心脏生物起搏

1、Perking University Peoples Hospital 心脏生物起搏心脏生物起搏郭继鸿郭继鸿 教授教授北京大学人民医院心电生理室北京大学人民医院心电生理室Perking University Peoples Hospital心脏生物起搏的重要性心脏生物起搏的重要性心脏生物起搏的要求心脏生物起搏的要求心脏生物起搏的研究基础心脏生物起搏的研究基础国外研究动态国外研究动态本课题组的研究进展本课题组的研究进展仍需解决的关键问题仍需解决的关键问题Perking University Peoples Hospital心脏生物起搏的重要性心脏生物起搏的重要性 心脏传导功能障碍导致缓慢心脏传导

2、功能障碍导致缓慢性心律失常，最常见的是房室传性心律失常，最常见的是房室传导阻滞和病态窦房结综合征导阻滞和病态窦房结综合征. .病理基础：病理基础： 起搏和传导的心肌细胞功能起搏和传导的心肌细胞功能受损、数量减少。受损、数量减少。目前的治疗手段：目前的治疗手段： 植入永久性起搏器植入永久性起搏器. .Perking University Peoples Hospital电子起搏器在临床应用中的局限性电子起搏器在临床应用中的局限性不能替代自主神经系统对心率的调控。不能替代自主神经系统对心率的调控。与心脏生理性传导顺序有差异与心脏生理性传导顺序有差异电池耗竭需定时更换电池耗竭需定时更换与手术和起搏器

3、有关的并发症与手术和起搏器有关的并发症易受外界电场和磁场的干扰易受外界电场和磁场的干扰1.1.儿童患者儿童患者心脏生物起搏的重要性心脏生物起搏的重要性Perking University Peoples Hospital 20032003年美国哥伦比亚大学年美国哥伦比亚大学RosenRosen教授正式提出心脏生教授正式提出心脏生物起搏物起搏（biological pacemakerbiological pacemaker）的概念。的概念。为解决电子起搏器的局限性：为解决电子起搏器的局限性：应用基因治疗和（或）干细胞技术构建心脏起搏点，替代受应用基因治疗和（或）干细胞技术构建心脏起搏点，替代受损

4、的心脏传导系统，为缓慢性心律失常的治疗提供新的手段。损的心脏传导系统，为缓慢性心律失常的治疗提供新的手段。Perking University Peoples Hospital心脏生物起搏的要求心脏生物起搏的要求长期、稳定的提供心脏起搏点长期、稳定的提供心脏起搏点无需定时更换无需定时更换能够有效治疗缓慢性心律失常性疾病能够有效治疗缓慢性心律失常性疾病无严重的免疫及炎症反应无严重的免疫及炎症反应无致瘤作用无致瘤作用能接受自主神经系统的调控能接受自主神经系统的调控符合生理性传导顺序符合生理性传导顺序不会诱发新的心律失常不会诱发新的心律失常Perking University Peoples Hos

5、pital心脏生物起搏的研究基础心脏生物起搏的研究基础心脏起搏分子机制心脏起搏分子机制干细胞向心肌细胞诱导分化干细胞向心肌细胞诱导分化基因治疗技术在心血管疾病的应用基因治疗技术在心血管疾病的应用Perking University Peoples Hospital心脏起搏的分子机制心脏起搏的分子机制起搏电流（起搏电流（I If f）延迟整流性钾电流（延迟整流性钾电流（IkIk）内向钙电流（内向钙电流（ICaICa）Na+-Ca2+Na+-Ca2+交换电流（交换电流（INa-CaINa-Ca）持续性钠电流（持续性钠电流（IstIst） 参与心肌细胞动作电位参与心肌细胞动作电位4 4相自动除极的离

6、子相自动除极的离子电流包括：电流包括：动作电位动作电位4 4相除极早期的主要电流相除极早期的主要电流Perking University Peoples Hospital介导起搏电流的离子通道为介导起搏电流的离子通道为超超极化激活环核苷酸门控阳离子极化激活环核苷酸门控阳离子通道（通道（HCNHCN）。）。目前已克隆目前已克隆4 4种种HCNHCN通道基因亚通道基因亚型，分别命名为型，分别命名为HCN1-HCN4HCN1-HCN4。HCNHCN通道的分子结构通道的分子结构Perking University Peoples Hospital干细胞向心肌细胞诱导分化干细胞向心肌细胞诱导分化成体干细

7、胞成体干细胞Perking University Peoples Hospital 胚胎干细胞体外诱导向心肌细胚胎干细胞体外诱导向心肌细胞分化，自发搏动的细胞可以检测胞分化，自发搏动的细胞可以检测到类似到类似窦房结窦房结、心房肌、心室肌细、心房肌、心室肌细胞的动作电位。（胞的动作电位。（Circ Res. Circ Res. 20032003）。）。干细胞向心肌细胞诱导分化干细胞向心肌细胞诱导分化胚胎干细胞胚胎干细胞Perking University Peoples Hospital 细胞因子，如细胞因子，如内皮素内皮素-1-1可可以促进胚胎干细胞体外向自律以促进胚胎干细胞体外向自律性细胞的

8、分化（性细胞的分化（ FASEBFASEB，20042004）窦房结样细胞窦房结样细胞心房样细胞心房样细胞Perking University Peoples Hospital国外研究动态国外研究动态基因治疗基因治疗干细胞治疗干细胞治疗心脏生物起搏的两种策略心脏生物起搏的两种策略前前后后Perking University Peoples Hospital基因治疗基因治疗国外研究动态国外研究动态1.1.提高心脏自身的起搏频率提高心脏自身的起搏频率 EdebergEdeberg等于等于19981998年（年（J Clin J Clin InvestInvest）和）和20012001年（年（He

9、artHeart）将人）将人肾上腺素肾上腺素22受体受体的基因转染到小的基因转染到小鼠和猪的心脏（右心房），明显鼠和猪的心脏（右心房），明显提高心脏自身起搏频率。提高心脏自身起搏频率。对照对照转染转染Perking University Peoples Hospital国外研究动态国外研究动态2.2.通过抑制心肌细胞内向整流钾电通过抑制心肌细胞内向整流钾电流流 MiakelMiakel等于等于20022002年（年（NatureNature）通）通过基因突变技术和腺病毒载体，抑制过基因突变技术和腺病毒载体，抑制心室肌细胞的内向整流钾通道功能，心室肌细胞的内向整流钾通道功能，结果出现心室异位节律

10、，频率接近窦结果出现心室异位节律，频率接近窦性节律。性节律。 Perking University Peoples Hospital国外研究动态国外研究动态3.3.提高起搏电流（提高起搏电流（I If f）通道基因的表达）通道基因的表达 HCN2HCN2基因重组腺病毒注射狗的左心基因重组腺病毒注射狗的左心房（房（Circulation. 2003)Circulation. 2003)或左束支或左束支（Circulation. 2004Circulation. 2004），刺激迷走神），刺激迷走神经抑制窦房结和房室结后，出现源于经抑制窦房结和房室结后，出现源于注射部位的频率较高的异位节律。注射部

11、位的频率较高的异位节律。左束支左束支对照对照转染转染Perking University Peoples Hospital单用基因治疗存在的问题单用基因治疗存在的问题病毒载体病毒载体: :毒副作用和免疫反应毒副作用和免疫反应基因表达基因表达: :时间有限、难以调控时间有限、难以调控动物实验：时间短，缺乏安全性评价动物实验：时间短，缺乏安全性评价Perking University Peoples Hospital国外研究动态国外研究动态 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。按照生干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。按照生存阶段可分为存阶段可分为成体干细胞成体干细胞和和胚胎干细胞胚胎

12、干细胞。理论上应用干细胞。理论上应用干细胞进行心脏生物起搏有两种方式：进行心脏生物起搏有两种方式：起搏心脏起搏心脏干细胞干细胞诱导后移植：体外先分化为起搏细胞诱导后移植：体外先分化为起搏细胞直接移植：干细胞在体内分化直接移植：干细胞在体内分化12 2干细胞治疗干细胞治疗Perking University Peoples Hospital胚胎干细胞体外分化为心肌细胞后移植（胚胎干细胞体外分化为心肌细胞后移植（Xue et al, Xue et al, Circulation 2005Circulation 2005）1.1.起搏通道基因起搏通道基因HCN2HCN2修饰间充质干细胞后移植（修饰间

13、充质干细胞后移植（PotapovaPotapova、Qu Qu et al Circulation 2004et al Circulation 2004） 国外研究动态国外研究动态干细胞治疗干细胞治疗Perking University Peoples Hospital优势优势局限局限胚胎干细胞胚胎干细胞全向分化能力，可体外分化全向分化能力，可体外分化为心肌细胞，包括起搏细胞为心肌细胞，包括起搏细胞伦理限制、免疫排斥、致瘤伦理限制、免疫排斥、致瘤性；致心律失常性；致心律失常成体干细胞成体干细胞取材简单、来源充足、免疫取材简单、来源充足、免疫排斥反应弱，排斥反应弱，能够与心肌细能够与心肌细胞形成

14、电缝隙连接胞形成电缝隙连接向心肌细胞分化能力仍受质向心肌细胞分化能力仍受质疑，目前无充分证据能分化疑，目前无充分证据能分化为起搏细胞为起搏细胞两种干细胞在心脏生物起搏研究中的比较两种干细胞在心脏生物起搏研究中的比较国外研究动态国外研究动态Perking University Peoples Hospital目前可行的心脏生物起搏的策略目前可行的心脏生物起搏的策略基因治疗间充质干细胞基因治疗间充质干细胞 即将间充质干细胞作为载体细胞，对间充质干细胞进行基即将间充质干细胞作为载体细胞，对间充质干细胞进行基因修饰，使其具有心脏自律性细胞的功能，然后移植到心脏，因修饰，使其具有心脏自律性细胞的功能，然

15、后移植到心脏，以替代受损的心脏传导系统。以替代受损的心脏传导系统。优点：优点：既显著减少病毒载体的毒副作用，又能发挥间充质既显著减少病毒载体的毒副作用，又能发挥间充质干细胞独特的优势。干细胞独特的优势。Perking University Peoples Hospital本课题组的研究进展本课题组的研究进展 通过通过HCN4HCN4通道基因修饰间充质干细胞，使其具通道基因修饰间充质干细胞，使其具有起搏电流的功能，为缓慢性心律失常的治疗提供有起搏电流的功能，为缓慢性心律失常的治疗提供新的手段。新的手段。研究目的研究目的Perking University Peoples Hospital起搏通道

16、基因修饰间充质干细胞进行起搏通道基因修饰间充质干细胞进行心脏生物起搏心脏生物起搏缝隙连接缝隙连接Gap JunctionGap Junction干细胞干细胞HCNHCN通道通道起搏电流起搏电流I If f动作电位动作电位APAPPerking University Peoples Hospital主要研究内容主要研究内容转染心肌细胞转染心肌细胞, ,观察观察HCN4HCN4对心肌细对心肌细胞自律性的影响胞自律性的影响构建含起搏通道基因亚型构建含起搏通道基因亚型HCN4HCN4的重组腺病毒并鉴定的重组腺病毒并鉴定转染骨髓间充质干细胞转染骨髓间充质干细胞, ,观察观察HCN4HCN4通道的表达和功

17、能通道的表达和功能用起搏通道基因修饰的干细胞动物用起搏通道基因修饰的干细胞动物移植移植, ,观察疗效及安全性观察疗效及安全性临床研究临床研究 分子水平分子水平 （工具）（工具） 细胞水平细胞水平 动物实验动物实验 人体应用人体应用Perking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果1 1、成功构建、成功构建HCN4HCN4通道基因的重组腺病毒载体，图例为原通道基因的重组腺病毒载体，图例为原代重组腺病毒的包装过程。代重组腺病毒的包装过程。彗星状光团彗星状光团 A：1天天B：7天天C：10天天Perking University Peoples H

18、ospital目前主要研究结果目前主要研究结果 200200 1001002 2、重组腺病毒能高效介导报告基因、重组腺病毒能高效介导报告基因绿色荧光蛋白在细胞中的表达，绿色荧光蛋白在细胞中的表达，基因转染效率超过基因转染效率超过9090Perking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果A: A: 绿色荧光蛋白的表达绿色荧光蛋白的表达B: B: 罗丹明（红色）抗体罗丹明（红色）抗体标记标记HCN4HCN4蛋白的表达蛋白的表达C: AC: A图和图和B B图的图像叠加图的图像叠加A B C 3 3、重组腺病毒高效介导、重组腺病毒高效介导HCN4H

19、CN4通道在通道在cos-7cos-7细胞中的表达细胞中的表达Perking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果 转转HCN4HCN4通道基因细胞的起搏电流通道基因细胞的起搏电流 4 4、膜片钳实验表明，、膜片钳实验表明，转染到转染到COS-7COS-7细胞中的细胞中的HCN4HCN4通道能够发挥介通道能够发挥介导起搏电流的功能。导起搏电流的功能。Perking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果 特异性特异性阻断剂阻断剂Cs+Cs+（2 mmol/L2 mmol/L），），能够阻断绝大部分

20、的电流，进一步证能够阻断绝大部分的电流，进一步证实为起搏电流。实为起搏电流。 Cs+对对HCN4通道的阻断作用通道的阻断作用 Perking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果不同不同MOIMOI值值AdHCN4AdHCN4对乳鼠心肌细胞感染效率的比较对乳鼠心肌细胞感染效率的比较( (100)100) A A：MOI=100 B: MOI=200 C: MOI=100 B: MOI=200 C: MOI=500MOI=500A B C 5 5、重组腺病毒能高效转染培养的乳鼠心肌细胞、重组腺病毒能高效转染培养的乳鼠心肌细胞Perking Uni

21、versity Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果 细胞免疫荧光检测心肌细胞细胞免疫荧光检测心肌细胞HCN4HCN4通道蛋白的表达通道蛋白的表达 ( (400)400) A:A:感染后心肌细胞绿色荧光蛋白的表达感染后心肌细胞绿色荧光蛋白的表达 B:B:罗丹明标记（红色）罗丹明标记（红色）HCN4HCN4蛋白的表达蛋白的表达 C:C:对照组心肌细胞对照组心肌细胞A B C 6 6、细胞免疫荧光结果表明，重组腺病毒载体能高效、细胞免疫荧光结果表明，重组腺病毒载体能高效介导介导HCN4HCN4通道在心肌细胞中的表达。通道在心肌细胞中的表达。Perking Univers

22、ity Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果nHCN4HCN4基因转染到心肌细胞后，能明显提高心肌细胞自发搏动的频率基因转染到心肌细胞后，能明显提高心肌细胞自发搏动的频率n自发搏动节律比对照组心肌细胞规整自发搏动节律比对照组心肌细胞规整. .7 7、电生理研究结果表明：、电生理研究结果表明：Perking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果8 8、膜片钳实验表明：、膜片钳实验表明：n动作电位时限动作电位时限(CL)(CL)较对照组细较对照组细胞明显缩短胞明显缩短 n最大舒张电位最大舒张电位(MDP)(MDP)向去极

23、化向去极化方向偏移方向偏移 n动作电位出现动作电位出现4 4相自动除极相自动除极（SP4SP4）出现明显的出现明显的4相自动除极相自动除极CL缩短缩短最大舒张电位最大舒张电位A A：对照组：对照组 B B：病毒感染组：病毒感染组Perking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果转转HCN4HCN4通道基因心肌细胞的起搏电流通道基因心肌细胞的起搏电流对照组心肌细胞的起搏电流对照组心肌细胞的起搏电流 n病毒感染的心肌细胞起病毒感染的心肌细胞起搏电流检出阳性率和电流搏电流检出阳性率和电流幅度也明显高于对照组。幅度也明显高于对照组。 Perking

24、University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果A(MOI=100) B1(MOI=400) B2 (MOI=400) 100 100 400 9 9、重组腺病毒载体高效转染骨髓间充质干细胞、重组腺病毒载体高效转染骨髓间充质干细胞Perking University Peoples Hospital1010、细胞免疫荧光证实转基因骨髓间充质干细胞、细胞免疫荧光证实转基因骨髓间充质干细胞中中HCN4HCN4通道的表达。通道的表达。 转基因骨髓间充质干细胞转基因骨髓间充质干细胞HCN4通道蛋白的表达（通道蛋白的表达（400） A:骨髓间充质干细胞中报告基因绿色

25、荧光蛋白的表达 B:骨髓间充质干细胞中HCN4通道蛋白的表达 C:A和B图像叠加ABCPerking University Peoples Hospital目前主要研究结果目前主要研究结果Cs+Cs+对骨髓间充质干细胞起搏电流的阻断作用对骨髓间充质干细胞起搏电流的阻断作用 转转HCN4HCN4通道基因骨髓间充质干细通道基因骨髓间充质干细胞的起搏电流胞的起搏电流 n 腺病毒感染的细胞中，约腺病毒感染的细胞中，约6565可可以检测到起搏电流。而对照组细胞以检测到起搏电流。而对照组细胞未检测到类似电流。未检测到类似电流。n Cs+ Cs+能够特异性阻断约能够特异性阻断约9090的电的电流，证实记录到

26、的电流为起搏电流。流，证实记录到的电流为起搏电流。 11、干细胞电生理研究表明：、干细胞电生理研究表明：Perking University Peoples Hospital研究结论研究结论nHCN4HCN4腺病毒载体构建成功，为深入研究起搏通道的电生理功能和腺病毒载体构建成功，为深入研究起搏通道的电生理功能和基因治疗缓慢性心律失常疾病提供了有效的工具。基因治疗缓慢性心律失常疾病提供了有效的工具。n提高提高HCN4HCN4基因的表达能明显增强心肌细胞的自律性，证实基因的表达能明显增强心肌细胞的自律性，证实HCN4HCN4基基因可作为心脏生物起搏的备选基因。因可作为心脏生物起搏的备选基因。n腺病毒载体高效介导了腺病毒载体高效介导了HCN4HCN4通道在间充质干细胞中的表达通道在间充质干细胞中的表达, ,证实充证实充质干细胞可作为心脏生物起搏的载体细胞。质干细胞可作为心脏生物起搏的载体细胞。Perking University Peoples Hospital转染心肌细胞转染心肌细胞, ,观察观察HCN4HCN4对心肌细对心肌细胞自律性的影响胞自律性的影响构建含起搏通道基因亚型构建含起搏通道基因亚型HCN4HCN4的重组腺病毒并鉴定的重组腺病毒并鉴定转染骨髓