临床分离嗜麦芽寡养单胞菌L1、L2酶基因克隆、测序及定位

1、临床医学论文临床分离嗜麦芽寡养单胞菌lil2酶基因克隆x测序及定位【关键词】b摘要：目的了解临床分离嗜麦芽寡养单胞菌产ll、l2 b内酰胺酶情况、 酶基因定位及核苜酸序列进化和同源关系。方法pcr法扩增两种於内酰胺酶基因， 通过克隆、测序、序列比对确定其亚型、基因进化、同源关系和基因所在位置。 结果细菌染色体dna和质粒dna扩增ll、l2酶基因阳性，其序列具有明显异质 性，两种酶基因位于12kb大小的质粒上。结论嗜麦芽寡养单胞菌绝大多数产生 两种8内酰胺酶，酶基因变异和进化加速的驱动力部分可能与8内酰胺类抗生素 的长期使用有关。关键词：b内酰胺酚；异质性；质粒cloning, sequenc

2、ing and location of genes encoding ll and l2 /3 lactamasesabstract objectives to investigate the production of ll and l2 /3 lactamases, location and evolution or homology of nucleotide sequences of their encoding genes in clinical isolates of stenotrophomonas mal tophi 1 ia.methods two /3 lactamases

3、encoding genes were ampl i f ied by pcr. the subtypes, evolution or homology and location of genes were determined by gene cloning, sequencing and sequences cont vast ing results ll and l2 genes in chromosomes and plasmids were amplificd, the gene sequences were apparently heterogeneous and the gene

4、s were located on 12kb plasmid. conclusion majority of stenotrophomonas maltophi 1 ia isolates produced two j3 lactamases gene variation and evolution acceleration partly contributed to longtime uses of 13 lactamskey words /3 lactamases; molecular heterogeneity; plasmids嗜麦芽寡养单胞菌(又称嗜麦芽窄食单胞菌)为机会致病菌，广泛

5、分布于自然 界，医院环境和医务人员皮肤分离率较高。随着医源性介入技术的应用、免疫抑 制病人的增加以及抗生素的大量使用增加了该菌的感染机会。该菌耐约性强，对 临床多种抗生索包括多数b内酰胺类耐药，是日前医院内感染的重要致病菌之一， 对b内酰胺类抗生素耐药主要因该菌产生两种b内酰胺輛(l1和l2酗)所致。本文 从临床标本中收集13株嗜麦芽寡养单胞菌，硏究其产两种"内酰胺酶的情况及酶 基因位置，探讨耐药性产生的原因。1材料和方法1.1菌株 所有菌株来源于2003年3月2004年7月解放军总医院的临床标 本，由该院微生物科分离、培养、鉴定并保存。本次实验前所有菌株均经vitek 微生物鉴定系

6、统重新鉴定，约敏试验应用复方磺胺甲口恶口坐(smz/tmp)、亚胺培南(imp)、左氧氟沙星(lvlx)和头鞄他碇(caz)4种抗生素纸片并采用纸片扩散法进行 常规药敏试验，耐药的判定点参照clsi/nccls（2000年）标准。质控菌株为铜绿 假单胞菌atcc27853和大肠埃希菌atcc25922。1.2质粒dna的提取将13株临床菌株37°c过夜培养后，分别挑取12个菌 落接种在5ml lb培养基中，220r/min 37°c恒温摇床孵育12h，采用碱裂解法抽提 质粒dna 1，粗提物5 n 1直接加样于08%琼脂糖凝胶上电泳检测，漠化乙噪染 色后收集图像。13染色休

7、dna的提取取上述菌液2m 1采用天为时代离心柱型细菌基因组dna 提取试剂盒提取染色体dna。1.4 li、l2酶基因的pcr扩增所有分子生物学试剂除特别注明外，均购自大 连宝生物工程有限公司。根据genbank注册的两种/3内酰胺酶全基因序列设计l1 嗨pcr引物（注册号x75074），扩增873bp的编码序列。l2酶pcr引物（注册号 y08562） t广增长度为905bp。弓i物由上海生工生物公司合成。l1f ： 5 ' atgcgttctaccctgctcgccttcgcc 3 “ l1r ：5，tcagcgggccccggccgtttccttggccag3， l2f ： 5

8、，cgattcctgcagttcagt3 气2r ： 5，cggttacctcatccgatc3 ' pcr 反应条件： 反应体积为 50“ 1，含 10xla 缓冲液 5“ 1，mgc12 5“ 1，dntp各 8“ 1，la dna 聚 合酶25u，基因组dna模板，弓物（20“mol/l）l“l，双蒸水195“1。扩增 l1 的条件为：94°c预变性 4min，然后 94°c lmin，68°c lmin，72°c lmin，共 30 个循环，最后72°c延伸5min。扩增l2的条件为：94°c预变性5min，然后94&

9、#176;c 30s， 55°c 30s 72°c 50s 共30个循环最后72°c延仲7min。制备10%琼脂糖凝胶pcr产物在lxtae电泳缓冲液中电泳，漠化乙碇染色，用紫外透视仪观察结果，收 集图像。1.5 pcr产物的纯化、克隆及测序pcr产物电泳后，切胶回收纯化目的条带， 然后将冃的基因与pmd18t载体连接，连接反应液转化至经氯化钙制备的大肠埃希 菌dh5a感受态细胞中，经含氨节西林(100/zg/ml)lb培养基进行蓝白斑筛选， 挑取白色菌落涂布平板，37°c过夜孵育，次日经pcr法筛选阳性菌落并接种在lb 培养基中，振摇1618h，提取质

10、粒。以重组质粒为模板，pmd18t载体的通用引 物(m13)为引物由上海华诺生物科技公司用abi prism 377 dna测序仪进行双向测 序，测序结果在gcnbank中进行序列比对分析。1.6 li、l2编码基因的定位13株嗜麦芽寡养单胞菌质粒电泳后回收不同大小 的质粒dna片断，再分别作为模板，以li、l2引物进行pcr扩增(反应体系及扩 增条件同前)，对两种酶基因进行定位。17序列比对和分子进化树构建应用blast(http:/www.ncbi ./blast/)对测序结果进行检索并比对；应用 clustal w(ht tp: /www.biosoft .net)

11、分别构建两种酶的分子进化树，进化树的核 昔酸序列有 llax75074 llbaf010282 llcaj251814 lldaj251815 lie aj 277109 ； ula511l1 aj291672 ； l2a y08562 ； l2b aj251816 ； l2c aj251817 ； l2d aj272110 ； ila511l2 af299368 以及临床分离菌的测定序列。2结果2.1药敏实验结果表1捉示所有菌株对亚胺培南耐药；对复方磺胺甲口恶哩 和左氧氟沙星敏感性较高，在半数以上；对头表1临床分离13株嗜麦芽寡养单 胞菌的部分临床特点及药敏结果年龄2.2质粒谱分析除1株外均

12、发现约12kb左右的质粒，其中2株有接近2kb的 质粒条帯，另外一株在12kb以上还有2条带。图1示提取的质粒经琼脂糖凝胶电 泳后的情况。2.3 pcr扩增和基因克隆结果以细菌染色体dna为模板，扩增li、l2基因的 结果显示，l2基因均为阳性（905bp） ； l1基因有2株为阴性，11株菌为阳性 （873bp）（图 2）。2.4重组质粒的构建和pcr鉴定结果将li、l2基因的扩增产物分别连接到 pmd18t载体后转入dh5 a感受态细胞中，经pcr鉴定重组质粒产生的片段分別为 873和905bp，符合li、l2基因的扩增片断大小。2.5测序结果对pcr扩增l1基因阳性的11株菌随机选取9株

13、进行测序，其 结果经gcnbank网上同源性比较，l1基因序列未见完全一致者。其中，1株（4号 菌）与ula511（注册号aj 291672）的序列有2个氨基酸的改变，同源性最高为 993%（在第3位由苯丙氨酸一丝氨酸，第284位由精氨酸一赖氨酸）；与avison2 分类的lib的同源性为99%（在289位由苏氨酸一丙氨酸）；另外1株（10号菌）与 lid的同源性为921%,有23个氨基酸的改变'其他菌株与lie均有较高同源性。对pcr扩增l2基因阳性的13株菌随机选取3株进行测序'l2基因的序列有1株（2号菌）与l2b氨基酸同源性为100%与ula511菌株的l2基因（注册号

14、af299368） 同源性997%。图3分别显示两类酶的同源关系及系统进化树。2.6l1、l2基因的定位分别以不同大小的质粒为模板，以li、l2引物进行pcr扩增，结果12kb 的质粒扩增到阳性片断，分别为873和905bp（图4）。2.7l1 ' l2基因的进化应用clustal w构建的分子进化树如图3。进化树可直观的表示各种酚 的进化关系，树枝长度反映进化图2以染色体为模板扩增li、l2基因的电泳图距离或同源性。图 3a表明除4、10号菌的l1基因外，多数临床分离菌的l1酶基因与lie同源性高；从进化距离看 出它们从共同祖先分歧时间相近。图3b表明所测序的3株菌勻l2b和ula5

15、11的同源性高，而所有 菌株与l2d的同源性均低。3讨论在zhang 3、denny 4等报道屮，嗜麦芽寡养单胞菌对多种抗菌药物以及一些消 毒剂表现出耐药性，其机制可能与产生水解酶、渗透屏障、外排系统以及变异迅速等有关。以往认 为两种b内酰胺酶的产生是嗜麦芽寡养单胞菌对碳青霉烯类和b内酰胺类耐约的主要原因而本硏 究的13株菌药飯结果显示，所有菌株对亚胺培南耐药，但pcr扩增l1酶基因发现有2株菌a : l1 ； b : l2pcr扩增结果为阴性，说明产生l1水解酚并不是碳青霉烯类耐药的惟一因素。另外13株菌 的临床资料表明，绝大多数患者年龄在60岁以上，有些甚至为高龄或有严重基础疾病者，多数患

16、 者近期使用过b内酰胺类抗生素1周以上，提示高龄、体弱、免疫力低下以及有严重基础疾病或长 期使用/3内酰胺类抗生素为该菌感染的易感因素。细菌质粒dna电泳发现，12株菌携带12kb大小 的质粒，li、l2基因位于该质粒上，与文献报道的li、l2基因位于200kb质粒上不同2。位 于质粒上的耐药基因可发生横向传播导致感染的暴发流行，给抗感染治疗造成极大胁。本实验中 细菌染色体dna扩增li、l2基因也为阳性，根据文献报道的该菌含有片断性染色体5，因此有 学者推测，提取的这些质粒样元件可能为片断性染色体的一部分。本硏究扩增的两类陆基因除一株 l2基因（4号菌）与l2b基因的氨基酸同源性为100%，

17、核营酸序列有2个碱基的改变外，其余多数 在70%90%之问，表现为明显的异质性。异质性的产生可能与长期使用b内酰胺类抗生素有关2， 6。根据li、l2核昔酸序列以进化树形式确定其同源关系，有助于明确其亚型和确定各类酶的特 点。图3a屮10号菌的l1酶勻lid、4号菌的l1酶与ula511及lib '5号菌的l1酶与lie的同源 性较高，lie与其他酶的相似程度较低，显示了不同于其他类型酶动力学参数2。l2酶中测序 的3株菌的序列与l2b均有较高同源性，而与l2a、l2c、l2d的同源性较低。树状图可较好地反映 酶序列的亲缘关系或进化程度并能将新发现的酶进行归类。综上所述，本实验以临床分

18、离的嗜麦芽 寡养单胞菌为硏究对象，分别以细菌染色体dna和质粒dna为模板扩增了两种/3内酰胺酚基因，发 现两种酶基因表现为明显的异质性 淇酚基因的变异和加速进化的驱动力部分可能勻/3内酰胺类抗 生素的使用有关。另外，本实验结果显示两种内酰胺酶基因位于12kb大小的质粒上，但该质粒 与染色体dna的关系尙待进一步证实。参考文献 黄培堂等译（美）萨姆布鲁克（sambrookj.）等著.分子克隆实验指南m第三版.北 京：科学出版社，2002 : 272avison m b, higgins c h, heldreich c j, et al. plasmid location and molecular heterogenei ty of the li and l2 lactamase genes of stenot rophomonas maltophilia j antimicrob agents chemother,2001,45:4133 zhang l, li x z, poole k. multiple antibiotic resistance in stenotrophomonas maltophi 1ia: involvemeni of a multidug ef