植物细胞工程实验指导

1、实验一植物组织培养培养基的配制【实验目的】通过实验，掌握常用ms培养基的配制。【仪器及试剂】1. 仪器：500 ml试剂瓶4个,100 ml试剂瓶4个，高压灭菌锅, 电子天平，烧杯（大、中、小各2个），玻璃棒，移液管，搪瓷缸， 培养瓶，电炉，ph计或精密ph试纸，容量瓶（大、中、小各1个）2试剂：见ms培养基的配制方法一览表【操作步骤】1、母液的配制：为了避免每次配制培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人 们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称 量后放在一起，成为一种浓缩液，这种浓缩液就叫“母液”。%1 大量元素：一般配成使用浓度的1020倍，浓度太大的母液 在冰

2、箱保存时会结晶。除钙盐外，其它大量元素按一定倍数分别称量 并分别用蒸啊水溶解后混合在一起，最后加蒸啊水定容。钙盐要单独 配制，不能和po? so?混合，以免生成ca3（po4）2或casos发生 沉淀。%1 微量元素：微量元素因用量小，为称量方便及精确起见常配成 100倍或1000倍的母液，即每种化合物的量加大100倍或1000倍， 逐个溶解并混合在一起。%1 铁盐：微量元素中的铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁 （feso4 - 7h2o） 5.56 克和乙二镀四乙酸二钠（na2edta） 7.46 克溶于1升水中配成。每配1升培养基加铁盐5毫升。%1 有机物质：主要指氨基酸和维生素物质，它们都是

3、分别称量及 分别用容量瓶配成所需浓度（0一10毫克/毫升），用时按培养基配 方中要求的量分别加入。这些化合物都易溶于水，直接用水配制。%1 生长调节物质：一般配成0.1 1.0毫克/毫升。生长素类iaa、naa、2,4d等，配制时先按要求浓度称好药品, 置于小烧杯中，用12毫升0.1 n氢氧化钠溶解，再加蒸憎水稀释 至所需浓度。如果用少量95%的乙醇来溶解亦可，有时效果不如氢 氧化钠好。配制细胞分裂素类物质时，则宜先用少量0.5 n或1 n盐酸来溶 解，然后加蒸馄水至所需量。2、配制培养基%1 吸取各种母液，按培养基配方吸取一定量的各种母液混合在一 起。大量及微量元素的母液吸取量为：母液吸取量

4、（ml）=配制培养基的数量（ml） /母液扩大倍数 有机物及生长调节物质的母液吸取量为：母液吸取量（ml）=每升培养基要求的含量（mg） /每毫升母 液中的含量（mg）%1 称取一定量的蔗糖（或葡萄糖等），溶解后与1混合。%1 称取一定量的琼脂，加蒸憾水，加热使其熔化成透明状后， 和1合并。%1 用热蒸憾水定容到一定体积，继续加热，不断搅拌，直至琼脂 完全溶解。%1 用ph计或精密ph试纸测ph值，用1 n或0.1 n氢氧化钠 或盐酸将培养基的ph值调至5.8-6.0o%1 将配好的培养基用漏斗或分装器分装到干净的培养瓶内。琼脂 约在40°c时才凝固，所以有足够的时间来进行分装工作。

5、%1 用封口膜封口，并对不同的培养基及时做好标记。通常培养基应在汽相120°c的条件下在高压锅内灭菌20分钟。在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上升到0. 5公斤/厘米彳时, 放一次气，然后在温度达120°c、1.1公斤/厘米彳时，保持此压力灭 菌15-20分钟。灭菌完成后，待灭菌锅的压力0降到时，打开灭菌 锅，取出培养瓶，放平，待培养基凝固后备用。【注意事项】1. 实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。2. 用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将 其放在小烧杯中称量。3各种母液应保存在24°c的冰箱中，以免变质、长霉。4卩引哆乙酸（ia

6、a）受热不稳定，所以不能和培养基一起灭菌，要过滤除 菌。5.用高压灭菌锅时，一定要先检查一下其中的水是否合适。附：ms培养基的配制方法一览表:母液编号化合物含量（ml/l）母液吸取量（ml/l）称量（mg）配制量（ml）1nh4no3 kno3kh2po4mgso4 7h2o165019001703701650019000 1700 3700500（扩大20倍）502cacl2 2 h204404400同上503znso4 7h2omnso4 4h2oh3bo33namoo4 2h2ocuso4 5h2ococ12 6h2oki8.622.36.20.250.0250.0250.8343011

7、1531012.51.251.2541.5500（扩大100倍）104na2-edtafeso4 7h2o37.327.8746556100（扩大200倍）55盐酸硫胺素（vb（） 盐酸毗哆素（vb6） 甘氨酸烟酸0.40.520.5202510025500（扩大100倍）106肌纯1001000100107蔗糖3%30 g8琼脂0.6-0.8%6 8 g激素阿哆乙酸ba （6节基腺嚓吟）1.01.010101001001010实验二植物叶片的脱分化和再分化培养【实验原理】分化了的植物叶片细胞往往具有全能性，在一定条件下进行离体 培养，给于一定的营养与激素，可以脱分化为愈伤组织，由愈伤组织 在

8、一定的条件下逐渐形成具有两极性的胚状体，经过进一步的分化培 养，给于不同的营养与激素成分，又可以主出完整的小植株。【实验目的】通过实验，掌握无菌操作方法，将烟草叶片培养成愈伤组织；将 愈伤组织分化成幼苗。【仪器、材料及试剂】1. 仪器：超净工作台，无菌滤纸、剪刀、银子、大培养皿、无 菌烧杯2. 材料：烟草无菌苗和室外培养的烟草幼苗3. 试剂"70%的乙醇，0.1%的升汞，无菌水【操作步骤】1操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，再用70%的乙醇消毒，尽量做到不带菌。2将装有无菌苗的培养瓶用70%的乙醇消毒后放在超净工作台 上备用；将室外培养的烟草先用自来水洗净后，再用70%的乙醇消 毒

9、12秒钟，再于0.1%的升汞中消毒5-10分钟。再于无菌条件下 用无菌水冲洗45遍，用无菌滤纸吸干后备用。3接种，将上述材料在无菌条件下剪成0.5 cmx 0.5 cm大小，接 种于诱导培养基ms + ba1.0 + naa0.1中诱导愈伤组织，在此培养基 上能诱导出愈伤组织并能长出小芽。4状苗生根培养，将3中培养的带有愈伤组织的小芽接种在ms 基本培养基中，芽能长成幼苗并且能生根。【注意事项】1. 操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦 试。试剂等瓶口也要擦试。2点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金 属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以

10、免烧焦组织。3. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。4. 注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在回收的 容器中，不能直接倒入下水道中。【实验报告】观察并记录接种的烟草脱分化的情况。【思考题】1. 接种的烟草组织有无污染？为什么？2愈伤组织细胞是否出现绿色？讨论其來源与影响？3烟草组织经过分化培养、长出完整的植株，说明什么问题？在理论和实践中有何价值？实验三玉米成熟胚的培养【实验原理】成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚，它培养极易成功。在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能培养成幼苗。【实验目的】1 掌握胚培养的方法2了解在种子萌发过程中胚各部分之间的互作

11、，以及胚的各个组成部分的形态发生潜力。【仪器、材料及试剂】仪器：超净工作台,无菌滤纸、解剖刀、蹑子、无菌培养皿、解剖镜、培养瓶。2. 材料：成熟玉米种子3. 试剂：70%的乙醇，0.1%的升汞，无菌水【操作步骤】1 成熟玉米种子的消毒及浸泡:玉米种了用70%的乙醇消毒3-5分钟，再于0.1%的升汞中消毒 10-15分钟。再在无菌条件下用无菌水冲洗4-5遍，用无菌滤纸吸 干后放于盛有无菌水的培养瓶中，封口，浸泡23天，备用。2于无菌条件下，在解剖镜下，用银子、解剖刀剥取完全的胚， 将胚放在01.%的升汞中消毒1分钟，再用无菌水冲净后接种培养。3在无菌条件下，将完整的胚切去一部分后，再在01.%的

12、升汞中 消毒1分钟，再用无菌水冲净后接种培养。【注意事项】1. 操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦 试。试剂等瓶口也要擦试。2. 消毒的玉米种子要始终处于无菌的条件下。3点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金 属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5. 注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在回收的 容器屮，不能直接倒入下水道中。【实验报告】1 观察并记录完整玉米种子的出苗情况。2 观察并记录残缺玉米种子的出苗情况，去掉一部分后对其发芽 能力及幼苗生

13、长的情况有何影响?【思考题】玉米种子去掉一部分后对其发芽能力及幼苗生长的情况有何影响？为什么？实验!1!月季快繁【实验原理】月季的某些名贵晶种，用传统的无性繁殖法速度太慢，难以满足 人们日益增长和美化环境的需要。而采用快繁则解决了这种问题。快 繁是由单芽诱导丛生芽，再诱导丛生芽生根，从尔大大提高了繁殖的 速度。【实验目的】了解木本观赏植物的快繁技术【仪器、材料及试剂】1. 仪器：培养瓶、超净工作台，剪刀、锻子、大烧杯、无菌培 养皿、无菌滤纸2. 材料：当年生幼嫩月季枝条3试齐山70%乙醇，0.1%升汞 无菌水【操作步骤】1 取具腋芽的月季嫩茎，先用自来水冲净，再用70%乙醇消毒12秒钟，然后置

14、于0.1%升汞中消毒10分钟左右，再于超净工作台 上用无菌水冲洗4 5遍，用无菌滤纸吸干水后备用。2. 将上述材料在无菌条件下用剪刀剪成1 2 cm带腋芽的茎段， 接种于基木ms培养基上，待长出腋芽后，将其转入ms+ba1.0- 2.0+n aa0.01-0.1的培养基上，诱导丛生芽。5周一6周可继带增殖 一次，形成许多丛生芽。3诱导生根，将上述丛生芽接种于生根培养基1/2ms+ n aa0.05 上，3周后，可长出数条根。4. 移栽，将生根苗取出后，先洗去粘附的培养基，再栽植在营养 介质（蛭石+id园土（1:1）中，保持相对湿度在85%以上，并注意 通风，并定期用0多菌灵喷雾保苗。【注意事项

15、】1. 操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦 试。试剂等瓶口也要擦试。2. 消毒的月季嫩茎要始终处于无菌的条件下，接种时最好去掉直接接触药 品的两端。3点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金 属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5. 注意升汞是剧毒药品，一定不要直接用手接触，用完后要放在冋收的 容器中，不能直接倒入下水道中。【实验报告】1 观察并记录丛生芽的诱导情况。2 观察并记录丛生芽的生根情况。【思考题】想一想，什么因素影响月季的增殖、生根以及移栽成活率?实验

16、五、六 土壤农杆菌的转化实验（叶盘法）【实验原理】带有目的基因的农杆菌和植物受伤叶片共培养，可将目的基因转 入植物叶片组织，通过叶片组织的脱分化可再分化培养，可获得带有 冃的基因的植株。【实验目的】了解植物的转基因技术。【仪器、材料及试剂】1. 仪器：摇床、超净工作台，剪刀、银子、大烧杯、无菌培养 皿、无菌滤纸2. 材料：烟草无菌苗，带有目的基因的农杆菌，3试剂：2药品：70%乙醇，0.1%升汞，无菌水【操作步骤】1烟草无菌苗的获得，将烟草种子用70%乙醇消毒5分钟，然后 置于0.1%升汞中消毒10-15分钟，再于超净工作台上用无菌水冲洗 45遍，用无菌滤纸吸干后接种于基本ms培养基中，数周后

17、可长 出无菌苗。2. 农杆菌的培养，将带有目的基因的农杆菌接种于带有利福平、卡那霉素霉素和链霉素的yeb培养基（配方见附表），在28°c、黑 暗、200转的条件下培养24小时，取出后放入冰箱中备用。用时在 4000转条件下离心5分钟，再用1/2ms液体培养基悬浮。整个过程 都保持无菌。3. 烟草叶片的预培养，将烟草无菌苗在无菌条件下剪成0.5 cmx 0.5 cm大小，接种于预培养培养基ms + ba1.0+naa0.1中预培养5 10小时，目的是修复伤口。4共培养，将经过预培养的烟草叶片放入上述农杆菌中浸染5 -10分钟，取出后用无菌滤纸吸去多余的菌液，接种于共培养培养 基ms +

18、 ba1.0 + naa0.1中，于黑暗条件下共培养2天。5后培养，将4中培养2天的烟草叶片取出后接种于含有卡那霉素和哌拉西林钠的ms + ba1.0 + naa0.1培养基中培养。【注意事项】1. 操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦 试。试剂等瓶口也要擦试。2. 农杆菌的培养、贮存以及离心过程中都要保持无菌。3点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金 属器械烧灼后，要冷却后才能夹取组织，以免烧焦组织。4.不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。附：yeb培养基的配方(1000 ml)：药品称取量(g)牛肉膏5酵母提取物1

19、蛋白腺5蔗糖5mgso4 7h2o0.493【实验报告】观察并记录烟草叶片的愈伤组织诱导情况。观察并记录烟草叶片的污染情况【思考题】想一想，造成烟草叶片污染的原因？实验七原生质体融合技术【实验原理】在物理或化学融合剂的诱导下，两种不同来源的原牛质体彼此靠 近，在很小的局部区域质膜紧密连接，彼此融合，在两个原生质体之 间细胞质呈现连续状态，随着两个细胞质的扩展，融合完成形成球形 的异核体或同核体。【实验目的】掌握植物的原生质体分离、培养的一般方法和步骤及培养过程中 的无菌操作技术；了解植物的原生质体融合技术。【仪器、材料及试剂】1. 仪器：超净工作台、吸管、移液管、恒温水浴锅（37°c

20、）、无 菌离心管、离心机，剪刀，银子，培养皿，盖片，倒置显微镜2. 材料：烟草无菌苗，番茄无菌苗。3试剂：促融液，清洗介质，溶液i,硅液200, peg溶液，溶液ii【操作步骤】1.高ph高浓度ca?+诱导融合法：%1 将从烟草和番茄的幼嫩叶片中新分离出的原生质体1:1混合， 并使最终密度约为2.5x105原生质体/ml。%1 在50 g下离心35 min,使原生质体沉积在一起。%1 去掉上清液，加入2 ml促融液，在50 g下离心35 min,使 原生质体沉积。%1 把离心管置于37°c水浴中1030 mine%1 用清洗介质置换掉促融液，放置30 mine%1 用清洗介质洗2次。

21、%1 将原牛.质体悬浮在培养基中进行培养。2. peg诱导原生质体融合法：%1 将从烟草和番茄的幼嫩叶片中新分离出的原生质体1:1混合， 在50 g下离心6 min,使原生质体沉积。%1 用吸管去掉上清液，将原&质体用10 ml溶液i进行清洗。%1 将洗过的原生质体重新悬浮在溶液i中，制成密度为4%5% (v/v)的原生质体悬浮液。%1 在1个60 mmx 15 mm的培养皿中放1滴(2 3 ml)硅液200。%1 在这滴硅液上面放一张22 mmx22 mm的盖片。%1 用吸管吸取大约150 m原生质体悬浮液置于盖片上。%1 等待大约5 min,以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层。%1 在原生质体悬浮液中，逐滴加入450 u1peg溶液，在一个倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况。%1 在室温(24°c )下，将peg溶液中的原生质体保温10-20 mine%1 以10 min间隔轻轻加入2滴(每滴0.5 ml )溶液ii,再过10 min后，加入1滴原生质体培养基。(11) 每次用10 ml新鲜的原生质体培养基，以各为5 mi