抗菌肽及抗菌分子机理-(修改)

1、抗菌肽及抗菌分子机理抗菌肽及抗菌分子机理演讲人：符国栋演讲人：符国栋 陈丽琴陈丽琴概述概述v抗菌肽抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性短肽的总是具有抗菌活性短肽的总称称；v分子量在分子量在20007000左右左右,由由2060个氨基酸残基组成；个氨基酸残基组成；v多数具有多数具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点。等特点。v研究的内容包括研究的内容包括:抗菌肽的分离与提纯抗菌肽的分离与提纯,氨基酸序列的分析氨基酸序列的分析,蛋蛋白质构型与功能的关系白质构型与功能的关系;抗菌肽的作用机理；应用基因工程抗菌肽的作用机理；应用基因工程克隆和表达

2、抗菌肽基因克隆和表达抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及动植物的改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等转抗菌肽基因工程等,其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重视。视。v内源性的抗菌肽内源性的抗菌肽是生物非特异性免疫功能的重要防是生物非特异性免疫功能的重要防御成分。御成分。v抗菌肽具有广谱杀菌作用抗菌肽具有广谱杀菌作用,对某些真菌、原生动物对某些真菌、原生动物,耐药性细菌都有杀灭作用耐药性细菌都有杀灭作用,并可选择性的杀伤肿瘤细并可选择性的杀伤肿瘤细胞胞,抑制乙型肝炎病毒等的复制。抑制乙型肝炎病毒等的复制。抗菌肽的作用机制抗菌肽的作用机制v1胞膜攻击作用v2诱

3、导细胞凋亡v3线粒体攻击作用v4对细胞核染色体的影响v5对癌细胞骨架的断裂作用v6抑制蛋白质及细胞壁合成1 胞膜攻击作用胞膜攻击作用v是大多数抗菌肽基本的作用机制；是大多数抗菌肽基本的作用机制；v破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构,引起细胞内容物大量引起细胞内容物大量渗出渗出,最终导致肿瘤细胞和细菌的死亡；最终导致肿瘤细胞和细菌的死亡；v抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。重要基础。抗菌肽杀菌机制示意图v昆虫天蚕素的抗菌肽分子昆虫天蚕素的抗菌肽分子是通过其两亲性是通过其两亲性-2螺旋上的正螺旋上的正电荷与细菌细胞膜

4、磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合电荷与细菌细胞膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合聚集在质膜上聚集在质膜上,然后抗菌肽分子中的疏水段然后抗菌肽分子中的疏水段C端端(酰胺基酰胺基)-2螺螺旋插入到疏水的细菌细胞膜中央旋插入到疏水的细菌细胞膜中央,双亲的双亲的-2螺旋留在质膜表螺旋留在质膜表面面,打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序,使得膜外正使得膜外正电荷增多电荷增多,超过阈值导致膜去极化。由于抗菌肽分子的超过阈值导致膜去极化。由于抗菌肽分子的-2螺螺旋是亲、疏水两亲性的旋是亲、疏水两亲性的,所以当抗菌肽分子相互聚集在一起所以当抗菌肽分子相互聚集在一

5、起时可形成离子通道时可形成离子通道,导致阳离子外流导致阳离子外流,最后细菌失去保护最后细菌失去保护,不能不能保持正常的渗透压而死亡。保持正常的渗透压而死亡。v从猪小肠中分离得到的抗菌肽从猪小肠中分离得到的抗菌肽(Cecp) 也是通过膜攻击来完成对细菌的杀也是通过膜攻击来完成对细菌的杀伤伤,但但其其C端为羧基端为羧基而非酰胺基而非酰胺基,其抗菌谱也有所不同其抗菌谱也有所不同,其其作用机制作用机制主要是主要是通过碱性氨基酸与细菌外膜表面的磷脂酰头部结合通过碱性氨基酸与细菌外膜表面的磷脂酰头部结合,由于分子的旋转导致由于分子的旋转导致Cecp的疏水基与膜的疏水区结合的疏水基与膜的疏水区结合,超过阈值

6、时超过阈值时,则在质膜上形成瞬时小孔则在质膜上形成瞬时小孔,导致菌体内容物溢出导致菌体内容物溢出,菌体裂解死亡。菌体裂解死亡。2 诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡vMai等等以融合抗菌肽以融合抗菌肽DP1局部注射到小鼠实体瘤内局部注射到小鼠实体瘤内,研究研究DP1对肿瘤细胞株对肿瘤细胞株MCA20凋亡的影响凋亡的影响,发现发现DP1可迅速诱导肿瘤可迅速诱导肿瘤细胞凋亡细胞凋亡,并使肿瘤体积缩小。并使肿瘤体积缩小。vChen等等以抗菌肽以抗菌肽RGD tachyplesin作用于前列腺癌细胞株作用于前列腺癌细胞株TSU,以荧光免疫法和以荧光免疫法和Western印迹杂交法检测印迹杂交法检测,结果发现凋结

7、果发现凋亡相关蛋白亡相关蛋白caspase9、caspase8、caspase3以及以及Fas配体配体表达均升高表达均升高,提示抗菌肽提示抗菌肽RGD tachyplesin可以诱导与可以诱导与Fas相相关的凋亡。关的凋亡。v由此推断诱导凋亡可能是某些抗菌肽的作用机制之一。由此推断诱导凋亡可能是某些抗菌肽的作用机制之一。3 线粒体攻击作用线粒体攻击作用vBobek等等以人唾液中提取的抗菌肽以人唾液中提取的抗菌肽MUC7作用于临床常见的作用于临床常见的真菌、杆菌和球菌真菌、杆菌和球菌,发现发现MUC7对真菌和细菌都有很强的杀伤对真菌和细菌都有很强的杀伤作用。在超微结构中发现线粒体出现肿胀、空泡化

8、、嵴脱落作用。在超微结构中发现线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和不规则排列和不规则排列,核膜界限不清核膜界限不清,有的核破裂有的核破裂,内容物溢出。这表内容物溢出。这表明抗菌肽明抗菌肽MUC7的作用机制可能与抑制肿瘤细胞呼吸有关。的作用机制可能与抑制肿瘤细胞呼吸有关。vFehlaum等发现等发现Thanatin(一种抗菌肽一种抗菌肽)在在0. 3 0. 6mol/L时时,就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度提高就对大肠杆菌表现出强烈的杀菌作用。但当其浓度提高到到70mol/L时时,仍然检测不到细胞内仍然检测不到细胞内K+的泄漏的泄漏,提示提示Thanatin不是通过形成离子通道来杀灭细菌

9、。当利用不是通过形成离子通道来杀灭细菌。当利用40mol/L的的Thanatin处理细菌时处理细菌时, 1h后可检测到细胞的呼后可检测到细胞的呼吸作用变弱吸作用变弱,6h后完全停止。后完全停止。因此认为因此认为Thanatin通过抑制细通过抑制细胞呼吸作用来杀菌的。胞呼吸作用来杀菌的。4 对细胞核染色体的影响对细胞核染色体的影响v以往的研究多集中于抗菌肽对细胞膜的破坏作用以往的研究多集中于抗菌肽对细胞膜的破坏作用,但但Hariton等等用具有同源性的两种抗菌肽用具有同源性的两种抗菌肽dermaseptinS4,dermaseptinS4 (13)作用于作用于HeLa肿瘤细胞肿瘤细胞株株,荧光免

10、疫染色发现荧光免疫染色发现S4不能进入到肿瘤细胞内部不能进入到肿瘤细胞内部;S4(13)M r较小较小,可以进入到细胞内部可以进入到细胞内部,但不能结合到细胞核上。对其进但不能结合到细胞核上。对其进行氨基酸序列加工改造后获得的新型抗菌肽行氨基酸序列加工改造后获得的新型抗菌肽PVS4 (13)、RRS4(13)却具有更强的穿透性却具有更强的穿透性,同时也可以结合到肿瘤的细同时也可以结合到肿瘤的细胞核上。胞核上。v结果表明结果表明,经这两种改造后的抗菌肽作用后的肿瘤细胞经这两种改造后的抗菌肽作用后的肿瘤细胞DNA出现断裂出现断裂,并最终导致死亡并最终导致死亡,由此推测抗菌肽可以通过直接作由此推测抗

11、菌肽可以通过直接作用于肿瘤细胞的染色质发挥杀伤作用。用于肿瘤细胞的染色质发挥杀伤作用。5 对癌细胞骨架的断裂作用对癌细胞骨架的断裂作用vChen等研究了等研究了天蚕素天蚕素B、B1和和B3的抗肿瘤作用机制的抗肿瘤作用机制,这这3种抗菌肽在空种抗菌肽在空间结构和氨基酸序列上存在着一定差异间结构和氨基酸序列上存在着一定差异,但又有一定的同源性但又有一定的同源性。通过作用。通过作用于体外培养的肿瘤细胞发现于体外培养的肿瘤细胞发现,3种抗菌肽都可以使细胞的双分子层发生溶种抗菌肽都可以使细胞的双分子层发生溶解解,微管崩解微管崩解,肿瘤细胞皱缩、死亡。并且发现这肿瘤细胞皱缩、死亡。并且发现这种杀伤作用的效

12、率与种杀伤作用的效率与3种种抗菌肽的空间结构和成分密切相关抗菌肽的空间结构和成分密切相关,证实了抗菌肽不仅可以使细胞膜发生证实了抗菌肽不仅可以使细胞膜发生穿孔穿孔,而且还可以破坏微管的正常功能而且还可以破坏微管的正常功能,影响细胞骨架的完整性影响细胞骨架的完整性,阻止纺锤阻止纺锤丝形成和有丝分裂丝形成和有丝分裂,进而破坏细胞器进而破坏细胞器,杀伤肿瘤细胞。杀伤肿瘤细胞。虽然抗菌肽对肿瘤虽然抗菌肽对肿瘤细胞和正常人体细胞的细胞骨架均有一定损伤细胞和正常人体细胞的细胞骨架均有一定损伤,但后者骨架系统完整但后者骨架系统完整,修修复快复快,不会造成不可逆损伤。不会造成不可逆损伤。而肿瘤细胞骨架不完整而

13、肿瘤细胞骨架不完整,经抗菌肽作用后经抗菌肽作用后,得得不到及时修复不到及时修复,最终导致死亡。最终导致死亡。6 抑制蛋白质及细胞壁合成抑制蛋白质及细胞壁合成vHarder等发现等发现人的抗菌肽人的抗菌肽2 defensin3能够抑制细菌细胞能够抑制细菌细胞壁的形成壁的形成,使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻,并使并使细胞壁穿孔细胞壁穿孔,最终导致细菌死亡。最终导致细菌死亡。抗菌肽的应用前景抗菌肽的应用前景v抗菌肽与上皮细胞、吞噬细胞、溶酶体等共同构成了机体的抗菌肽与上皮细胞、吞噬细胞、溶酶体等共同构成了机体的非特异性防御系统非特异性防御系统,在体内具有直接的杀菌活性。由于抗菌在体内具有直接的杀菌活性。由于抗菌肽的高效、广谱抗菌和潜在的抗肿瘤活性等传统抗生素无可肽的高效、广谱抗菌和潜在的抗