对节白蜡ISSR―PCR反应体系的建立与优化

1、对节白蜡issr-pcr反应体系的建立与优化摘要：以对节白蜡(fraxinus hupehensis chiu, shang et su)基 因组dna为材料，采用正交试验和单因子试验对其issr-pcr反应体系 进行了构建与优化。结果表明，在15以反应体系中含0.模版40叩、 引物终浓度 0.7 umol/l. 7.5 ul 2xtaq pcr plus master mix 的 扩增效果最好。该反应体系筛选出了 14条稳定性强、多态性高、扩增 效果较好的issr引物，并通过梯度pcr试验比较引物在不同退火温度 下的扩增效果，从而确定引物最佳退火温度。本文采集自网络，本站发布的论文均是优质论

2、文，供学习和研究 使用，文中立场与本网站无关，版权和著作权归原作者所有，如有不 愿意被转载的情况，请通知我们删除已转载的信息，如果需要分享， 请保留本段说明。关键词：对节白蜡(fraxinus hupehensis chiu, shang et su)； issr-pcr；反应体系；单因子试验；正交设计中图分类号：q78； q943. 2文献标识码：a文章编号：0439-8114(2016) 22-5962-04d0i： 10.14088/j.enki. issn0439-8114. 2016. 22. 058establishment and optimization of fraxinus

3、 hupehensisissr-pcr reaction systemcheng jian-ru, ziiou ming-qin(college of horticulture and landscape architechture，yangtze university, jingzhou 434025， hubei, china)abstract： the single factor test and orthogonal design wereused to establish and optimize the issr-pcr reaction system offraxinus hup

4、ehensis chiu, shang et su. the results showed thatthe appropriate pcr reaction system consisted of 40 ng templatedna，0.7 u mol/l primer, and 7. 5 u l 2 xtaq pcr plus mastermix.14 high-efficient polymorphic primers were screened outbased on the optimal issr reaction system. furthermore，the idealannea

5、ling temperature of the every selected primer was decidedaccording to the amplified results with different temperatures.key words： fraxinus hupehensis； issr-pcr; reaction system；single factor test； orthogonal design对节白蜡(fraxinus hupehensis chiu, shang et su)为木犀科白蜡属的落叶乔木，又名湖北白蜡、对节树、湖北?q，特产于湖北省， 1990年

6、被正式定为国家二级珍稀濒危保护植物1。该种仅分布于湖 北省钟祥与京山接壤地区，多生长在海拔100600 m的土层深厚的山 坡、沟谷、水积平台及村边路旁，在群落中多沿山坡向沟谷逐渐加大， 甚至形成小片纯林2。该物种生长缓慢，具有很高观赏价值；材质优 良，既是珍贵的用材树种，又是优美的园林绿化树种，还是极佳的盆 景、根雕素材，被誉为“活化石”或“盆景之王”，此外还具有很高的 药用价值。近年来，由于重利用轻保护，乱砍滥伐，尤其是为制作树 桩盆景，节白蜡野生资源遭到过度采挖，破坏严重。因此，了解对节 白蜡野生资源的现状，加强基础研究，探讨其濒危机制，制定资源保 护与合理利用之对策已属当务之急。目前，有

7、关对节白蜡的研宄较少，主要集中在资源调查3、育苗 技术4、植物组织培养5、化学成分和药理作用6等儿个方面。但 有关对节白蜡分子遗传标记的研究国内外尚未见报道。issr (intcr-simplc sequence repeat),又称为 intcr-ssr,即简单重复 序列区间，属于第二代dna分子标？，是zietkiewicz等7于1994 年在ssr标记基础上发展起来的。issr技术是利用在植物基因组中常 出现的ssr本身设计引物，使位于反向排列、间隔不太大的重复序列 间的基因组片段进行pcr扩增。由于ssr在真核生物中分布广泛，且 串联重复的数0具有高度多态性8，因而issr-pcr可以

8、检测基因组 中丰富的遗传变异。此外，issr技术操作简单快速，引物来源简单， 试验成本较低9。因此己广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因 定位、进化及遗传多样性等方面的研究10-13。本研究以对节白蜡基 因组dna为模板，对其issr反应体系进行构建与优化，为后期对节白 蜡种质资源在分子水平的研究奠定基础。1材料与方法1.1材料所用材料分别采自钟祥市鸡鸣寺林场雷冲分场、雁门u镇和杨集 镇，3份材料样本编号分别为17、145、234。样本为当年生嫩叶，叶片上的灰尘用自来水洗干净，后用吸水纸将残留的水分吸干，然后去 除叶柄，将叶片迅速放入自封袋，加变色硅胶后封口保存。1.2方法1.2. 1总dn

9、a提取与检测对节白蜡基因组dna提取采用改良 ctab 法8，用 thermo scientific nano drop 2000c 分光光度计仪 检测其纯度和浓度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量。1.2.2issr-pcr反应体系正交试验设计pcr反应体系采用2 x taq pcr plus master mix (包括 taq dna polymerase、2xtaq pcr buffer、mg2+、 dntp mix),故本研究涉及的issr-pcr反应体系影响因子只有2个： 模板dna用量和引物用景。本研究首先采用正交试验设计初步的反应 体系(表1)。反应的总体积为15 ul，除

10、含两个变化因素外，还含有 7. 5 u l 2xtaq pcr master mix,其余用 rnase-free water 补足至 15 ulo引物选用ubc873,该引物序列为:gacagacagacagaca。扩增反应结束后，取5 p l pcr扩增产物在含有gelred核酸染料 的1.5%琼脂糖凝胶于1xtae缓冲液中电泳，电压设定为120 v，电泳 时间30min，待电泳结束取出凝胶，在凝胶成像系统观察并成像分析。1.2.3 issr-pcr反应体系单因子试验以正交试验中扩增效果反 应效果较好的体系为基础，再设计单因子试验，进一步筛选反应体系 中引物和模版dna的浓度。dna模板(

11、50 ng/ul)的候?x用量：0.4、 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 ul； 10 umol/l 引物的候选 用量：0.30、0.45、0.60、0. 75, 0.90, 1.05, 1.20、1.35 ul。1.2.4 issr-pcr扩增程序的优化利用正交试验和单因子试验确定的优化issr-pcr反应体系，筛选pcr的循环次数和引物最佳退火温 度。pcr循环数从3340共8个处理；根据引物碱基序列计算理论退 火温度，设定退火温度梯度范围（在引物理论退火温度上下5 °c内筛 选最佳值），根据凝胶成像结果确定引物最佳退火温度。2结果与分析2.1 dna浓度

12、与纯度检测结果提取的对节白蜡基因组dna呈白色絮状沉淀，电泳凝胶结果显示, dna为一条亮带，提取的dna质量较好。dna的0d260 nm/0d280 nm 多数在1. 70-1.90之间，纯度较高，符合issr-pcr对dna的要求（图1）。2.2 issr-pcr正交试验结果根据正交试验设计的16个反应体系进行pcr扩增，pcr产物由脂 糖凝胶电泳检测并拍照（图2）。以特异性带多、主带清晰、副带较为 明显为佳，观察比较电泳图谱，确定体系13的扩增效果较好。2.3 dna模版用量的优化issr扩增反应由于不同物种所需要的最佳模板dna浓度不同，因 此，确定合适的模板dna浓度是进行issr

13、-pcr反应的必要试验。从图 3中可以看出，模板dna为2090 ng时条带亮度和多态性差异不大， 都能扩增出较为清晰的条带。因此，模版dna的浓度对对节白蜡 issr-pcr反应影响不是很敏感，在后续的15 ul pcr反应中选用40 ng 模板dna。2.4引物浓度的优化从图4可以看出，引物浓度对对节0蜡issr-pcr扩增反应的影响 较为大。在设置的8个不同浓度梯度中，引物浓度为0. 20. 3 u mol/l 时，扩增出条带较模糊，且条带也少；当引物浓度到0. 80. 9 u mol/l 时，引物特异性降低，片段模糊不清；当引物浓度在0. 40. 7 u mol/l 时，扩增出条带较清

14、晰，片段大小基本一致，而引物浓度在0.7 u mol/l时扩增效果最好，因此，issr-pcr反应的适宜引物浓度为0. 7 u mol/l。2.5循环次数的优化issr-pcr反应循环次数对产物有较明显的影响，反应循环次数 少，产物累积不够，检测不出目的条带，但循环次数多，产物累积多， 易出现非特异产物。图5显示8个不同的pcr循环次数对issr-pcr 扩增反应的影响。从图5可以看出，循环次数为3335时，扩增出的 条带模糊不清；当循环次数为3639时，所扩增的条带基本一致且清 晰，其中循环为38时，扩增出的条带最为清晰；当循环次数为40时， 扩增条带较粗，不利于后期读带分析。因此，issr

15、-pcr扩增反应程序 的最佳循环次数力38。2.6引物退火温度的优化利用优化的issr-pcr反应体系，从50个issr引物中筛选出了 14个引物，并根据引物的tm值设定了不同的退火温度，经电泳检测（图6），最后确定丫各引物的最佳退火温度（表2）。3小结与讨论本试验首先采用正交试验确定模板dna用量和引物浓度之间的关系，确定较好反应体系，再采用单因子试验对各因素进行优化，然后 利用优化的反应体系进一步对pcr循环次数和引物的退火温度进行筛 选，最终得到一个最优的issr-pcr反应扩增体系：15 ul反应体系 中含有 7.5 ul 2xtaq pcr plus master mix, dna

16、模版 40 ng、引 物终浓度0. 7 wmol/l、最后用rnase-free water补足剩余部分。扩 增反应程序为. 94 °c预变性5 min； 94 °c变性30 s，最佳退火温度 退火30 s，72 °c延伸90s，38个循环；72 °c延伸7min，4 °c保存。issr-pcr反应包含多种因素，各个因素的变化都会对试验结果产 生影响14。采用正交试验可以分析不同因素间的相互作用，但各个 因子水平梯度设置有限，不利于找到该因素的最佳用景；而单因子试 验设置较精确的梯度确定各因素的用量，但对各个因素间影响无法确 定，因此本研究采用

17、正交试验和单因子试验相结合的方法来构建 issr-pcr的反应体系。本试验得到的dna模板用量和引物浓度与王书 珍等15报道的杜鹃花issr-pcr反应体系相吻合。在一些研究报道 中，用到issr引物退火温度大多在5256 °c之问16，而本试验结 果表明，存些引物的退火温度最高达到59.9 qc，最低只存46. 3 °c。 因此，在进行issr试验前，根据issr引物序列的碱基构成进行相应 的退火温度设计和优化是十分必要的。本研究建立了优化的对节白蜡issr-pcr反应扩增体系，并利用该反应体系筛选出了 14条多态 性高、稳定性强的引物，而且确定y各引物的退火温度，该结果

18、为后 期进一步开展对节白蜡在分子生物学方面的研究奠定了基础。参考文献:1 彭辅松.湖北省第二批国家珍稀濒危保护植物j.武汉植物 学研究，1990，8 (4)： 383-385.2 苏丕林，明军，廖卉荣.对节内蜡种质资源的分布规律j. 湖北林业科技，1994 (1)： 35-36.3 苏丕林，明军，朗功强，等.对节白蜡(fraxinus hupehensis chiu. shang et su. sp. nov.)适生环境及其群落的调查研宄j.湖北 林业科技，1995 (2)： 6-12.4 王文才，刘蓉，易明兵.对节白蜡种子育苗技术j.湖北林 业科技，2013，12 (6)： 87-88.5

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20、，葛颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记ml 北京：科学出版社，2001.9 reddy m p，sarla n, siddiq e a. inter simple sequence repeat ( issr ) olymorphism and its application in plant breedingj. euphytica, 2002，128： 9-17.10 wang c y，ziiao j c. optimization of issr-pcr reaction system and preliminary construction of issr fingerprinting ofsome species in bryaccacj. agricultural science & technology,2011， 12 (11)： 1561-1568.11 hao g，lee d h, lee j s，et al. a study of taxonomical relationships among species of korean allium sect. sacculiferum(alliaceae) and related species using inter-simple s