无菌及环氧乙烷残留量检测

1、无菌及环氧乙烷残留量检测无菌及环氧乙烷残留量检测浙江省医疗器械检验所 虞海莹提纲提纲常用的灭菌方法常用的灭菌方法v灭菌的方法：灭菌的方法： 物理方法 干热灭菌 湿热灭菌 射线灭菌 滤过灭菌 化学方法 气体灭菌 药液灭菌干热灭菌法干热灭菌法v 干热灭菌法可用于能耐受较高温度，却不宜被蒸汽穿透、或者易被湿热破坏的物品的灭菌。v 分类：分类： 火焰灭菌法：火焰灭菌法：是将待灭菌物品直接置于火焰中烧灼进行灭菌的方法，灭菌迅速、可靠、简便。 适用于：耐火焰材质的物品如金属、玻璃用具或容器及瓷器等的灭菌 干热空气灭菌法：干热空气灭菌法：是将待灭菌物品置于高温干热空气中灭菌的方法，需要长时间高热环境才能达到

2、灭菌效果。 适用于：耐高温材质的物品（玻璃、金属制品等）及耐高温、不允许湿气穿透的油脂类和粉末化学药品。 干热空气灭菌常用：135145灭菌35h；160170灭菌24h；180200灭菌0.51h。湿热灭菌法湿热灭菌法 v 湿热灭菌法是通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法。v 分类分类: : 煮沸灭菌 流通蒸汽灭菌 热压灭菌 适用于：耐高温、耐高压蒸气的物品。金属或玻璃容器及用具、瓷器、橡胶塞、膜滤器等均能采用此法。 常用条件（温度、蒸气表压与时间）为：115（67kpa），30min；121（97kpa），20min；126（139 kpa），15min。v 影响湿热灭菌的因

3、素有：影响湿热灭菌的因素有： 细菌的种类与数量 器械（被灭菌物）性质 灭菌温度、压力与时间 射线灭菌法射线灭菌法常用的有：常用的有： 辐射灭菌法：辐射灭菌法： 原理是射线可直接破坏细菌dna，导致微生物死亡。辐射灭菌的特点是不升高灭菌产品的温度，穿透性强。 适用于：羊肠线、高分子材料等医疗器械的灭菌。 紫外线灭菌法：紫外线灭菌法： 是利用紫外线作用于菌体核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外光波长190-350nm之间，其中波长为260nm左右，对微生物的生物效应最大。 适用于：无菌室、某些工作区的空气灭菌、物体表面灭菌。 微波灭菌法：微波灭菌法： 采

4、用频率300mhz300kmhz的电磁波照射产生热能杀灭微生物的方法。紫外线照射灭菌时注意的问题紫外线照射灭菌时注意的问题 紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。紫外线灯平均寿命一般为2000h。 紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40 50倍。 紫外线照射通常按相对湿度为60的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。 紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。 紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况，参考使用说明决定 滤过除菌法滤过除菌法 v 滤过除菌法：滤过除菌法：指用

5、滤过方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌方法，供除菌用的滤器，要求能有效地从溶液中除净微生物，溶液能顺畅地通过，容易清洗，操作简便。 v 适用于：适用于：对热不稳定的药物溶液、气体、水等的除菌。v 常用除菌滤器常用除菌滤器（应在无菌操条件下进行）： 0.22m或0.3m的微孔滤膜 g6垂熔玻璃滤器化学灭菌法化学灭菌法v 气体灭菌法：气体灭菌法：指用化学药品的气体或蒸气杀灭微生物的方法。 常用气态杀菌剂：为环氧乙烷、甲醛、丙二醇、臭氧、乳酸、过氧 乙酸等。v 药液灭菌法药液灭菌法: : 药液灭菌法利用药液杀灭微生物的方法。 常用的有0.1%0.2%苯扎溴铵溶液，75%乙醇、2%煤酚皂溶

6、液、1%聚维 酮碘溶液等。 小结小结v 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌: : 工作服、口罩、稀释液等，置高压杀菌锅内，一般采用121灭菌半小时, 不同的培养基有不同的要求,应分别处理。v 火焰灭菌：火焰灭菌：接种针、接种环等可直接火焰灭菌。v 高温干燥灭菌：高温干燥灭菌：各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160灭菌2小时。v 一般消毒一般消毒: : 无菌室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法进行灭菌，必须用其他方法进行消毒处理，可采用适当的消毒液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒。v 空气的消毒：空气的消毒：开启紫外灯照射3060分钟即可。 提纲提纲环氧乙烷灭菌相关知识环氧

7、乙烷灭菌相关知识v 环氧乙烷灭菌利用环氧乙烷在常温下为气态，蒸汽压较大，对灭菌物品的穿透性强，可以穿透微孔而达到物品的深部，环氧乙烷是一种非常活泼的灭菌剂，杀菌能力强且广泛，有很强的穿透能力，适合于包装物品的灭菌，对物品损坏轻微，且费用较低。现大部分的医疗器械生产企业采用此种方法灭菌。v 环氧乙烷能够高效地对医疗产品进行灭菌，在杀灭微生物的同时医疗产品上的环氧乙烷残留也会对使用者和患者的身体带来一定的毒害。其毒性包括两个方面： 一为环氧乙烷本身的毒性。通过呼吸器官吸入体内刺激呼吸道，引起恶一为环氧乙烷本身的毒性。通过呼吸器官吸入体内刺激呼吸道，引起恶心、呕吐、头昏、头痛、嗜睡等症状。严重者可引

8、起肺水肿；通过皮肤、心、呕吐、头昏、头痛、嗜睡等症状。严重者可引起肺水肿；通过皮肤、粘膜接触后，引起红肿、水泡及血泡，严重者可出现局部皮肤烧伤及粘粘膜接触后，引起红肿、水泡及血泡，严重者可出现局部皮肤烧伤及粘膜组织灼伤，造成毛发脱落；超量进入人体血液内，可致红细胞溶解，膜组织灼伤，造成毛发脱落；超量进入人体血液内，可致红细胞溶解，补体灭活和凝血酶破坏引起全身性溶血。补体灭活和凝血酶破坏引起全身性溶血。 二是灭菌后生成物的毒性。环氧乙烷与氯元素接触产生毒性很大的氯醇，二是灭菌后生成物的毒性。环氧乙烷与氯元素接触产生毒性很大的氯醇，与水接触形成乙二醇，对环境和种植物的生产起到很大的破坏作用。与水接

9、触形成乙二醇，对环境和种植物的生产起到很大的破坏作用。 环氧乙烷灭菌相关知识环氧乙烷灭菌相关知识v 医疗器械产品如采用环氧乙烷灭菌，应由有资格的人员负责设备维护灭菌的确认和常规控制及产品放行工作。应不断提高各类人员对环氧乙烷残留量造成健康风险的意识， 首先经环氧乙烷灭菌的医疗器械必须按规定进行解析，即纸塑包装灭菌首先经环氧乙烷灭菌的医疗器械必须按规定进行解析，即纸塑包装灭菌后解析后解析7 7天，全塑包装灭菌后解析天，全塑包装灭菌后解析1414天，并经检测确定器械上的环氧乙烷天，并经检测确定器械上的环氧乙烷残留量小于残留量小于1010g/gg/g后出厂；后出厂； 其次经环氧乙烷灭菌的医疗器械应采

10、用透气性好，有助于消除残留环氧其次经环氧乙烷灭菌的医疗器械应采用透气性好，有助于消除残留环氧乙烷的纸塑包装，以最大限度地降低环氧乙烷残留，降低器械使用的风乙烷的纸塑包装，以最大限度地降低环氧乙烷残留，降低器械使用的风险；险； 第三体积越大，环氧乙烷含量绝对就越高；对于医用敷料、无纺布、合第三体积越大，环氧乙烷含量绝对就越高；对于医用敷料、无纺布、合成医用乳胶手套等对环氧乙烷气体有很强的吸附性，吸附在这类产品上成医用乳胶手套等对环氧乙烷气体有很强的吸附性，吸附在这类产品上的残留量很难彻底解析，所以对此类产品，不应选用环氧乙烷灭菌。的残留量很难彻底解析，所以对此类产品，不应选用环氧乙烷灭菌。环氧乙

11、烷残留量测定方法环氧乙烷残留量测定方法v 气相色谱法v 比色分析法原理：环氧乙烷在酸性条件下水解成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，甲醛与品红-亚硫酸试液反应产生紫红色化合物，通过比色法分析可求得环氧乙烷含量。所用试剂：高碘酸，硫代硫酸钠，无水亚硫酸钠，碱性品红，盐酸，乙二醇等浸提方法：分模拟使用浸提法和极限浸提法。模拟使用浸提法：用0.1mol/l盐酸作为浸提介质,整个或部分与人体接触的器械在37(人体温度)浸提,不直接与人体接触的器械在25(室温)浸提.浸提时间应考虑在推荐或预期使用最为严格的时间条件下进行,但不短于1h.浸提表面为器械与药液或血液接触的表面.极限浸提法:取样品上有代表性

12、的部位,截为5mm长碎块,称取2.0g置于容器中,加0.1mol/l盐酸10ml,室温放置1h,作为供试液;对于容器类样品,可加0.1mol/l盐酸至公称容量,在371下恒温1h.环氧乙烷残留量环氧乙烷残留量v 试验步骤 绘制标准曲线：取5支纳氏比色管，分别精确加入0.1mol/l盐酸2ml,再精确加入0.5m、1.0ml、1.5ml 、2.0ml 、2.5ml乙二醇标准溶液。另取一支纳氏比色管，精确加入0.1mol/l盐酸2ml作为空白对照。于上述各管中分别加入高碘酸溶液（5g/l)0.4ml，摇匀，放1h，然后分别滴加硫代硫酸钠溶液（10g/l）至出现的黄色恰好消失。再分别加入品红-亚硫酸

13、试液0.2ml，用蒸馏水稀释到10ml，摇匀，35 37 条件下放置1h,于560nm波长处以空白液作参比，测定吸光度。绘制吸光度-体积标准曲线。试验方法：精确量取供试液2.0ml于纳氏比色管中，按上面的步骤操作，以测得的吸光度从标准曲线上查得试液相应的体积。、提纲提纲微生物检验基础知识微生物检验基础知识 无菌技术：无菌技术：是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材以及无菌操作。 无菌环境设施无菌环境设施 无菌室的使用与管理要求 超净工作台的使用与管理要求 生物安全柜 无菌试验器材无菌试验器材 无菌操作：无菌操作：

14、 概念：是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。 注意事项。提纲提纲医疗器械无菌检查引用标准医疗器械无菌检查引用标准v 中华人民共和国药典中华人民共和国药典20052005版版v / /医用输液输医用输液输血注射器具检验方法第部分：生物学试验方法血注射器具检验方法第部分：生物学试验方法无菌检查法的定义无菌检查法的定义v 中华人民共和国药典中华人民共和国药典20052005版：版：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品，医疗器具，原料，辅料及其他品种是否无菌的一种方法v / /：本试验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试

15、品是否有细菌和真菌污染无菌检查方式无菌检查方式v 直接接种法直接接种法v 薄膜过滤法薄膜过滤法主要设备主要设备v 超净工作台超净工作台v 恒温培养箱恒温培养箱v 恒温水浴箱恒温水浴箱v 压力蒸汽灭菌器压力蒸汽灭菌器v 电热干燥箱电热干燥箱v 光学显微镜光学显微镜主要器具主要器具v试管及试管架试管及试管架v酒精灯酒精灯v7575乙醇棉乙醇棉v灭菌刻度吸管灭菌刻度吸管(1ml)(1ml)v灭菌平皿（灭菌平皿（9cm9cm）v锥形瓶锥形瓶v三角烧瓶三角烧瓶v灭菌剪刀、镊子等灭菌剪刀、镊子等主要培养基主要培养基v流体硫乙醇酸盐培养基流体硫乙醇酸盐培养基v改良马丁培养基改良马丁培养基v营养琼脂培养基营养

16、琼脂培养基稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液及其制备方法 v 无菌氯化钠溶液：无菌氯化钠溶液：质量浓度为9g/l的无菌氯化钠溶液v 蛋白胨水溶液（蛋白胨水溶液（ 0.10.1 ） 制备方法：制备方法： 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节ph值至7.10.2，分装，灭菌。v ph7.0ph7.0氯化钠氯化钠- -蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液 制备方法：制备方法： 取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌 培养基要求培养基要求v 用于培养需（厌）气菌和真菌的培养基的制备、培养基灵敏度检查及其

17、他各项要求应符合中国药典（二部）附录中无菌检查法的规定。v 培养基可按药典的处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。制备后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在225、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用;若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。培养基培养基灵敏度试验的菌种灵敏度试验的菌种v 金黄色葡萄球菌v 枯草芽孢杆菌v 铜绿假单胞菌v 生孢梭菌v 白色念珠菌v 黑曲霉:中国医学细菌保藏管理中心器具灭菌器具灭菌v 与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，通常置压与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，通常置压力蒸气灭菌器内力蒸气灭菌器内1

18、2130min12130min，或置电热干燥箱内，或置电热干燥箱内1602h1602h。 无菌室菌落数要求无菌室菌落数要求v 无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100100级单向级单向流空气区域要求。流空气区域要求。v 无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。 方法方法：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20ml，在3035培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好，置3035培养48h后取出检查，3只双碟上生长的菌落

19、数平均不得超过1个.v 无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开平皿盖，至试验结束盖好照上法培养，验开始进行时打开平皿盖，至试验结束盖好照上法培养，应符合上述要求。应符合上述要求。阳性对照阳性对照v 应根据供试品特性选择阳性对照菌：应根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌； 抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希氏菌为对照菌； 抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌； 抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。v 阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查（大肠埃希阳性对照试

20、验的菌液制备同培养基灵敏度检查（大肠埃希氏的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌）氏的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌） 加菌量小于加菌量小于100cfu100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养养基接种的样品量。阳性对照管培养48487272小时应生长良小时应生长良好。好。 供试品数量供试品数量v 同一批号至少同一批号至少3 3个个1111个单位供试品。个单位供试品。v 批出厂产品最少检验数量：批出厂产品最少检验数量： 个：个： 或个（取较大者） ： 或件（取较少者）上市抽验样品（液体制剂）的最少检

21、验量上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量1 1 全量全量20201 1v v5 5 半量半量10105v5v20 20 2ml2ml101020v20v50 50 5ml5ml101050v50v100 100 10ml10ml101050v50v100100（静脉给药）（静脉给药） 半量半量1010100v100v500 500 半量半量6 6v500 v500 500ml500ml6 6上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量 v m50mg m50mg 全量全量 2020v 50mg50mgm m300mg 300mg 半量半量 1010v 300mgm3

22、00mgm5g 150mg 105g 150mg 10v m5g 500mg 10m5g 500mg 10v 外科用敷料棉花及纱布取外科用敷料棉花及纱布取100mg100mg或或1cm1cm3cm 103cm 10v 缝合线、一次性医用材料整个材料缝合线、一次性医用材料整个材料 2020v 带导管的一次性医疗器具（如输液袋）带导管的一次性医疗器具（如输液袋） 1010v 其他医疗器具整个器具（切碎或拆散开）其他医疗器具整个器具（切碎或拆散开） 2020备注备注v 每种培养基各接种每种培养基各接种1010支供试品。支供试品。v 如果医用器械体积过大，培养基用量可在如果医用器械体积过大，培养基用量

23、可在2000ml2000ml以上，将以上，将其完全浸没。其完全浸没。供试液制备及接种供试液制备及接种v 制备及接种优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。v 如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使介质充分洗提供试品的浸提表面。 管类器具：管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1ml浸提介质，流量约为10ml/min; 容器类器具：容器类器具：容器内已装有液体的或直接抽取容器内液体为供试液;空容器按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1ml，振摇数次。 实体类器具：实体类器具：实体类器具按表面积每10cm2加入加入浸提介质1ml，振摇数次。 v 供试液制备

24、应按无菌操作法进行，在制备后供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2h2h内使用。内使用。接种后的培养基接种后的培养基培养基装量培养基装量v 直接接种法即每支供试品按规定量分别接种到各含硫乙醇直接接种法即每支供试品按规定量分别接种到各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。v 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的试品体积不得大于培养基体积的1010，同时，硫乙醇酸盐，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于流体培养基每管装量不少于15ml15ml，改良马丁培养基每管装，改良马丁培养基每管装量不少于量不少于10ml10ml。v 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。培养及观察培养及观察v 上述含培养基的容器按规定的温度培养上述含培养基的容器按规定的温度培养1414天。培养期间应天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中培养基出现浑浊，培养培养过程中培养基出现浑浊，培养1414天后，不能从外观上天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液