之一2 。徐伯亥等(1986)报道，草鱼尾柄病(又称烂尾病)的病原菌为温和气单胞菌。将赤皮病的病原菌荧光假单胞菌、打印病的病原菌嗜水气单胞菌、细菌性烂鳃病的病原菌柱状屈桡杆菌分别人工涂抹、浸泡、注射尾部受伤的草鱼，均可使草鱼患烂尾病。反之，将温和气单胞菌人工感染体侧受伤的鲢、鳙，则患打印病；人工感染体侧受伤的草鱼，则患赤皮病。因此，草鱼烂尾病的病原菌可能不仅一种，而是有多种。只要尾部受伤后，上述几种菌都可感染引起患烂尾病；对鱼类细菌病一些快速鉴定方法已问世，具体手段如下：1.1常用的细菌鉴定法1.

9、1.1选择培养基法能抑制多数细菌，仅利于某一种或者某一类细菌生长的培养基称为选择培养基。选择培养基制作简单，使用方便，已被不少鱼病实验室采用。例如：Rimler-shotts培养基4（R.S琼脂培养基）用于识别腐皮病的病原嗜水气单胞菌，伊红美蓝培养基5既是对大肠埃希氏菌的鉴别培养基，同时也可以根据需要作为其生长的选择培养基。1.1.2经典分类法这是近100年来进行微生物分类的传统方法，其特点是利用细胞体上随机和非系统观察的试验结果，根据某些主要或显著的特征性状进行分类。其常用的特征主要是形态和生理生化特点，并在分类时将特征分为主要和次要特征，一般将结构和形态特点作为初步分类特征，在许多情况下，

10、把它们看成比生理、生化特征更重要的特征。最后应用双岐法整理实验结果，排列出分类类群，亦即通常把上述主次相关特征性状依伯杰氏细菌鉴定手册6检索表，便可查出待检菌株的学名与分类归属（中科院微生物研究所细菌分类组，1978）。1.1.3荧光抗体技术荧光抗体技术根据抗原抗体反应具有高特异性的特点，以荧光素作为标记物、与已知的抗体结合作为标准试剂，用于鉴定未知抗原(在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异抗原抗体复合物及存在部位)。吴淑勤等应用间接荧光抗体技术(IFAT)对鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌进行了检测。用这种方法测定混合感染的准确率较高，达到或超过细菌培养法的水平(尤其是对早期无症状的感染

11、)。该技术快速简便，一组平行集合的组织涂片，分别滴加爱德华氏菌抗血清和几种嗜水气单胞菌地区优势血清型抗血清，按常规步骤操作，2h内可完成取样至镜下观察全过程,确定是混合感染还是单纯感染。1.1.4免疫酶技术该技术把抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用有机结合起来，通过酶的活性降解底物呈现颜色反应，以示抗原抗体特异性反应的存在，免疫酶技术种类较多，目前常用的有ELISA、Dot-ELISA等。钱冬等用酶联免疫吸附法检测细菌性败血症病原嗜水气单胞菌，其方法是先制备兔抗AhTPS-30的抗血清，再用抗血清包被，兔抗体特异性地结合待测病原菌，建立了双夹心ELISA法。该法可检测出9.77×1

12、0个/ml菌，相当于10ng抗原，与点状气单胞菌、温和气单胞菌等菌株不发生交叉反应，对白鲫人工感染的病原菌，检出率达85以上。整个过程仅需1.5 h。沈素芳等应用点酶法(Dot-ELISA)检测鱼类致病性嗜水气单胞菌重要致病因子ECPase并研制出检测试剂盒。这种方法敏感性高、重复性好，具有较强的特异性，且可同时检测大量样本，并能区分致病性与非致病性。1.1.5单克隆抗体技术单克隆抗体是一个抗体产生细菌与一个骨髓瘤细胞融合而产生得到杂交瘤细胞经无性繁殖的细胞群所产生的，用其检测病原的优点在于它对抗原位点的特异性及保持细胞系重复获得相同抗体的能力。1.1.6 PCR(聚合酶链反应)技术PCR(P

13、olymerase chain reaction)技术已应用于诊断隐性疾病，检测临床标本病原体及法医遗传鉴定，最近也被用于水生动物疾病病原的诊断。陆承平等选用气单胞菌毒素基因中保守区的同源寡核苷酸序列为引物，用PCR技术检测临床分离的嗜水气单胞菌的毒素基因，获得较为满意的结果。1.17快速细菌鉴定的方法根据细菌的生化特性，研究生产了多种多样的细菌鉴定系统，它们使用简单，能在较短时间内鉴别出病原菌。1.1.8 API-20E系统API20E是目前世界上应用最为广泛的细菌鉴定系统，主要由含20种脱水基质的微型管组成的API试验条、试验结果读数表和检测试剂等组成。美国试验条可对1株细菌进行23个生化

14、实验。API20E主要用于检测发酵型革兰氏阴性杆菌，可对98种肠道革兰氏阴性杆菌进行准确鉴定。1.1.9 FAME(Fatty Acid Methyl Ester)系统在标准培养条件下培养细菌，然后抽提其脂肪酸，再进行气相色谱，分析所得数据进行细菌鉴定。FAME分析仪（MIDI，Newark,USA）能将细菌的细胞膜上磷脂转化为甲酯，然后通过对基本组成分析和图谱识别软件将所检测的细菌鉴定到种或亚种。目前用气相色谱的脂肪酸分析仪已广泛应用于鉴定临床和环境来源的细菌。多年来，短链脂肪酸（挥发掾酸，VFAs）分析仪已被用于常规鉴定厌氧细菌。在细菌中已发现越过300种脂肪酸和相关组分。通过检测细菌有或

15、没有每种脂肪酸及其脂肪酸含量来确定细菌种类。理论上可以区别2300种不同的组成，但实际是达不到的，因为在细菌体系中，并没有随机的分布。此技术优点是，方法简单、分析快速、材料低耗。而且，全细胞的脂肪酸含量在细胞基因组内是直接和稳定的表达。实际上，细胞内脂肪酸图谱是表型特征，不受突变、获得方式或质粒丢失的影响。其主要问题是，细菌的磷脂含量随种类而变化。尽管分离的微生物脂肪酸图谱被广泛地应用于微生物化学分类学，但个别种的脂肪酸图谱是随着生长温度或培养基成分会发生数量变化（更少的情况，性质上也会发生变化），因而对所测试的菌株的培养条件需严格标准化。1.2细菌药敏试验 体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验

16、（AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。用药敏实验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗。药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。1.3 常用细菌药敏试验方法1.31纸片扩散法：WHO推荐的全球统一的标准方法。该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的

17、增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。1.32定量测定的稀释法：主要测定细菌对某药的最低抑菌浓度，包括肉汤稀释法和琼脂稀释法。将不同剂量的抗菌药物加入融化并冷至50左右的定量MH琼脂中，制成含有不同递减浓度药物的平板。接种待没测菌（可在一个平板上做多株测定），35孵育1624h，无细菌生长的最低药物浓度为测试菌的MIC

18、。本试验特点是可同时做多株菌株的MIC测定，结果的重复性优于肉汤稀释法，且易于发现污染或耐药突变菌，是新药证时常用的外药敏试验经典参照标准。1.33抗生素浓度梯度法： 抗生素浓度梯度法（E-test）运用E试条，E试条是一条5mm×5mm的无孔试剂载体，一面固定有预先制备的，尝试呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度即为抗生素抑制细菌的最低浓度。1.3.4 全自动药敏仪法：常用的药敏仪器有Vitek Microscan Sensititre ARIS ATB1.4中草药

19、在鱼类疾病防治方面的应用中草药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、资源丰富以及性能多样化等优点，在防治鱼病中，除了兼有药性和营养性外，还具有提高水产动物生产性能和饲料利用率的功效。因此应用中草药防治鱼病越来越受到人们的关注。长期以来，我国广大渔民群众在应用中草药防治鱼病方面积累了丰富的实践经验，总结筛选出许多在生产应用中行之有效的单方、验方。比如：大蒜治肠炎、五倍子治白尾病、鸟桕叶治草鱼烂鲤、生姜、辣椒合剂治小瓜虫病等等。前两年，我市沿海许多网箱养殖户采用中草药合剂治疗大黄鱼肝肾病。如蕉城区二都一带养殖户用板兰根、车前子、龙胆草、柴胡、茵陈、当归、甘草为合剂，取各味10，熬汁拌料投喂；三

20、都镇青山一带养殖户用金银花、板兰根、茵陈、龙胆草、当归、甘草为合剂(用量用法同上)，均取得较好的疗效。宁德市水技站试验场以黄芪、黄芩、连翘等为主药配制的“平肝解毒止血散”被当地养殖户推崇为治疗海水鱼肝肾病的首选药物。实践证明，中草药防治鱼病，疗效好、药残量低是一种理想的天然、环保型渔药。因此，在提倡健康养殖、打击餐桌污染以及随着我国加入WTO后，如何应对国际食品质量安全技术壁垒等新形势下，积极开发、研制、推广中草药防治鱼病，有着十分重要的现实意义和战略意义。1.4.1中草药有效成分的药效学研究中草药种类繁多，结构复杂，成分多样。研究表明，中草药不但含有大量的生物碱、挥发油、苷类、有机酸、鞣质、

21、多糖、多种免疫活性物质和一些未知的促生长活性物质，而且还含有一定量的蛋白质、氨基酸、糖类、矿物质、维生素、油脂、植物色素等营养物质。这些成分可以促进动物机体的新陈代谢和蛋白质、酶的合成，从而加速水产动物的生长发育，提高免疫力，增强体质，降低发病率和死亡率。几种常见中草药化学成份见表11.4.2中草药在水产健康养殖中的应用中草药以其天然，环保，无残留等优点引起人们的广泛关注，中草药还具有抗菌，促进免疫功能的有利改善以及提高机体抗病能力等作用，克服了化学药物和抗生素类药物的缺陷，此外中草药还能调节鱼体的新陈代谢，提高应激能力，具有抗生素作用，营养作用，双向调节作用以及诱食作用等功能。因此中草药作为

22、作为饲料添加剂，并已成为当今水产业研究的热点9。1.4.3中草药在鱼病防治应用中存在的问题 药材质量不稳定 由于季节、产地、炮制方法等不同，同一种中草药，其有效成份含量差异很大，有时同样的配方却疗效不同。目前还没有科学的手段对中草药的质量进行检测、控制。加工工艺原始 目前中草药的加工大多以原药粉碎或切碎煎熬，其配方多为粗制型产品，剂量使用偏大，适口性也差，不利于规模化生产、推广、应用。同时，中草药在粉碎时，其药粉粒度的大小与其有效成份的释出和动物的吸收有很大关系。应采取先进的生产工艺，对中草药进行提取、精制，使其向微量化、系列化、专用型方向发展。对渔用中草药的药效、药理研究薄弱 目前中草药作为

23、渔药还处于摸索阶段，对药物的有效成份难以确认，治病的药理尚不十分清楚，使用的剂量没有严格的规范标准。应加强对渔用中草药药效、药理的基础研究，制定规范的产品标准和剂量标准，使相关的生产、监察部门有章可循。1.5 本文研究目的目前对于烂尾病的病原菌说法尚未统一，治疗烂尾病的药物主要有甲苯咪唑、吡喹酮、阿维菌素、伊维菌素、敌百虫、辛硫磷等原料药。由于这些药物长期使用, 造成了用药量不断增大, 耐药性显著增强, 致使治疗效果明显下降。其中有些化学药物不易降解, 有些禁用化学药物和残留不但污染环境, 而且残留在鱼体内严重危害人类健康。因此, 寻找能够替代现有化学药物的无公害、环保型的杀虫药物迫在眉睫。鉴

24、于鱼类指环虫病继发感染病原菌的研究报道尚较少，为丰富该病继发感染的一些主要生物学性状及有效检验提供一定的参考，本文旨在分离得到的感染细菌，并进行的形态特征、主要理化性状及系统发育、病原学、药物敏感性等方面检验。为防治该细菌引起的疾病提供理论基础。现将本文分离到的一株纯培养菌Y2进行的形态特征、主要理化性状及系统发育、病原学、药物敏感性等方面检验结果作如下报告。2材料与方法2.1细菌分离2.1.1 培养基：胰胨豆胨（TSA）配方： 酪蛋白胰酶消化物15g；大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g；氯化钠 5g；琼脂 15g；纯化水 1000ml；配制方法：取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值使灭菌后为

25、7.3±0.2，加入琼脂，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约60，在无菌操作要求下倾注约20ml，至无菌平皿（90mm3 ）中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基平皿宜在2-8保存。麦康凯，伊红美蓝，SS选择培养基均为商品化合成培养基，按标签提供的方法进行配制，倾注平板，并按上述方法进行保存。2.1.2 细菌来源：取实验室养殖的患病草鱼，进行发病情况调查后取发病濒死鱼及新鲜病死鱼做病理变化检验。用消毒后的手术剪刀解剖腹腔，用无菌的接种环从其肾脏，肝脏，脾脏，肠道以及鳍基充血处分别取样，划线接种于平板培养基上。首先将培养基接种在TSA培养基上，28培养2447h，选取生长良好且于各器官

26、分离平板均有生长的单菌落再进行划线纯化，反复几次，直到获得纯种后，大量培养，并编号为WH125。2.2病原菌的生理生化鉴定2.2.1形态与菌落特征检查取WH125纯培养菌，分别移接于普通营养琼脂斜面各2管分置28、37培养18h，无菌状态下取分离株分别进行革兰氏染色后，滴生理盐水于载玻片，取病原菌菌落少许放入水滴中，均匀涂布，使其自然干燥。菌面向上，在酒精灯上方快速的来回几次，不超过3 s。滴结晶紫染液染色2 min，之后细流水冲洗，用碘液冲去残水，在白色背景下，滴加95的乙醇脱色。之后用番红染液染色2rain，细流水冲洗后晾干。镜检按照从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序观察。各菌株分别划线接种于

27、普通营养琼脂、再将纯化了的细菌分别接到麦康凯，伊红美蓝，SS选择培养基上，观察细菌的生长情况。置28培养24h和48h，分别检查生长情况及菌落特征。2.2.2理化特性分析本实验采用法国梅里埃公司的VITEK 2 System快速鉴定仪进行细菌生理生化指标的检测。具体方法如下，将纯培养的WH125待鉴定菌落， 无菌转移至清洁试管中。使用接种针或棉棒接种形态相同菌落至无菌生理盐水，使用VITEK 2 浊度计制备麦氏浊度为0.50-0.63的均一微生物菌悬液（注：悬浮接种物接种于卡前，不能超过30分钟。）； 将悬浮管及GN卡置于卡槽；GN卡选用革兰氏阴性细菌鉴定卡（VITEK 2 Gram-Nega

28、tive identification card；VITEK 2 GN Test Kit），GN鉴定卡根据已建立的生化方法及新发展的底物，进行43个生化反应测定碳源利用，酶活性和耐药性，最终鉴定结果约需要8小时可用。鉴定条主要组成成分详见附表1.表1.革兰氏阴性细菌鉴定卡Table.1 VITEK 2 Gram-Negative identification card；VITEK 2 GN Test Kit此方法需材料如下：VITEK 2 GN卡VITEK 2 浊度计VITEK 2浊度计电源适配器VITEK 2浊度计锂电池VITEK 2比浊仪定标物VITEK 2试管架无菌盐水（0.45-0.5

29、0NaCl，pH4.5-7.0）12×75mm清洁塑料管无菌针或棉棒合适的琼脂培基（参阅培养所需表）可选配件：盐水分配器准备分配盐水的试管试管帽漩涡震荡器2.3 待测细菌WH125的分子生物学鉴定2.3.1实验材料实验菌：菌株WH125。2.3.2模板DNA的制备细菌于TSA平板25 培养24 h。挑取单一菌落悬浮于无菌去离子水中，100 水浴5 min，冷却后4 10 000 g/min离心10 min，上清液即为PCR扩增反应的模板。2.3.3基因序列的PCR扩增与测序用于16S rRNA基因PCR扩增的正向引物为27F：5-AGAGTTTGATC (C/A)TGG CTCAG-

30、3 (对应于E. coli 16S rRNA基因的第8-27个碱基位置)，反向引物为1492R：5-TACGG (C/T) TACCTTGTTACTT-3 (对应于E. coli16SrRNA基因的第1 492-1 510个碱基位置)。100 µL PCR反应体系中含有：10 µL 10×PCR缓冲液，6 µL 25 mM MgCl2，2 µL 10 mM 4×dNTP，引物各1 µL，Taq DNA聚合酶（5 U/µL）1 µL，模板DNA2.5 µL。PCR反应条件为：94 预变性4 min

31、；94 变性30 s，55 复性30 s，72 延伸60 s，30个循环；最后72 延伸6 min。PCR产物经琼脂糖电泳确定特异条带后，直接交由上海华津生物工程技术公司进行PCR产物的纯化和序列测定。2.3.4序列分析与系统发育树的构建将待测细菌的16S rRNA序列，通过Blast从国际互联网GenBank数据库中（）检索与其同源性较高的细菌基因序列，从中选取2530株与所分析的细菌基因序列同源性较高的已知标准菌株，采用Mega5.0软件，先选取所有序列运用ClustalX进行多序列匹配排列，用采用邻位相连法（Neighbor-joi

32、ning method）获得系统发育树，通过自举分析（Bootstrap）进行置信度检测，自举数集1000次。2.3.5菌种的归类判定以经上述表型性状鉴定结果，主要依据Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed（Holt et al., 1994）、Bergeys Manual of Systematic Bacteriology（Krieg et al., 1984）、Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish（Austin et al., 1987

33、；1999）、常见细菌系统鉴定手册（东秀珠等，2001）及有关资料，进行分离菌的种属判定。2.4 细菌的药物敏感性测定本实验采用两种方法对细菌的药物敏感性进行了测定，中药成份采用传统的琼脂扩散法及KB法进行测定，常用西药成份的敏感测定则运用法国梅里埃公司的VITEK 2 System革兰氏阴性细菌药敏卡片进行测定2.4.1中药药敏测定采用定性测定的纸片扩散法(disk diffusion test)，即K-B法，具体如下：步骤:1) 用量筒量取300ml蒸馏水，备用；2) 用打孔器打约200个小圆片备用3) 用电子秤称取1g中药药品于1000ml烧杯中；4) 将量取的蒸馏水加入烧杯；5) 将烧

34、杯放在电热炉上煮沸至剩余100ml液体，停止加热，取下烧杯，冷 却；6) 将冷却的液体过滤到烧杯中，弃掉残渣；7) 将过滤后的液体取适量倒入培养皿，加入一定量的小圆片，每个培养皿中的小圆片不能重叠。8) 然后将培养皿放入冰箱，24h后取出圆片，晾干；备用9) 在超净工作台中（工作台使用前灭菌30分钟），用移液枪取一定量的细菌培养液涂布在培养皿上，间隔一定的区域分别贴上上述小圆片，然后将培养皿放入培养箱。24h后观察细菌生长情况2.4.2 西药药物敏感性测定 作生理生化鉴定实验时将VITEK 2 System革兰氏阴性细菌药敏卡片同时放入机器相应插槽内，将相应该数据读出，药敏卡的主要测定项目如表

35、2表2.药敏卡的主要测定项目Table4. Measurement items of antimicrobial susceptibility test杀菌剂 代码 浓度g/ml 调用范围 Camme de C.M.I.阿米卡星AN8,16,64264氨苄西林AM4,8,32232氨苄西林/舒巴坦SAM4/2,16/8,32/162/132/16氨曲南ATM2,8,32164头孢唑啉CZ4,16,64,464头孢匹美FEP2,8,16,32164头孢替坦CTT2,8,32464头孢他啶CAZ1,2,8,32164头孢曲松CRO1,2,8,32164环丙沙星CIP0.5,2,40.254厄他培南

36、cETP0.5,1,60.58ESBLESBFEP1,CTX0.5,CAZ0.5,FEP/CA1/10,CTX/CA0.5/4,CAZ/CA0.5/4NEGPOS庆大霉素GM4,16,32116亚氨培南cIPM2,4,16116左旋氧氟沙星LEV0.5,4,80.258呋喃妥因FT16,32,6416512哌拉西林/他唑巴坦TZP4/4,16/4,128/44/4128/4妥布霉素TM8,16,64116复方新诺明SXT0.5/9.5,2/38,16/30420(1/19)320(16/304)图3.维氏气单胞菌的革兰氏染色结果Fig3.Gram stain results of Aeromo

37、nas veronii s3结果3.1病鱼症状病鱼体表局部或大部出血发炎，头部有碰伤。病鱼肝，肾有出血点，肠道偶见发炎充血，有腹水。病鱼行动缓慢，反应迟钝。3.2病原菌的生理生化鉴定对WH125纯培养菌，分别按常规做形态特征、菌落特征、理化特性等方面的鉴定，具体鉴定结果如下3.2.1形态与菌落特征图1 维氏气单胞菌在血平板上Aeromonas veronii on BA, 48 h, 25.图2 维氏气单胞菌在麦康凯琼脂上Aeromonas veronii on MCA, 48 h, 25.其菌落特征为TSA上圆形光滑、边缘整齐、灰白色、不透明，培养24 h直径多在1.6 mm左右(稍隆起)、

38、48 h多在2.0 mm左右(较扁平)，生长丰盛；在血液营养琼脂上的菌落圆形光滑、边缘整齐、稍隆起、近乳白色、溶血（见图1），培养24 h直径多在1.2 mm左右、48h多在2.0 mm 左右，生长丰盛。细菌在其他培养基上的生长状况见表3经革兰氏染色后镜检细菌，结果见均存在数量不等、同形态且大小基本一致的革兰氏染色阴性杆菌，革兰氏染色阴性、杆状、散在、两端钝圆、有些略弯，无芽孢、大小多在0.30.7 m×1.22.5 m的细菌（见图3）。表3在不同培养基上的生长表现与菌落特征Tab. 2The growth and colony characteristics of isolates

39、 in different medium培养基 菌 落 特 征麦康凯琼脂 圆形光滑、边缘整齐、较扁平、无色，培养24h直径多在1.2 mm 左右，48 h多在1.8 mm 左右(表面有皱褶)，生长较丰盛（图2）伊红美蓝琼脂 圆形光滑、边缘整齐、稍隆起、同培养基本底色(紫黑色)，培养24h直径多在0.1 mm左右、48 h多在0.3 mm 左右，生长不良SS琼脂 圆形光滑、边缘整齐、较扁平、浅橘红色，培养24h直径多在15 mm左右、48h多在20mm左右，生长较丰盛 3.2.2理化特性WH125理化特征表现了一致的结果（如表4）。表4分离菌的理化特性Tab. 3 Physiological a

40、nd biochemical characteristics of isolates特性Characteristic分离菌Isolates特性Characteristic分离菌IsolatesAPPA丙氨酸苯丙氨酸脯氨酸芳胺酶AGLTp谷胺酰芳胺酶ADO侧金盏花醇_dGLUD葡萄糖PyrA吡咯烷基芳胺酶_GGT谷胺酰转移酶+IARLl-阿拉伯醇_OFF葡萄糖发酵dCELD纤维二塘+BGLU葡萄糖苷酶BGAL半乳糖苷酶dMALD麦芽糖+H2S硫化氢dMAND甘露醇+BNAGN乙酰葡萄糖苷酶+dMNED甘露糖+水杨苷SalicinBXYL木糖苷酶BAlap芳胺酸芳胺酶_MNT丙二酸酶ProAL脯氨

41、酸芳胺酶+5KG5酮葡萄糖苷_LIP酯酶+ILATK乳酸盐产碱PLE古老糖AGLU葡萄糖_TyrA络氨酸芳胺酶+SUCT琥珀酸盐产碱+URE尿素酶_NAGAN乙酰半乳糖胺酶dSORD山梨醇_AGAL 半乳糖苷酶SAC 蔗糖+PHOS 磷酸酶dTAGD塔格糖GLYA氨基乙酸芳胺酶_dTRED海藻糖+ODC鸟氨酸脱羧酶_CIT柠檬酸钠LDC赖氨酸脱羧酶IHISA 组氨酸同化_CMT +BGUR葡萄糖苷酸酶_O129R O/129耐受+GGAA谷氨酸甘氨酸精氨酸芳胺酶_IMLTAL苹果酸盐同化_ELLM+ILATAL乳酸盐同化_注： +示阳性，-示阴性， 是1125%阳性，v，表示有变化，d示267

42、5%阳性，·示文中未记述，F示发酵型， R示抗性；荧光假单胞菌的结果来自Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed和Bergeys Manual of Systematic Bacteriology。3.3分子生物学鉴定结果测序结果表明，所扩增的16S rRNA基因序列长度为1 416bp，具体序列如图4所示。将菌株WH125的16S rRNA基因序列用Blast在国际互联网上进行检索，发现其与气单胞菌属的16S rRNA基因序列自然聚类，在相近的100个序列中，86个为气单胞菌属细菌的16S rRNA基因序列，

43、菌株WH125与它们的相似性为97%99%。从这100个序列中选取22个进行系统发育学分析，结果如图5所示，菌株WH125与简氏气单胞菌Aeromonas jandaei (NR_037013.2) 和维氏气单胞菌Aeromonas veronii（NR_044845.1）聚合。且置信度较高。因此，暂将这株的细菌暂定为简氏气单胞菌或维氏气单胞菌。CCTTGCAGTTCGAGCGGCAGCGGGAAAGTAGCTTGCTACTTTTGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACC

44、GCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGGATGAACCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAAGGTTGGTAGCTAATAACTGCCAG

45、CTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTGGATAAGTTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTAAAACTGTCCAGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGG

46、AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCTGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC

47、GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCAAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCGTACAGAGGGCTGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGCGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGAATGTTGCGGTGAA

48、TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTTA图4. WH125 16S rRNA 序列Fig. 4WH125 16S rRNA sequences图5. 16S rRNA 基因序列分析聚类图(数字为自举次数)Fig.5 Dendrogram of 16 SRNA gene sequences analysis (numbers were bootstrap values)3.4菌种判定 对菌株WH125进一步进行了其它生理生化测试，并且将测试结果查询主要依据B

49、ergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed（Holt et al., 1994）、Bergeys Manual of Systematic Bacteriology（Krieg et al., 1984）、Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish（Austin et al., 1987；1999）、常见细菌系统鉴定手册（东秀珠等，2001）及有关资料。根据比较结果，菌株WH125与维氏气单胞菌生理生化特征基本一致。因此，结合16S rRNA结果，我们将

50、该菌判定为维氏气单胞菌。3.5药敏试验结果用于此次药敏试验的中药共有8种，分别为黄莲，黄柏，白芍，当归，刺五加，党参和白术。实验结果发现，只有黄莲和黄柏产生了抑菌圈，抑菌圈的大小分别为20mm和 13mm，说明只有黄莲和黄柏对该菌均具有一定的杀灭效果，而且黄莲的效果好于黄柏。用于此次药敏试验的西药种类主要有阿米卡星，环丙沙星等，具体种类和浓度如表所示。其中敏感种类15种，耐药种类两种分别为氨苄西林和氨苄西林|舒巴坦。而环丙沙星和左旋氧氟沙星的MIC均小于0.25g/ml，并且均为常用渔药，因此可以用作治疗此菌引起疾病的主要药物。药敏试验结果见表5表5 药敏试验结果Table5. Results

51、 of the antimicrobial susceptibility test抗菌药物MIC敏感度氨苄西林32耐药氨苄西林/舒巴坦32耐药头孢唑林/他唑巴坦4敏感头孢唑林4敏感头孢替坦4敏感头孢他啶1敏感头孢曲松1敏感头孢吡乌1敏感氨曲南1敏感亚胺培南1敏感阿米卡星2敏感庆大霉素1敏感妥布霉素1敏感环丙沙星 0.25敏感左旋氧氟沙星 0.25敏感呋喃妥因16敏感复方新诺明20敏感由鉴定结果我们可以知道，维氏气单胞菌对氨苄西林，氨苄西林/舒巴坦不敏感，对头孢唑林，头孢替坦，头孢他啶，头孢曲松，头孢吡乌，氨曲南，亚胺培南，阿米卡星，庆大霉素，妥布霉素，环丙沙星，左旋氧氟沙星，呋喃妥因，复方新诺

52、明敏感。4讨论1983年，美国疾病控制与预防中心(Center for Disease control and prevention，CDC)陆续收到1l株鸟氨酸脱羧酶阳性的细菌，被编为“肠道群77(Enteric group 77)”，经鉴定其中9株气单胞菌属的新种(spnov.)， 并为纪念法国微生物学家Veronii在弧菌和气单胞菌研究中的贡献将其命名为维氏气单胞菌。在水产养殖动物方面，2000年，李本旺等曾报道从出现口咽腔溃烂的中华鳖脾脏分离到布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)和维氏气单胞菌，经对健康鳖做人工感染试验表明维氏气单胞菌能引起供试鳖100% 发病与死亡

53、。本次所检中华绒螯蟹病例，尽管为鳗利斯顿氏菌、弗氏柠檬杆菌和维氏气单胞菌的混合感染，但维氏气单胞菌经人工感染试验显示出较强的致病作用，且可单独引起感染蟹的发病与死亡，进一步提示了该菌在水产养殖动物中的病原学意义。本文用TSA等5种不同培养基做划线接种后28培养观察，发现该菌在供试的、血液(家兔血或绵羊血)营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂等4种培养基上生长均较好，在伊红美蓝琼脂培养基上生长较差。因此认为对该菌分离鉴定时，可根据情况予以选择使用。本实验采用法国梅里埃公司的VITEK 2 System快速鉴定仪进行细菌生理生化指标的检测。但由于该系统中水产细菌的各类并不全面，所以我们只采用其生理生化指

54、标，不接受其结果，最后结果的判定则是通过上述测出的生理生化指标查询Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed等参考文献，并结合分子生物学鉴定结果来确定分享菌株的种属。经以37种抗菌类药物对3株维氏气单胞菌的药敏测定 ，表明在不同菌株间对某种抗菌类药物敏感或耐药无明显差异性。但考虑到细菌对抗菌类药物耐性变异的频繁特征，也加之本次所检菌株在区域分布、菌株数量等方面的局限性，认为明确该菌的耐药规律等还需对不同区域、不同来源等大量分离株的检验。同时，在指导用药时最好是对相应病例分离株做药敏测定后选择高敏药物使用，以保证最佳防治效果

55、。中草药以其天然，环保，无残留等优点引起人们的广泛关注，中草药还具有抗菌，促进免疫功能的有利改善以及提高机体抗病能力等作用，克服了化学药物和抗生素类药物的缺陷，此外中草药还能调节鱼体的新陈代谢，提高应激能力，具有抗生素作用，营养作用，双向调节作用以及诱食作用等功能。关于中草药防治细菌性疾病的应用和报道最多。常用的药物有穿心莲，大黄，黄芪，黄连，黄柏，五倍子，地锦草，大蒜，生姜，鱼腥草，金银花，艾叶，大青叶，金樱子，紫花地丁等。用于此次药敏试验的中药共有8种，分别为黄莲，黄柏，白芍，当归，刺五加，党参和白术。实验结果发现，只有黄莲和黄柏产生了抑菌圈，抑菌圈的大小分别为20mm和 13mm，说明只有黄莲和黄柏对该菌均具有一定的杀灭效果，而且黄莲的效果好于黄柏。因此可以用黄莲对该菌引起的疾病进行治疗。维氏气单胞菌广泛分布于水体环境中，夏、秋两季繁殖较快，特别是水质恶化、水产动物机体创伤或免疫力降低时，能引起很高的死亡率，多为温和生物型的感染，患病动物以出血和腹水为主