Chapter4离子交换和体积排除色谱1

1、2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 2 离子交换色谱（IEC） 原理 保留的影响因素 例子 体积排除色谱（SEC） 原理 校正曲线 凝胶过滤与凝胶渗透 影响保留的因素 例子2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 32009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 42009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENT

2、IAL 5强弱强交换剂在pH 2 至12的范围内保持离子状态弱交换剂在pH 改变时可能会变为非离子化状态2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 6优点高柱效小颗粒没有收缩或膨胀机械稳定性好能耐受有机溶剂价格低缺点2 pH 7低容量（meg/g）2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 7聚苯乙烯二乙烯基苯的合成（聚苯乙烯二乙烯基苯的合成（PSDVB）其他聚合物基础上的离子交换例, 甲基丙烯酸酯2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 82

3、009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 9优点 1 pH Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+Mn2+Ag2+Cs2+Rb2+K+NH4+Na+H+Li+ Li是最弱的 阴离子交换剂柠檬酸盐3-SO22-草酸盐2-I-NO3-CrO4-Br-SCN-Cl-醋酸盐-OH-F- 氟化物是最弱的2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 16 流动相：1M KH2PO4，pH 3.8 柱温：60 流速：4ml/min 色谱柱：Silica SCX4050602009 Wa

4、ters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 17 氨基酸 典型的应用，由Moore 和Stein在上世纪50年代末发展而来 蛋白质 无机离子 也称离子色谱2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 182009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 19色谱柱：阳离子交换柱洗脱剂A：0.2 N Na+ pH=3.0洗脱剂B：0.2 N Na+ pH=9.8梯度：0-100% B in 48 min流速：0.4 ml/min2009 Waters Corporati

5、on | COMPANY CONFIDENTIAL 20 可应用于多有的蛋白质 对生物活性有非常好的重现性 对电荷差别特别小的蛋白质分离能力非常强 对浓度小体积大的样品分离能力很好 是可分离的质量数最高 可有多种途径改善分离效果2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 21pl，等电点阳离子交换剂阴离子交换剂pH蛋白质电荷是pH的函数2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 22填料粒径：5-40m色谱柱内径：5-50mm 长度 5-30cm类型阴离子阳离子强季胺磺酸磺酸盐弱二乙基氨乙基 (

6、Diethylamine,DEAE)羧甲基(Carboxymethyl ,CM)2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 23净电荷数2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 24问题：你认为这三问题：你认为这三种蛋白质哪一种会种蛋白质哪一种会最后一个被洗脱出最后一个被洗脱出来？来？注：这三种蛋白质的净电荷均等于12009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 25色谱柱：Protein Pak DEAE 8HR 10100mm（阴离子交换）流速

7、：1.5ml/min梯度：0-200mM NaCl缓冲盐：20mM TRIS-HClC=Conalbumin （伴清蛋白）T=Transferrin （铁传递蛋白）O=Ovalbumin （卵清蛋白）S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰岛素抑制剂）2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 26用于pH梯度的Waters Auto BlendTM 方法2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 27色谱柱：Protein Pak DEAE 8HR 10100mm(阴离子交

8、换)流速：1.5ml/min缓冲盐：20mM TRIS-HCl pH 7.5梯度：0-200mM NaCl 0-200mM NaAcetateC=Conalbumin （伴清蛋白）T=Transferrin（铁传递蛋白）O=Ovalbumin （卵清蛋白）S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰岛素抑制剂）NaClNaAcetateCTOSSCTO2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 28色谱柱：Protein Pak SP 8HR 10100mm(阴离子交换)流速：1.5ml/min梯度：0-300mM NaCl缓冲

9、盐： 20mM Na Phosphate pH 5.5 20mM Na Acetate pH 5.5A=Alpha Chymotrypsinogen(胰凝乳蛋白酶原)R=Ribonuclease A（核糖核酸酶）C=Cytochrome C（细胞色素)L=Lysozyme(溶解酵素)2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 29色谱柱：Water IC-Pak A HR洗脱：硼酸盐/葡(萄)糖酸盐流速：1.0ml/min检测器：电导检测器2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 30色谱柱：

10、Water IC-Pak C M/D洗脱：3.0 mM HNO3流速：1.0ml/min检测器：电导检测器1.锂2. 钠3. 氨4.钾5.镁6.钙7.锶8.钡2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 31气相色谱液相色谱吸附/分离液相色谱离子交换体积排除色谱凝胶渗透/凝胶过滤2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 32待测无经过一个多孔凝胶固定相凝胶孔径可能是一种也可能是几种的混合，取决于所选用的柱子分离取决于在溶液中的大小而不是分子量大的先出，小的后出流向流向凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶颗粒凝胶

11、颗粒2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 332009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 34 凝胶过滤（GFC） 此名词原用于描述生物聚合物SEC，现在也指水相SEC。蛋白，多糖等，洗脱液常为水相。 凝胶渗透（GPC） 此名词原用于描述有机聚合物SEC，现在也指有机相SEC。聚乙烯，聚丙烯等，洗脱液常为有机相，如THF或甲苯。常采用高温90140（高温GPC）2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 352009 Waters Corp

12、oration | COMPANY CONFIDENTIAL 36 交联环氧丙氧基甲基丙烯酸酯 表面含有醇或二醇官能团 亲水性，阻止与极性化合物的反应 表面通常有负电荷 疏水性待测组分可与反相填料发生作用 交联聚乙烯醇2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 372009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 382009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 39 色谱柱类型/孔大小 粒径 流速 离子强度（克服IEX与表面的负电荷的反应） 有机溶剂（

13、克服与反相疏水填料的反应） 柱温2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 40 色谱柱：Protein Pak 60+125+300SW 洗脱液：100mM 磷酸盐 pH 7.4 流速：2ml/min 样品：5mg 酶混合样2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 41 由Moore在上世纪60年代在Dow化学公司开发的 GPC 是塑料工业的官方认可的方法，并被美国材料测试协会（ASTM）所采用，用于测聚合物分子量 聚乙烯（ Polyethene，PE） 塑料袋 聚丁二烯（Polybutad

14、iene ）橡胶轮胎 聚氯乙烯（ Polyvinychloride，PVC）合成革，水管 聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA）有机玻璃 聚碳酸酯（polycarbonate）CD光盘2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 42 聚合物科学家指出聚合物链的长度或大小作为其流体力学体积（hydrodynamic volume）与分子量大小相关。 分子量分布是组成一个聚合物的分子统计学的显示。聚合物有一系列的链长度的分布，因而产生分子量。 分布的形状是聚合过程（游离基、缩合等）的反映。 如果聚合物易于降解（热解、氧化），聚合物链的侧链断裂，会导致分子量

15、分布的变化。 凝胶渗透色谱分析可以测定聚合物的平均分子量或其力矩与分布。2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 43洗脱曲线形状可表达根据不同分子量相对含量所表示的聚合物分配洗脱体积洗脱体积 (保留时间保留时间)最大最大最小最小MnMwMzMpMz+1BigOnesComeOut First2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 442009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 452009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 462009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 47离子交换色谱根据化合物离子的差异进行分离重要参数包括：1 流动相的离子强度（k）2 pH（k，）3 温度（k， ）4 共存离子（ ）5 有机溶剂（ k， ）6 柱型号、IEX的强弱2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 48 SEC 分离溶液中大小/分子量不同的化合物 最重要的参数是填料的孔径 分两