生物化学第2章Ⅱ核酸

1、第四节第四节 核酸的性质核酸的性质一、一般物理性质一、一般物理性质二、核酸的水解二、核酸的水解三、核酸的两性性质三、核酸的两性性质四、核酸的紫外吸收性质四、核酸的紫外吸收性质五、变性、复性与杂交五、变性、复性与杂交1 1、DNADNA为为白色纤维状固体白色纤维状固体，RNARNA为为白色粉末状固白色粉末状固体体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）（用乙醇从溶液中沉淀核酸）2 2、DNADNA和和RNARNA在细胞中常以在细胞中常以核蛋白核蛋白形式

2、存在，两形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNADNA核蛋白核蛋白 RNARNA核蛋白核蛋白0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl - + - + 1-2mol/L NaCl 1-2mol/L NaCl + - + -一、一般物理性质一、一般物理性质3 3、DNADNA溶液的溶液的粘度很大粘度很大，而，而RNARNA溶液的粘溶液的粘度度小得多小得多。核酸发生变性或降解后其。核酸发生变性或降解后其粘度降低粘度降低。4 4、核酸受到、核酸受到强大离心力强大离心力的作用时，可从的作用时，可从溶液中溶液中沉降下来沉降下来，其沉降速度与核酸，

3、其沉降速度与核酸的大小和密度有关。的大小和密度有关。一、一般物理性质一、一般物理性质1 1 酸水解酸水解2 2碱水解碱水解3 3酶水解酶水解二、二、核酸的水解核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯键可在核酸分子中的磷酸二酯键可在酸酸或碱性条件下水解或碱性条件下水解 1 1 酸水解酸水解 糖苷键和磷酸键都能被酸水解糖苷键和磷酸键都能被酸水解, ,糖苷糖苷键比磷酸键更容易键比磷酸键更容易 嘌呤碱的糖苷键嘌呤碱的糖苷键比嘧啶的比嘧啶的对酸更不稳对酸更不稳定定, ,最不稳定是嘌呤与脱氧核糖之间最不稳定是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键的糖苷键二、二、核酸的水解核酸的水解 2 2 碱水解碱水解 DNADNA和和RNA

4、RNA对碱的耐受程度有很大差别。对碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，室温条件下，DNADNA在碱中变性，但不在碱中变性，但不水解，水解，RNARNA水解。水解。 例如，室温条件下，在例如，室温条件下，在0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH溶溶液中，液中，RNARNA几乎可以完全水解；几乎可以完全水解；DNADNA在同样在同样条件下则不受影响。但温度条件下则不受影响。但温度100100度时，度时，4 4个个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。二、二、核酸的水解核酸的水解 二、二、核酸的水解核酸的水解 3 3 酶水解酶水解 磷酸二酯酶磷酸二

5、酯酶: :非特异水解磷酸二酯键非特异水解磷酸二酯键 核酸酶核酸酶: :特异水解核酸的磷酸二酯键特异水解核酸的磷酸二酯键 按底物分类按底物分类: :脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶 按底物作用的方式按底物作用的方式: :核酸外切酶和核酸内切酶核酸外切酶和核酸内切酶 按磷酸二酯键断裂方式按磷酸二酯键断裂方式:3OH:3OH与磷酸间与磷酸间;5OH;5OH与磷与磷 酸间酸间 其他分类其他分类: :双链酶双链酶, ,单链酶单链酶三、三、核酸的两性性质核酸的两性性质核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为的碱基，为两性电解质两性电解质，可发生两性，可

6、发生两性解离，解离，核酸的等电点比较低核酸的等电点比较低（DNADNA的等的等电点为电点为4-4.54-4.5，RNARNA的等电点为的等电点为2-2-2.52.5( (低低) )。（核酸在其等电点时溶解度。（核酸在其等电点时溶解度最小）最小）核酸相当于多元酸，核酸相当于多元酸，pHpH大时，呈阴离大时，呈阴离子状态；子状态；-向向阳极阳极迁移迁移 在核酸在核酸在在260 nm260 nm附近有最大吸收附近有最大吸收峰；据此特性可以定性和定量检峰；据此特性可以定性和定量检测核酸。蛋白质在测核酸。蛋白质在280 nm280 nm有一定有一定的吸收峰，因此利用的吸收峰，因此利用D260/OD280

7、D260/OD280比值可判断核酸样品的纯度。比值可判断核酸样品的纯度。四、紫外吸收四、紫外吸收减色效应减色效应：核酸的：核酸的光吸收值通常比各光吸收值通常比各核苷酸成分的光吸核苷酸成分的光吸收之和少收之和少30%-40%30%-40%，这是有规律的双螺这是有规律的双螺旋结构中碱基紧密旋结构中碱基紧密堆积到一起造成的，堆积到一起造成的，此现象称为此现象称为DNADNA减减色效应。色效应。五、变性、复性与杂交五、变性、复性与杂交（一）、（一）、DNADNA的变性的变性1 1、概念、概念2 2、变性因素、变性因素3 3、变性的指标、变性的指标1 1、概念、概念 是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双是指核

8、酸双螺旋区的氢键断裂，双螺旋解开，变成无规则线团的现象。螺旋解开，变成无规则线团的现象。核酸变性其分子中的共价键并没有核酸变性其分子中的共价键并没有破坏，分子量也不改变，核酸的变破坏，分子量也不改变，核酸的变性（性（ denaturationdenaturation ）2 2、DNADNA的变性的因素的变性的因素 温度升高；温度升高；酸碱度改变、酸碱度改变、 pHpH（11.311.3或或5.05.0）；）；有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等；有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等；各种射线各种射线低离子浓度低离子浓度 3 3、DNADNA的变性指标的变性指标 1 1）熔解温度（熔解温度（Melting

9、TemperatureMelting Temperature, , TmTm）：DNADNA热变性发生在一个很热变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变窄的温度范围内，通常把热变性过程中光吸收达到最大吸收性过程中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为该构失去一半）时的温度称为该DNADNA的熔点或熔解温度。（的熔点或熔解温度。（一般一般DNADNA的的TmTm值在值在80-9580-95 C C之间）之间） Tm Tm 与下列因素有关：与下列因素有关： 核酸的均一程度核酸的均一程度，均一性越高的样，均一性越高的样品，变性过程的温度范围越

10、小。品，变性过程的温度范围越小。 TmTm与与G-CG-C含量成正比含量成正比。 （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.44） TmTm与介质离子强度成正比。与介质离子强度成正比。mol/LKCl温度温度/ /0 0C CA A2602600.020.020.10.11.01.0 2 2）增色效应增色效应：天然：天然DNADNA分子从双螺旋分子从双螺旋结构变为单链状结构变为单链状态时，它在在紫态时，它在在紫外光外光260nm260nm波长处波长处的吸收值明显增的吸收值明显增加，此现象称为加，此现象称为增色效应。增色效应。1 1）熔解温度（熔解温度（TmT

11、m）：RNARNA本身只有局部的双螺旋区，所以本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有变性行为所引起的性质变化没有DNADNA那样明显。那样明显。天然状态的天然状态的DNADNA在完全变性后，紫外在完全变性后，紫外吸收吸收(260 nm)(260 nm)值增加值增加252540%40%. .而而RNARNA变性后，约增加变性后，约增加1.1%1.1%。A A260260值增加值增加粘度下降粘度下降浮力密度增大浮力密度增大分子量不变分子量不变4. DNA4. DNA变性后的表现变性后的表现（二）、（二）、DNADNA的复性的复性1 1、概念：、概念：变性变性DNADNA在适当的条

12、件下，两条彼在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性；螺旋结构，这一过程称为复性；DNADNA的复性图示的复性图示2 2、影响、影响DNADNA的复性的因素的复性的因素分子量越大复性越难分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易浓度越大，复性越容易。DNADNA的复性需要一定的盐浓度，增加的复性需要一定的盐浓度，增加盐浓度，复性速度加快盐浓度，复性速度加快将热变性的将热变性的DNADNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNADNA不可能复性。即淬火。不可能复性。即淬火。但是将变性的但是将变性的DNADNA缓慢冷却缓慢冷却时，

13、可以复时，可以复性，这一过程也叫性，这一过程也叫退火退火（annealing)annealing) 退火温度退火温度TmTm2525（三）、分子杂交（三）、分子杂交 热变性的热变性的DNADNA单链，在复性时并不一定单链，在复性时并不一定与同源与同源DNADNA互补链形成双螺旋结构，它互补链形成双螺旋结构，它也也可以与在某些区域有互补序列的异源可以与在某些区域有互补序列的异源DNADNA单链形成双螺旋结构单链形成双螺旋结构。这样形成的。这样形成的新分子称为杂交新分子称为杂交DNADNA分子。分子。 DNADNA单链与互补的单链与互补的RNARNA链之间也可以发生链之间也可以发生杂交。杂交。So

14、uthern BlotSouthern Blot：DNA-DNADNA-DNA杂交杂交Northern BlotNorthern Blot：DNA-RNADNA-RNA杂交杂交 PCRPCR技术技术核酸的杂交在分子生物学和遗传核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。学的研究中具有重要意义。分子杂交的种类分子杂交的种类Southern BlotSouthern Blot：DNA-DNADNA-DNA杂交杂交Northern BlotNorthern Blot：DNA-RNADNA-RNA杂交杂交Western BlotWestern Blot：抗原：抗原- -抗体进行杂交抗体进行杂交

15、原位杂交：活体组织上进行杂交，显原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光出荧光 第一节 概述 第二节 核酸的化学组成 第三节 核酸的分子结构 第四节 核酸的性质 第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 二二 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 三三 序列测定序列测定 四四 PCRPCR 五五 化学合成化学合成第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 ( (一一) ) 核酸的分离、提纯核酸的分离、提纯 ( (二二) ) 定量测定定量测定第

16、五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 ( (一一) )核酸的分离、提纯核酸的分离、提纯 1 1、DNADNA 2 2、RNA RNA 目前分离目前分离DNADNA方法：方法： 盐抽提，用苯酚和氯仿去蛋白盐抽提，用苯酚和氯仿去蛋白 SDS/CTABSDS/CTAB 氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心SDS法小量制备法小量制备植物基因组植物基因组DNA的原理的原理 在含有去污剂，如在含有去污剂，如SDS或或CTAB的溶液中，植物细的溶液中，植物细胞会被裂解释放出细胞核中的基因组胞会被裂解释放出细胞核中的基因组DNA，通过氯仿，通过氯

17、仿/异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂质，这时的基因组质以及其它杂质，这时的基因组DNA分配在水相中。分配在水相中。 然后用乙醇然后用乙醇(或异丙醇或异丙醇)将水相的将水相的DNA分子沉淀出来，分子沉淀出来，最后溶于最后溶于TE缓冲液或纯水中备用。缓冲液或纯水中备用。1. 剪取新鲜的植物叶片约剪取新鲜的植物叶片约20mg，剪碎置于，剪碎置于1.5ml离心管中；离心管中；2. 向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片；向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片；3. 在液氮蒸发去在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片；时，用自制研

18、杵迅速磨碎叶片；4. 立即加入立即加入300uL 65预热的提取液摇匀，于预热的提取液摇匀，于65水浴约水浴约1hr，其间摇动数次；其间摇动数次；5. 加等体积氯仿加等体积氯仿/异戊醇（异戊醇（24:1）混匀，于）混匀，于12000 rpm离心离心5分；分；6. 转移上清液到另一干净转移上清液到另一干净1.5ml离心管中，加入离心管中，加入2倍体积预冷的无倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置水乙醇，混匀后静置2min，14000rpm离心离心5min；7. 倾去上清液并用倾去上清液并用200uL预冷乙醇（预冷乙醇（70%）清洗）清洗DNA沉淀，沉淀，14000rpm离心离心5min；8. 用枪头小

19、心吸去乙醇，自然风干用枪头小心吸去乙醇，自然风干DNA后溶于后溶于50uL ddH2O中，中，置置-20保存备用。保存备用。植物基因组植物基因组DNA的小量快速制备方案的小量快速制备方案 2 2、RNARNA注意：用高温（注意：用高温（180180度）或度）或DEPCDEPC处理处理 加入加入RNasinRNasin第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 ( (一一) ) 核酸的分离、提纯核酸的分离、提纯 ( (二二) ) 定量测定定量测定( (二二) ) 定量测定定量测定 紫外分光光度法紫外分光光度法 定磷法定磷法 定糖法定糖法

20、 定磷法定磷法: : 磷含量相对恒定磷含量相对恒定, (RNA9.4%; DNA 9.9%), (RNA9.4%; DNA 9.9%) 有机磷有机磷 水解成无机磷水解成无机磷用浓硫酸或过氯酸用浓硫酸或过氯酸磷酸磷酸+ +钼酸钼酸 磷钼酸磷钼酸酸性条件酸性条件还原剂还原剂钼蓝钼蓝660nm660nm光密度与磷含量成正比光密度与磷含量成正比定糖法定糖法 ( (核酸含糖核酸含糖) ) 糠醛糠醛+ +与甲基苯二酚与甲基苯二酚( (地衣酚地衣酚) )鲜绿色鲜绿色( (最大最大670nm)670nm)RNA +RNA +盐酸盐酸加热加热糠醛糠醛FeCl3FeCl3催化剂催化剂DNADNA酸性溶液酸性溶液+

21、 +二苯胺二苯胺加热加热蓝色化合物蓝色化合物 ( (最大最大595nm)595nm)第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 二二 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 三三 序列测定序列测定 四四 PCRPCR 五五 化学合成化学合成 二二 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 （一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNADNA的凝胶电泳检测的凝胶电泳检测 通常，通常，琼脂糖琼脂糖(agarose)或或聚丙烯酰聚丙烯酰胺胺 (polyacrylamide)凝胶被用于核酸的凝胶被用于核酸的分离研

22、究、鉴定和纯化分离研究、鉴定和纯化DNA分子。也可分子。也可以用于蛋白质与核酸相互作用的研究。以用于蛋白质与核酸相互作用的研究。琼脂糖琼脂糖从红色海藻琼脂中提取的良好从红色海藻琼脂中提取的良好电泳介质，是电泳介质，是D-和和L-半乳糖残基通过半乳糖残基通过 和和 糖苷键交替构成的糖苷键交替构成的一种线状聚合物，琼脂一种线状聚合物，琼脂糖凝胶可以构成一个直径从糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大到略大于于200nm的三维筛孔的通道。其密度由琼的三维筛孔的通道。其密度由琼脂糖的浓度决定。脂糖的浓度决定。DNADNA的凝胶电泳检测的凝胶电泳检测 （一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳 以以琼脂糖

23、琼脂糖为支持物为支持物 操作简单、快速，且分离范围广操作简单、快速，且分离范围广 DNADNA在在琼脂糖琼脂糖凝胶的迁移速度凝胶的迁移速度 1、核酸分子本身的大小、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦：同分子的摩擦 系数成反比的系数成反比的2、琼脂糖的浓度、琼脂糖的浓度：迁移率与胶浓度成反比：迁移率与胶浓度成反比3、DNA的构型的构型：超螺旋（：超螺旋（I）、环状（）、环状（II）、）、 线状（线状（III）4、所用的电压、所用的电压 一般不大于一般不大于5V/cm,一定范围一定范围 内呈正比内呈正比5、电泳缓冲液、电泳缓冲液 溴化乙锭溴化乙锭(ethidiumbromide，简称，简称EB)是一

24、种核是一种核酸染料，可以插入到酸染料，可以插入到DNA或或RNA分子的分子的碱基之间碱基之间，并在，并在300nm波长的紫外光照波长的紫外光照射下放射出橘红色的荧光，可用来显现凝射下放射出橘红色的荧光，可用来显现凝胶中的核酸分子。胶中的核酸分子。在凝胶电泳中，溴化乙锭染料可对核在凝胶电泳中，溴化乙锭染料可对核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中而方便地检测出凝胶介质中DNA谱带。谱带。安全警示：安全警示：EB是一种强的是一种强的DNA诱变诱变剂，使用时尽量避免触及皮肤。电泳时有剂，使用时尽量避免触及皮肤。电泳时有时使用到较高的电压，要

25、小心触电。时使用到较高的电压，要小心触电。DNA的凝胶电泳检测的凝胶电泳检测 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测 +-仪器仪器 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；药品药品 Agarose、 loading buffer、 TBE buffer、 EB（溴化乙锭）（溴化乙锭）;上样缓冲液（上样缓冲液（6X）配方）配方 0.25% 溴酚蓝、溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、二甲苯氰醇、 40%蔗糖；水溶液蔗糖；水溶液4保存。保存。不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分离范

26、围（分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2PCR扩增结果分析举例扩增结果分析举例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control.聚丙烯酰胺凝胶：在由聚丙烯酰胺凝胶：在由TEMED (N、N、N、N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺)催化过硫酸胺还原产生的自由催化过硫酸胺还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚

27、合形成聚基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线形长链，在交联剂丙烯酰胺的线形长链，在交联剂N，N-亚甲双亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯酰胺丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯酰胺的交联链形成三维带状网格结构，链长和交联的的交联链形成三维带状网格结构，链长和交联的程度就决定了凝胶的孔径，同时也决定了分离程度就决定了凝胶的孔径，同时也决定了分离DNA的能力。的能力。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖琼脂糖凝胶制胶一般将凝胶制胶一般将EBEB直接直接加入加入而而聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制胶时制胶时不能不能将染料加入，会影响聚合。将染料加入，会影响聚合。1000bp

28、第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 二二 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 三三 序列测定序列测定 四四 化学合成化学合成 五五 PCRPCR三三 序列测定序列测定 1 DNA1 DNA酶法测序酶法测序 2 DNA2 DNA的化学法测序的化学法测序 3 RNA3 RNA的测序的测序1 1 DNA DNA酶法测序酶法测序 Sanger 于于1975年设计快速测序方法年设计快速测序方法”加减法加减法”三三 序列测定序列测定 1 DNA1 DNA酶法测序酶法测序 2 DNA2 DNA的化学法测序的化学法测序 3 RNA3 RNA的测序的测序 2 DNA2 DNA的化学法测序的化学法测序 MaxamMaxam和和Gilbert 于于19771977年发明年发明 基本原理基本原理: :特异化学试剂特异化学试剂作用与作用与DNADNA分子中分子中的的不同碱基不同碱基, ,然后切断反应碱基的多核苷酸链然后切断反应碱基的多核苷酸链3 RNA3 RNA的测序的测序第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定 二二 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 三三 序列测定序列测定 四四 PCRPCR 五五 化学合成化学合成DNA聚合酶链式反应聚合酶链式反应 The po