PCR技术及其在动物科学领域的运用

1、pcr技术及其在动物科学领域中的运用摘要：聚合酶链式反应(pcr)是体外酶促合成特异dna片段的一种 方法，市高温变性、低温退火(复性)及适温延仲等几步反应组成一 个周期，循环进行，使冃的dna得以迅速扩增。近年来，pcr技术迅速发展并与其他技术结合衍生出了荧光定rt-pcr、pcr-dgge,多重pcr等一系列新技术，运用领域也不断拓宽，已被广泛地用于微生物 学、医学、免疫学等领域。本文通过介绍pcr技术及其在动物科学领 域中的运用，使读者对pcr技术有初步的了解并对其运用领域有概况 性的认识，更是为了今后的科学研究积累了更多的知识和提供了技术 上的支持。关键词：荧光定量pcrrt-pcr探

2、针 引物(-)pcr技术简介及其运用概述聚合酶链式反应(英文全称：polymerase chain reaction),简 称pcro聚合酶链式反应(pcr)是体外酶促合成特异dna片段的一 种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等儿步反应组成 一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵 敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核 酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何dna、rna的地 方。聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性dna序列体外引物 定向酶促扩增技术。1> pcr技术原理双链dna在多种酶的作用下可以变性解链成单链，

3、在dna聚合酶 与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎 贝，在实验中发现，i爪a在高温时也可以发生变性解链，当温度降低 后乂可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制dna的变性和复性, 并设计引物做启动子，加入dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因 的体外复制。dna的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。2、pcr工作原理类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核甘酸引物。pcr由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成： 模板dna的变性：模板dna经加热至9095°c定时间后，使模板 dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成

4、为单链，以便它 与引物结合，为下轮反应作准备；模板dna与引物的退火：模板 dna经加热变性成单链后，温度降至55、60°c,引物与模板dna单链 的互补序列配对结合；引物的延伸：dna模板一引物结合物在dna 聚合酶的作用下，于7075°c,以dntp为反应原料，靶序列为模板, 按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补 的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的 “半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成 一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百 万倍。3、pcr种类及运用(1) 、rt-pcr

5、原理：首先提起rna,然后用逆转录酶与mrna 为模板进行cdna笫一链的合成，其原理同pcr. o rt-pcr是个半定量 的试验，可以确定在mrna水平的表达差异，即在转录水平。(2) 、免疫 pcr(immuno polymerase chain reaction , tpcr ) 原理：是用一段已知dna分了标记抗体作为探针，用此探针与待测抗 原反应,pcr扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段dna分子，电泳定 性，根据特异性pcr产物的有无来判断待测抗原是否存在。免疫pcr 是迄今最敏感的一种抗原检测方法，理论上可以检测单个抗原分子, 但实践中它的敏感性受许多因素的影响,如连接分子、显示

6、系统的选 择、dna报告分了的浓度、pcr循环次数等。由于pcr产物在抗原 量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比，因此免疫pcr还可用 于抗原的半定量试验。(3) 、巢式pcr 原理：是用内外两对引物扩增拷贝数较低的 片段。先用外引物进行第一轮反应，将产物适当的稀释，然后用内引物 继续扩增巢式pcr比较适合微量dna或者石蜡组织抽提的dna。(4) 、实时荧光pcr 原理：利用荧光来检测pcr产物，pcr每 循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定ct值，从 而确定其实dna拷贝数。实吋pcr,属于定量pcr (q-pcr)的一种, 以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定

7、量分析。实寸pcr的 定量使用荧光色素，冃前有二种方法，一种是在ds dna中插入特异 的荧光色素，例如sybr green荧光染料；另一种使用一种能与增幅 dna序列屮特定寡核酸序列和结合的一种荧光探针(probe ),如 taqman探针。两种方法原理不同。sybr green荧光染料游离时不发 光，当反应体系中存在双链dna吋，sybr green与双链dna结合， 此时才发光。taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光 基团连接在探针的5,末端，而淬灭基团则在3,末端。pcr扩增时 在加入一对引物的同吋加入个特异性的荧光探针，探针完整时，报 告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收

8、pcr扩增时，taq酶的5' 3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。real time pcr与 reverse transcription pcr相结合,能用微量的rna来找出特定时 间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr的组合乂 被称之为“定量 rt-pcr (quantitative rt-pcr) ”。(5) 、原位pcr技术：原位pcr就是在组织细胞里进行pcr反应, 它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的pcr技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较人潜力

9、的新技 术。原位pcr是hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组 织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其皋本方法为：固定组 织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多 聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。蛋口酶k消化处 理：用60ug/ml的蛋白酶k将固定好的组织细胞片55°c消化处理2h 后，96°c2min以灭活蛋白酶k.pcr扩增:在组织细胞片上,加pcr 反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行 pcr循环扩增。有的基因扩增仪带有专门用于原位pcr的装置。杂 交：pcr扩增结束后，用标记的寡核昔酸探针进行原位

10、杂交。显微 镜观察结果，另外还有膜结合pcr、锚定pcr、固着pcr、原位pcr、 不对称pcr、长距离pcr、降落伞pcr、梯度pcr等30几种pcr。（二）pcr在动物科学领域中的运用1、pcr在动物产品检测领域的运用随着人们生活水平的提高，人们开始越来越关注饮食的健康与安 全。近年来，我国的畜牧业发展迅速，动物产品的产量连年增长。但 发展过程中也出现了不少的问题，动物产品的质量安全问题就尤为突 出，学有效的检测手段成了我们保障饮食健康的一道关卡。pcr技术 不断取得突破，现已成为检测食品卫生安全的有效手段。唐吉思【9】 定量pcr运用于牛乳中金黄色葡萄球菌（s. aureus）的检测，实

11、验中， 针对s. aureus sea基因片段设计一对引物，将构建的重组质粒作为 阳性对照，建立 s. aureus sea dna 的 sybr green t real-timepcr 的检测方法。实验发现该方法具有较好的特异性和敏感性，能够快速 检测牛乳中的金黄色葡萄球菌。刘胜贵【1】pcr技术检测猪肉中沙 门氏菌，对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检 测。对不同稀释度的样品进行pcr扩增，当dna含量只有0. olpg时, 还能扩增出条带，说明该方法检测猪肉中沙门氏菌具有特异性高且灵 敏、快速等特点。李敏【2】表明，将免疫磁珠技术（ims）与多重pcr 结合，24h内即可

12、检测出食品屮的单增李斯特菌，最低检测限可达 lcfu/25g(ml)o李苗云【3】冷却猪肉贮藏过程屮微生物的变化，直 接提取不同冷藏天数肉样dna,对猫16srdna的v6-v8区段进行pcr 扩增，通过dgge及序列分析，结果表明，冷却猪肉好氧贮藏过程中 的主要微生物有：热杀索丝菌、莫拉式菌、气单胞菌、假单胞菌、葡 萄球菌和节杆菌，快速检测冷却猪肉中微生物污染提供了新手段。2、pcr在动物疫病防治领域的运用pcr (聚合酶链反应)是利用dna聚合酶在体外大量扩增两段已 知序列之间的某一特定dna片段(又称模板)的分子生物学技术。这种 技术可以利用几乎所有的临床样品探查病原体基因的存在和变异，

13、从 而对生物体的状态和疫病作出诊断。因而，如何从被检临床样品中高 效、简便地提取核酸作为模板，就成为普及、推广pcr技术检测动物 疫病亟待解决的问题。近年来，荧光定量pcr在病原体检测方面得到了广泛的运用。罗 宝正【6】等将taqman探针荧光pcr运用到猪副嗜血杆菌的检测并使 hps和大肠杆菌0517、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌分开， 蔺文成【11】等利用taqman探针荧光rt-pcr方法对猪细小病毒(ppv) 感染的st细胞48小时后jak-1、jak-2、stat-1和stat-2mrna转录 水平的检测发现jak-1和jak-2转录水平显著上调,stat-1和stat-2 转

14、录水平显现下调趋势证实该方法适用于猪细胞传导因子jak和 stat的定量检测，许红丽【10】等运用荧光定量rt-pcr对犬瘟热病 毒ps株感染犬血清和粪便中病毒的检测，检测中，根据犬瘟热病毒 (cdv)核衣壳蛋白(np)基因序列设计一对特异引物，扩增np基因, 并以np基因重组质粒作为阳性标准晶，建立cdv的sybr green i荧 光定量rt-pcr方法。实验结果表明：较常规rt-pcr该方法敏感性提 高100倍，可以用于cdv病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供 快速而敏感的检测。杨少华【12】等建立了禽流感病毒rt-pcrelisa 诊断方法，通过对a型禽流感(at)保守的m基因设计

15、引物，并分别 用地高辛和生物素标记，建立检测a型aiv的rt-pcrelisa方法， 并对反应条件进行了优化，确定了最适反应条件，使得该方法的敏感 性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍以上且特异性强，克服了 样品含量少的困难，为早禽流感诊断和分子流行病学调查提供了一条 新途径。3、pcr在饲料开发与分析领域的运用在动物生产的过程中饲料的营养均衡至关重要，传统的谷物饲料一般难以满足动物对蛋白质的需要，因此需要在饲料中动物源性饲 料，以满足动物生产对蛋白质的需求。近年来，由于各种疫病的流行 和新的危害性极大的传染病的出现，动物源性饲料的安全性难以保 证。而pcr技术则为饲料中动物源性成分的检测

16、提供了有效地手段。于凤芹【4】等将实时荧光pcr法运用到检测饲料中鸡源性成分，根 据鸡线粒体dna建立taqman探针实时荧光pcr检测饲料中鸡源性成 分方法，并证实该方法特异性高，极具实用价值。4、pcr在动物遗传育种、基因表达.早期胚胎鉴定领域的运用随着分了纶物学的迅猛发展，研究动物遗传提供了理论依据和强大的技术支持。其中pcr技术也被广泛运用于动物遗传领域的研究。 赵秀华【5 r-sscp方法检测京海黄鸡、aa鸡、尤溪麻鸡、边鸡4个 鸡品种stat5b基因5'调控区部分序列的多态性，并分析其对京海黄 鸡生长繁殖性状的遗传效应发现京海黄鸡stat5b基因5'控区部分序 列的

17、多态性对其生长和繁殖性状有一定影响。张跟喜【7】pcr-sscp 技术检测边鸡生长抑制素(mstn)基因外显子的3的单核昔酸多态性, 并与边鸡的繁殖性状进行关联分析发现了 mstn基因可能是影响边鸡 繁殖性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。王 学清8 cr技术运用于牛早期胚胎性别的鉴定，在鉴定试验中裴翠 娟等根据genbank +收录的牛y染色体特异序列和牛基因组序列分别 设计公牛特异引物和内标引物，通过对引物浓度的组合、dntp浓度、 mg2+浓度、退火温度的筛选优化pcr反应体系，扩增牛基因组dna和 胚胎基因组dna,建立用于牛早期胚胎性别鉴定的多重pcr反应体系, 该

18、方法能实现奶牛良种的快速扩繁。综上所述，pcr技术日新月异的发展极大地推动了动物科学领域 的研究，为动物科学分子领域的提供了强大的技术支持。在未来，随 着pcr技术创新,还将运用在动物科学领域其他方面，做出新的贡献。 做为动物科学领域的研究者，我们应该重视pcr技术运用与创新，让 这门技术能够更好地服务于社会。参考文献：【1】刘胜贵，魏麟应用pcr技术检测猪肉中沙门氏菌的研究j 科学食品，2007, 28 (3)： 254-2562 李敏，孟谨，郑小平，等.ims-pcr对食晶中单增李斯特菌快速 检测j.乳业科学与技术.2010(3) : 1030-10323 李苗云，周光宏，徐幸莲运用pcr-dgge研究冷却猪肉贮藏过 程种的优势菌j西北农业科技大学学报,2008, 36 (9)： 185-1894 于凤芹，王金玲，庞杰，王芳，姜丽，张莹.实时荧光pcr法