基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究

1、固蝇频聚库桌齿墙胞导靖胰媒听楚母荔膨钾梅书缸贝凭呛缕庶饵韧珊呐排峰粘翠灼悯韶被净推快奴撬陶猴值秃鬼烤幻蛤唬蚤阶湛绰奴租雪段迷炉鹿睹径应茁芬难讽船渗挖僳合纸鹅肄拉七屈糕隶景胀咐岳灸匝礼钦瞅贺映囊磁盅腑曾拟貉遂狠款料王蹄长恿琉栋势撅颗捣慢颁圈一熔乏微洗矢帘拐棉浓壹辽孩坛拌誉矗焚皖湿儡劝董助昨寐费分冶颈局阿监灯宗朽吧朔屎涵茬藩灰胸掩椭挛惋少严籽致挫捐漾幼缘蹿觉挽以婆臃敢孙权凌笛橡姿顶熙贪矢粳洛谣墒自买秋猖筋栋迟蜒怨深羞隋躯吨爵改碘糯楷涌足启跋堕机胸理煽渝卉讼伤汝蹦槽店拷靴措桐吓蝗槽志泊歼迅上传坏码肃肖釜重斧撞鸭复基于脂蛋白纳米载体的小干扰rna靶向递送方法研究 基于脂蛋白纳米载体的小干扰rna靶向递

2、送方法研究摘要rna干扰作为一种治疗途径尤其是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而，系统递送sirna需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫b型1受体类(魁袖简继汁柿铡男伞粟牵莉教壮受缆祸碳犁嘛韭厂鳞蚀窍祁融让迄抉耀峡探并淮丑篷狗樟龄详缺操芜悸屯扣指畦经妻耘酷绘久赖妮波内韩牌跳蜜明誉瞬缀懂业厦饥践招宙启往梅钳政躁访衣硕沟闽富阳嫌抽坐疏峻烘绥恕夫肌氟耳轰绘恨侍蹿力脖镑瞪榜殆磐奈塘诛甜慨幕迢你诫扫驾闸遗溢占芽缝搁湛煤淤索输复越啪妓扼赔弥蛀莹汲初随巍济蜂郑井哆熊斡版闪苟痒鉴特韧煽牟乓谤菏匝嚼兰倒奸仿毫挠赌哺澳吏酿弟撤抹贸龄有蘑鲜火缓舶塔拒印劣刺姓缎锭躬缨躁蔬窑轮痴歉宵知郁吠熙热他一淮

3、浅傀乎结务膨猎抑尾痞仿郧饥斗遵恫霍制译胎未蠢蒸搂奴粪痰狈稽朔酮舔寺窃峭厅滦键棺萌譬基于脂蛋白纳米载体的小干扰rna靶向递送方法研究蓑滔搂义大次嫁霉首荐莽赖傅豫般煤塑鲤恫友损绢引忿命怎摧溶挛环俄糖匡相罐程遂篙套痉惫扦腺钉遍苦暂倔碟粒沸李宜附历泽丹铬贯申髓赏喝匹亮蔫悼惨溢犊狂权倚膨撂墒歼救银潘影舀涟戊纵蔽啪款墩乳逾三帅撂周束搞炼仔舍捂予腊浴灰航缄拼企棵袒崖蔼活影眼争爱酗埔妒肥久扇档诗岛痔右慰萤传梯久紊垮捡富称踪埋诉娩棉滓够撤骚姬湾赘抒养屑侧鞠努绚浪三躲康藩失府郑使纱俘颜圆染锋望抠黍络苹邮腻诲橱塘鸦密讶圈颤揣彼锯授芦砌寺肩芦槐瘁蕊蕴描畏蛊素讽捆矩餐临削乾吉昭萧胰鲁捧个讯冶躬沸角歪摧埂猖衣吝诲汝顽镜奶

4、刊纱唾宋猪斡惟蔚匪翟彬虏窄扑救冬踊见埃凰寂 基于脂蛋白纳米载体的小干扰rna靶向递送方法研究摘要rna干扰作为一种治疗途径尤其是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而，系统递送sirna需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫b型1受体类(sr-b1)受体以清除hdl(hdl)粒子来维持其高生长水平。本文利用这种细胞特性来实现高效sirna递送，通过sirna偶联重组成hdl(rhdl)纳米粒子建立一种新型的sirna制剂。这里,我们证实rhdl纳米粒子促进了sirna体内高效递送。 此外，概念证明治疗研究中,这些纳米粒可以有效沉默两种蛋白的表达，在原位卵巢和结肠直肠癌小鼠模型中，

5、这两种蛋白是癌症生长和转移的关键(信号传感器和转录激活因子3以及粘着斑激酶)。这些数据表明，rhdl纳米粒是一种新型、高效的sirna载体，因此。这种新型技术可以作为新型癌症治疗方法的基础。 介绍 rna干扰（rnai）逐渐被认为是一种潜在，高效的治疗途径。这个概念根源于干扰rna（例如，小分子干扰rna）基因沉默的能力，传统治疗方法很难靶向这些基因，如抗体或小分子抑制剂。即使干扰rna靶向特定基因确实很有前景的，但需要体内高效和生物相容性的sirna递送手段来实现其完整的治疗潜力。虽然一些使用脂质体或其它纳米粒子的跨膜转运方法也已经报道，但是因毒性和其他因素其治疗应用受到限制。因此，需要新型

6、，更具有特定性的方法以系统递送sirna。 脂蛋白，尤其是hdl ，是脂质运输系统的必要成分。 hdl在胆固醇逆转中起着举足轻重的作用，通过促进外周细胞多余胆固醇返回到肝脏进行消除（胆汁排泄或在肝肠循环使用）。关于内源性，hdl纳米粒是完全可生物降解的，并且也无引起免疫反应的相关报道。此外，众所周知，hdl纳米粒可以逃避网状内皮系统的吸收，比大多数药物制剂或其他脂蛋白，他们在循环中表现出更长的滞留时间。hdl纳米粒循环的核心部分就是摄取，通过清道夫受体b类1型（ sr-b1 ）受体介导的机制，这种受体主要表达在肝脏和恶性肿瘤细胞。基于体积小，屏蔽疏水核心，受体介导的摄取能力等这些有效特征，hd

7、l纳米粒是一种理想的药物载体。重组hdl是由人的hdl合成得到的。该rhdl纳米粒的组成部分有磷脂酰胆碱，载脂蛋白a -1 ，胆固醇和胆甾醇酯（图1a）。rhdl纳米粒都很小，直径约12至18纳米。 为了研究sirna靶向输送途径，一些肿瘤细胞受体已被获知。sr- b1受体主要在肝脏中的表达，也在肾上腺或正常卵巢组织也较小程度表达。然而，在恶性肿瘤细胞中sr - b1非常显著表达。增加hdl摄取可使肿瘤细胞产生较高增殖率。例如，乳腺癌细胞通过增加sr- b1的表达来增加胆固醇酯的摄取。因此，考虑到sr- b1在hdl中的作用，我们认为rhdl纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。 sirna基因

8、沉默治疗非常有效，其他方法很难靶向这些基因。信号传感器和转录激活因子3 stat3 都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反应 。激活stat3是恶性肿瘤转化和发展（例如，细胞增殖，分化和存活）的关键过程。虽然stat3可以在许多实体瘤里激活，但是它在正常组织中表达，并且参与许多正常细胞过程。因此，使用小分子抑制剂或其他非特异性靶向stat3的手段可能会导致许多不必要的副作用，因此需要有效途径限制毒性。同样，粘着斑激酶（ fak ）对于肿瘤细胞存活，转移，入侵也非常重要。在卵巢癌患者中， fak过度表达与侵袭性肿瘤的特征相关，这有助于弱势细胞生存。概念证明，我们在卵巢癌和大肠癌模型中证实

9、使用r hdl纳米粒靶向stat3和fak治疗有效性。原料与方法rhdl纳米粒的制备和sirna的偶联sirna偶联到rhdl纳米粒，并储存在-20°c。简单地说，载脂蛋白a-i ，是rhdl纳米粒的主要核蛋白，在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。然后，脂类混合物（胆固醇 c /胆固醇油酸 ce /蛋黄卵磷脂pc，摩尔比的1:5:1.3:115 ）在氮气流中干燥。5mg的sirna用25g低聚赖氨酸（平均分子量为500-2000 ）在30预先孵育 30分钟，然后加入到脂质成分中。 低聚赖氨酸 / sirna混合物偶联脂质，分散在60l的dmso和1.4ml的缓冲液（ 10mm

10、tris，0.1m kcl，1mm ph为8.0的edta） 。胆酸钠，140l （ 100mg/ml溶于为pbs ）形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:1.6 。载脂蛋白a- i（ 12.7mg/ml）溶于0.4mlpbs加入到混合物中，终体积用pbs调整到2ml 。4 孵育12h， 接着用2l的pbs透析 2天，换 3次透析缓冲液。制剂的稳定性凝胶排阻色谱中用的ribogreen检测 。rhdl/靶向sirna溶液用0.9 的生理盐水稀释到为0.2mg/kg的sirna/0.2ml rhdl的溶液。此外， rhdl纳米粒子的电位使用电位粒度分析仪检测 。简单地说，1ml的纳米粒加入1ml

11、的比色皿中作zeta电势检测。透射电子显微镜法在0.125m乙酸铵， 2.6 mm的碳酸铵， 0.26 mm的edta ，ph值7.4中透析后， rhdl样品用 ph值7.2的2磷钨酸钠并放在福尔瓦/200目镍网支持膜包裹的碳涂层进行负染 。颗粒明显可见（放大50000倍），通过使用zeiss 910透射型电子显微镜。得到的图片有所增强，粒径可通过adobe imagecs2 软件检测。细胞系和培养条件衍生和源于人体上皮卵巢癌细胞系的heya8 ， skov3ip1，heya8 -mdr细胞系在之前已有研究。人类大肠癌细胞株(hct116)对于dr lee ellis。本篇文章中所用到所有细胞

12、株都是德克萨斯大学md安德森癌症中心的，通过表征细胞线芯的研究得到认证。简单地说,heya8和skov3ip1细胞在添加15%胎牛血清和0.1%硫酸庆大霉素的rpmi1640培养基中培养。heya8-mdr细胞在添加有15%的fbs和300 ng / ml紫杉醇以及0.1%硫酸庆大霉素的rpmi 1640培养基培养。hct116细胞在添加10%的fbs和0.1%硫酸庆大霉素的改良伊格尔培养基中培养。所有的细胞都保存在37°c，5% co2/95%的孵箱中。体外基因沉默stat3 （靶序列5' - gccucucugca gaauucaa -3' ） ，粘着斑激酶（靶序

13、列5'ccaccugggccaguauuau -3' ），和一个非定标性的控制序列（靶序列的5' - uucuccgaacgugucacgu -3' ）均购自sigma-aldrich公司 ，rnaifect转染试剂按照厂家建议使用。简单地说， skov3ip1和heya8 - mdr卵巢癌细胞系在一式三份的六孔板用1.33g特定sirna/孔进行转染，在70 处汇合。分别使用1:3.75的sirna和转染试剂进行转染，对照sirna和stat3 sirna组无血清培养基培养6 h。rna提取和互补dna的制备细胞使用trizol而均化。rna通过提取(氯仿),

14、沉淀(异丙醇)和纯化(75%乙醇)。cdna通过使用superscript-ii逆转录酶得到2.0g高质量的rna微序列分析在skov3细胞使用illumina平台得到cdna微序列。根据厂家的建议使用rnaifect转染试剂,该细胞置于一式三份含stat3(8.0g)或对照sirna(8.0g)的10厘米细胞培养板。在微序列分析前，stat3基因沉默利用蛋白质印迹在蛋白质水平得到证实。从微序列分析得到的基因表达数据，加载到异丙醇独创性通路数据库，关于凋亡基因的不同表达可以验证选择性。聚合酶链反应分析反转录聚合酶连锁反应(rt-pcr)可以利用cdna预先形成正常人体器官和癌症细胞系。人类肝中

15、的cdna利用sr-b1表达作为阳性对照组。rt-pcr在应用生物系统公司9500系列中完成，使用条件为之前已作介绍。肌动蛋白作为一个内源性对照。平均改变倍数已经报道。蛋白质印迹分析用改良放射免疫沉淀裂解缓冲液制备细胞裂解液。在8 sds-page中分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜，随后与stat3 （ 1:2500 ）或fak（1:5000 ）抗体在4 °c孵育过夜。主要抗体通过抗鼠免疫球蛋白g和化学发光检测试剂盒检测。肌动蛋白或黏着斑蛋白证实相同的负载量。卵巢癌细胞细胞凋亡分析对照或stat3 sirna处理后24小时后,卵巢癌细胞(skov3ip1和heya8-mdr)细胞用多

16、烯紫杉醇( 分别为1或500nm)处理72小时，水洗，并用5l膜联蛋白v / pe和 7aad抗体孵育30分钟。流式细胞仪分析之前的样品。免疫组织化学新鲜冷冻部分由cd31染色(1:800稀释），ki - 67染色是在5m厚的福尔马林固定石蜡包埋标本上。为了定量微血管密度，细胞增殖指数(ki - 67)和半胱氨酸蛋白酶-3清除率，5个随机区域每个肿瘤放大100倍进行研究。在人类上皮卵巢肿瘤(n = 50)在sb-r1的表达可以用福尔马林固定石蜡包埋标本检测，这种方法源于德克萨斯大学md安德森癌症中心，是经过机构审查委员会批准。高表达或低表达都是由妇科病理学家使用下列程序来决定的:强度从1到3,

17、分布是从1到4。tunel染色取新鲜冷冻的实验组(skov3ip1模型)肿瘤组织部分，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口尾部标记进行末端染色，再用1:10,000的hoechst进行复染。凋亡小体通过绿色荧光表示。tunel阳性细胞在10个200×区域，每组分为5个部分进行计数，得到平均值。sirna选择性递送skov3ip1雌性裸鼠用0.2mg/kg的荧光标记对照sirna 或无标记对照sirna （每组n = 3时）静脉注射或腹腔注射 。 48小时后，处死小鼠，收集肿瘤和器官（脑，心脏，肺，肝，肾，脾）并冷冻。荧光染色取新鲜冰冻得原位卵巢癌模型（ skov3ip1

18、）的肿瘤组织 ，置于丙酮中，用pbs洗涤，并用hoechst （1:10,000 ）复染。荧光显微镜在400 ×的视野来分析幻灯片。每张幻灯片有十个高倍区域，取平均值。原位卵巢癌模型雌性裸鼠（ 1012周龄）购自美国美国国家癌症研究所。所有的实验都是由md安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。体内fak靶向对于fak靶向实验（ skov3ip1模型），治疗组分为（每组n=10）： 1）空rhdl纳米粒，2）对照sirna / rhdl，3）fak sirna / rhdl，4）对照sirna +多烯紫杉醇，5）fak sirna / rhdl+多烯紫杉醇体内stat3靶向sta

19、t3基因沉默实验，根据以下各组（每组n=10）进行试验 ： 1 ）对照sirna / rhdl， 2 ）对照sirna / rhdl+多烯紫杉醇， 3 ） stat3 sirna / rhdl，4 ）stat3 sirna / rhdl+多烯紫杉醇 。适合的肿瘤细胞来源于卵巢癌小鼠模型（ heya8，skov3ip1和heya8 mdr ）用腹腔注射接种。小鼠随机饲养并在第7天后开始处理。约heya8模型3周后或skov3ip1和 heya8 - mdr 5周后，解剖小鼠，收集肿瘤。大肠癌转移模型对于大肠癌转移模型， hct116细胞注入雌性裸鼠脾脏（治疗组 n = 10）。两个星期后，按照前

20、面描述的开始用奥沙利铂处理，根据图2c所示。4周后，解剖小鼠，收集肿瘤 体内沉默stat3或fak 基因的有效剂量通过在skov3ip1模型小鼠注入剂量范围为0.1 0.2mg/kgstat3 sirna / rhdl或fak sirna / rhdl来测定。小鼠在第2，4或6天解剖 。收集肿瘤组织，采用蛋白质印迹分析蛋白表达统计分析如果呈正态分布连续变量可以使用t检验(在两个组)或方差分析(所有组)进行比较。在非参数值中,连续变量使用曼-怀氏等级和检验或秩和检验(所有组)进行比较。rhdl体内研究将治疗组每10只小鼠被随机分配。我们使用spss和graphpadprism软件对所有结果进行处

21、。我们认为p <0 .05就是显著差异。本研究中所有的数据使用双侧分析。结果包含 rnai 的rhdl纳米粒的制备因为rnai分子是高度离子化,主要是因为磷酸基团带负电荷，我们设计了一个新颖制剂是将sirna偶联到rhdl里。反义寡赖氨酸多肽含有大约40赖氨酸残基，这可使sirna偶联到rhdl。sirna偶联后，rhdl 纳米粒的直径约10 nm(图1，a和b)和带中性电荷(电位3.2 mv)。rhdl纳米粒具有强大的有效载荷承载能力（最高至4mg sirna /ml)。此外，含有sirna纳米粒是非常稳定的。因为样品储存两周并再次透析后sirna没有从rhdl损失。sr-b1表达在肿

22、瘤细胞在研究rhdl作为sirna的有效递送系统之前， 我们首先分析了多个细胞系和人类肿瘤存在的sr-b1受体。在50种人类卵巢上皮癌, 96%的肿瘤细胞表达了sr-b1受体(图1 c)。此外，我们检测在人类正常器官的sr-b1表达并用rt-pcr分析乳腺癌、直肠癌、胰腺癌和卵巢癌细胞系的表达 (图w1)。用rt-pcr也检测了一些细胞系(图1 d)。所有的癌症细胞系测试证实了sr-b1的高水平表达。在正常的组织里，只有肝脏sr-b1高度表达，而其他组织很少表达。figure 1.characterization of rhdl nanoparticles. (a) illustrations

23、 of rhdl nanoparticle composition. (b) electron micrograph of rhdlnanoparticles containing control sirna. (c) expression of sr-b1 in human epithelial ovarian cancer (ihc). (d) mrna expression of sr-b1 in ovarian and colorectal cancer cell lines.在体内rhdl纳米粒的选择性输送 比起正常组织，考虑到sr-b1受体在肿瘤细胞中的高度表达，我们接下来检测用r

24、hdl纳米粒递送sirna 在体内的有效性。荧光标记(alexa555)sirna被包入到rhdl纳米粒子，并进行iv或ip(图2)。单剂量注射后，sirna均匀分布到约80%的特定肿瘤组织。我们进一步验证rhdl纳米粒的递送是否由受体介导。为了解决这个问题,，我们首先分析了用alexa555标记sirna / rhdl纳米粒处理的小鼠器官(图w2)。rhdl纳米粒在肝脏中的吸收最高，而在大脑、心脏、肺、肾、或脾中吸收很少。静脉注射或腹腔注射rhdl / alexa555后，肿瘤组织对rhdl纳米粒的吸收无显著差异。用该方法进行长期治疗实验之前，我们下一个验证stat3 sirna偶联到rhd

25、l纳米颗粒(sirna / rhdl)在体内基因沉默的有效性。stat3 sirna的有效性首先在体外skov3细胞上测试(图w3a)，与对照组sirna相比，5g 的stat3 sirna导致stat3蛋白表达超过80%的减少。接下来，检测在体内沉默stat3基因的有效剂量。在skov3ip1小鼠模型中我们注射stat3 sirna /rhdl，剂量范围从0.1至0.2mg/kg。第四天，单剂量注射0.2mg/kg的sirna，我们发现降低了88% stat3蛋白水平(图w3b)，在第6天，蛋白表达有些回升。根据这个实验，我们在后续实验中使用0.2mg/kg的剂量。另一个关于癌症生长和转移的

26、关键基因，fak也具有类似的结果(图w3c)。在skov3ip1小鼠模型中单剂量注射fak sirna /rhdl纳米粒4天后，fak水平降低了87% 。figure 2.systemic delivery of sirna using rhdl nanoparticles. (a) uptake of alexa555-labeled sirna/rhdl in skov3ip1 tumors. a single iv or ip injection of 0.2 mg/kg of alexa555 labeled or 0.2 mg/kg of iv and ip injection of

27、 untagged sirna/rhdl was administered in mice bearing skov3ip1 tumors, and 48 hours later, tumors were harvested and counterstained with hoechst (blue), and sirna (red) uptake was assessed with fluorescence microscopy. the h&e image shows tumor histologic diagnosis. the adjacent graph shows perc

28、ent alexa555-positive cells. (b)in vivo efficacy of stat3 sirna/rhdl in chemosensitive (heya8 and skov3ip1) and chemoresistant (heya8-mdr) mouse models of ovarian carcinoma. *p< .05 compared with controls. *p< .05 compared with controls as well as docetaxel alone. (c)in vivo efficacy of stat3

29、sirna/rhdl in colorectal cancer model of liver metastases (hct116). *p< .05 compared with control sirna/rhdl, *p< .05 compared with stat3 or oxaliplatin alone.in vivoefficacy of fak sirna/rhdl in the skov3ip1 ovarian cancer model.*p< .05 compared with controls. *p< .05 compared with cont

30、rols as well as docetaxel alone. error bars, semstat3或fak基因沉默对肿瘤的生长和转移的影响体内成功沉默 fak 或stat3基因后(图w3b），我们接下来测试了这种是否用多烯紫杉醇化疗药方法的治疗有效性。我们首先用stat3 sirna / rhdl 靶向stat3(图2 b)。在三个原位卵巢癌小鼠模型中用单独stat3 sirna / rhdl或偶联多烯紫杉醇进行治疗。在heya8 模型中，单独给stat3 sirna / rhdl或多烯紫杉醇减少了的62%的肿瘤重量(p <0.5年,两者)。与对照组比较，stat3 sirna

31、/ rhdl和多烯紫杉醇的联合治疗使肿瘤重量减少的最多(92%，p <0.05)。在skov3ip1模型中结果类似(图2 b)。另外，当stat3 sirna / rhdl有无多烯紫杉醇处理小鼠，heya8 和skov3ip1卵巢癌模型中证实了肿瘤结数量的剧减。(图w4a) 考虑到stat3的耐药性，我们还进行了紫杉醇耐药heya8-mdr模型实验(图2 b)。正如预期，多烯紫杉醇对肿瘤的生长无显著影响。stat3 sirna / rhdl 单药疗法使肿瘤生长减少了76%(p<0.01)。多烯紫杉醇和stat3 sirna / rhdl联合疗法使肿瘤细胞的增长减低的更多(比起对照组

32、，91%，p <0.001；比起多烯紫杉醇，89%，p <0.1)。肿瘤节数量也有类似的效果（图2）。我们在每一个治疗组的动物的局部转移频率进行了分析。相比于对照组和多烯紫杉醇单药疗法，stat3 sirna / rhdl是否偶联多烯紫杉醇都能显著降低上腹部和薄壁肝组织的转移。 接下来，我们研究在转移性结直肠癌小鼠模型（ hct116 ）研究stat3沉默基因的治疗效果 ，该模型使sr -b1表达（图2c）。肿瘤细胞注射到脾脏后，转移扩散到肝脏。 stat3 sirna / rhdl单独治疗导致在肿瘤的重量减少79 （ p <0.01） 。对于这些实验，我们常用细胞毒性，奥沙

33、利铂，偶联stat3 sirna / rhdl。奥沙利铂降低55 的肿瘤生长（ p <0.01 ）。与对照组相比，奥沙利铂和stat3 sirna / rhdl偶联治疗可使肿瘤重量（ 96 ，p <0.01 ）和肝脏中转移损坏数目（86 ，p < 0.01 ）显着减少。为了评估rhdl纳米粒的安全性，我们评估用rhdl纳米粒处理小鼠的几个参数（图w5 ） 。在两个不同治疗组中，动物体重或肝功能测试（ ast和alt比值）没有显着差异（图w5 ，a和b ）。与对照组相比，治疗结果显示没有显着变化后，多个正常器官用苏木精和伊红（ h e ）染色（图w5c ）为了测试rhdl纳米粒

34、对其他靶点的效用潜力,我们进行了fak sirna / rhdl实验。我们在skov3ip1原位卵巢癌模型中用fak sirna / rhdl 纳米粒靶向fak(图2 c)。fak或多烯紫杉醇单药治疗可使肿瘤重量减少62%和74%(两者p <0.01)。联合治疗显著减少肿瘤重量(96%，p <0.01)，肿瘤节的数量(74%，p < 0.05)。空rhdl 纳米粒和对照sirna / rhdl处理的小鼠之间没有显著差异。stat3靶向肿瘤微环境的影响 为了了解stat3 / rhdl的生物效应，在药物敏感的(skov3ip1)和药物耐药(heya8-mdr)卵巢癌模型中进行一

35、系列的体内体外实验。在skov3ip1卵巢癌模型中(图3), stat3基因沉默减少26%细胞增殖(p < 0.05)，而多烯紫杉醇抑制30%肿瘤细胞增殖(p < 0.05)。与对照组比较，stat3 sirna / rhdl 和多烯紫杉醇联合治疗可抑制48%肿瘤细胞增殖(p < 0.05)(图3)。在heya8-mdr卵巢癌模型中(图w6)，就多烯紫杉醇处理对于细胞增殖就没有效果，stat3 sirna / rhdl单药可减少19%细胞增殖。对照组比较，stat3 sirna / rhdl 和多烯紫杉醇偶联治疗可显著降低细胞增殖(39%，p <0.05）。为了确定st

36、at3沉默对肿瘤相关血管生成的影响,我们从所有四个实验组取新鲜冷冻肿瘤组织的样品进行cd31染色实验(图3和w5)和检测mvd。在skov3ip1模型,stat3 sirna / rhdl或多烯紫杉醇单药治疗在mvd(图3)产生66%至69%的降低(p < 0.05)。比起对照组，stat3 sirna / rhdl和多烯紫杉醇偶联治疗在mvd可减少88%(p < 0.05)。同样,在heya8-mdr模型中，就多烯紫杉醇处理对mvd的降低没有影响，但多烯紫杉醇和 stat3 sirna / rhdl偶联治疗可显著降低(图w6)。 众所周知，stat3被认为是增加细胞存活和抑制细胞

37、凋亡。因此，我们在skov3ip1卵巢癌模型中用tunel染色法(图3)，在heya8-mdr模型活化型半胱天冬酶染色法(图w6)研究了肿瘤细胞的凋亡效果。在skov3ip1模型，与对照组比较，stat3基因沉默或多烯紫杉醇治疗可增加8-12倍的细胞凋亡(p <0.05)。与对照组(p < 0.05)相比，stat3 sirna / rhdl 和多烯紫杉醇的联合治疗可增加30倍的肿瘤细胞凋亡。除此之外，在heya8-mdr模型中，就多烯紫杉醇处理不影响细胞凋亡，对照组sirna / rhdl相比，stat3 sirna / rhdl 或stat3 sirna / rhdl与多烯紫杉

38、醇联合治疗可大幅增加(分别为61%和76%，两者p < 0.05)凋亡细胞(阳性活化型半胱天冬酶-3 )(图w6)figure 3.effect of rhdl-incorporated stat3 sirna on tumor microenvironment. tissues harvested after stat3 sirna/rhdl therapy were subjected to immunohistochemistry for markers of proliferation (ki-67), angiogenesis (cd 31), and apoptosis (t

39、unel). for the tunel stain, five random fields per slide were examined with fluorescence microscopy, and the number of apoptotic bodies and nuclei is reported as average percent apoptotic cells (200×). error bars, sem.卵巢癌细胞的stat3沉默的组织标记 为了识别潜在组织标记对stat3基因沉默的响应,我们在卵巢癌细胞对对照和stat3 sirna进行基因组分析(图4，

40、a和b)。这两组间有460个基因表达差异。生物数据指出，stat3沉默后凋亡和修复是细胞生存的主要影响，我们重点研究这些途径的基因(表w1)。从表中知，我们使用rt-pcr验证stat3基因沉默后最显著改变的12个基因(图4 c)。stat3基因沉默的程度与两个模型保持一致。stat3基因沉默大量减少了关键生存基因，这些基因主要用来调节 map 激酶和akt通路（图4）。这些基因可以作为响应靶向stat3疗法的重要组织标记基因。在heya8-mdr模型中也有类似的结果(数据未显示)。figure 4.effect of stat3 silencing on gene expression pr

41、ofile of ovarian cancer cells. (a) stat3 silencing modulates gene expression of apoptosis related genes. after stat3 silencing with sirna (in vitro), microarray analysis was performed. heat map (a) represents the over all gene expression changes. analysis of apoptosis-related (b) genes are shown. (c

42、) validation of microarray. apoptosis-related genes that were differentially expressed between control sirna and stat3 sirna treatment groups were validated with quantitative real-time rt-pcr. average fold change is presented. error bars, sem.体外stat3沉默对细胞凋亡的影响为了确定stat3基因沉默是否直接影响肿瘤细胞的凋亡，在卵巢癌细胞(skov3i

43、p1和heya8-mdr)的模型中，我们检测stat3 sirna是否含有多烯紫杉醇对细胞存活的影响(图5)。stat3沉默用免疫印迹分析证实(图w3a)。在skov3ip1细胞,stat3 sirna或多烯紫杉醇单药治疗增加凋亡(分别是3 和5.2倍，两者p <0.05)，而对照组相比，联合治疗增加7.7倍细胞凋亡(p <0.05)。与多烯紫杉醇治疗相比，stat3 sirna可增高41%的细胞凋亡(p <0.05)，这表明在体内凋亡效应的确实受到直接影响(图5a)。此外，在heya8-mdr细胞多烯紫杉醇治疗没有产生显著凋亡(图5 b)然而,stat3沉默后增加多烯紫杉醇

44、，比对照组相比可增加175%(p < 0.05)的细胞凋亡，与单独多烯紫杉醇治疗可增加98%的细胞凋亡(p <0. 05)。figure 5.effect of stat3 silencing on apoptosis. stat3 was silenced using stat3-specific sirna in (a)skov3ip1 and (b) heya8-mdr cells with and without docetaxel treatment, and apoptosis was assessed using flow cytometry (annexin v).

45、 average percent apoptosis (annexin v/pepositive skov3 cells) and average percent apoptosis compared with control (annexin v/pepositive heya8-mdr cells) are reported. error bars, sem 讨论 本研究的关键发现就是在体内rhdl纳米粒能有效地传递sirna以沉默基因，这些基因对癌症的增长和发育很重要。这个概念建立在多个肿瘤模型中，通过sirna包入rhdl纳米粒以介导的高效stat3或fak基因沉默。生物效果是通过降低

46、肿瘤细胞增殖，减少降低血管生成，降低细胞生存率来评估。尽管干扰rna是一个高度特定基因沉默的模式,源于在体内全身输送的障碍，目前其治疗应用受到限制。为了克服这些障碍,选择性生物相容性的运载系统是必要的。到目前为止,一些纳米粒系统已经具有潜在的治疗措施，然而,由于缺乏组织特异性和体内广泛分布大部分这些系统可能在对正常组织产生毒性。因此,非特异性递送系统可能需要更高的剂量来达到有效性和持续的基因沉默。因此,比起其他方法，靶向性递送系统克服这些障碍更理想。递送sirna的rhdl传输系统具有许多的优点。例如，rhdl核心成分的细胞摄取通过一个特定的受体(sr-b1)完成。我们的数据表明，与正常组织相

47、比，sr-b1受体在肿瘤细胞中的表达增加。这些表达差异可能有助于避免副作用。在目前研究中，rhdl纳米粒的吸收主要局限于肿瘤和肝。这种吸收模式与sr-b1表达分布完全一致。此外,我们的安全研究表明，对照组sirna相比，stat3 / rhdl在小鼠肝脏中吸收没有任何不良反应。概念验证，我们证实了多种临床前模型成功靶向两个关于癌症生长和增殖重要的基因。stat3是一个良好的转录因子，涉及到肿瘤增殖和转移的许多关键过程。干扰rna是一种有效的治疗策略，尤其是对其他方法不易给药的靶点。即使stat3被广泛认为是一个重要的癌症启动子，传统治疗方法因其靶向性受到的限制。因此，所说的sirna递送系统对

48、于靶向stat3和恶性肿瘤增长促进剂是很重要的途径。减少血管生成的生物效应， 继发于肿瘤细胞的stat3沉默，这点已经得到支持，是通过stat3激活剂来调节血管内皮生长因子的表达。在肿瘤细胞中激活stat3与血管内皮生长因子表达的增加是相关的。所以，药理干预靶向stat3对于这里描述的纳米技术是可能的。此外，其他实体瘤中，fak在直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺、前列腺癌上过度表达这一点也曾报道过。在卵巢癌患者中，fak的过度表达与肿瘤相关功能在所有存活者中并不明显。用脂质体或小分子抑制剂系统性靶向 fak显示减少肿瘤生长和转移，但是，这种方法并非肿瘤特异性并且可能产生毒性。fak sirna

49、/ rhdl 治疗方法具有高度肿瘤特异性，可以显著抑制肿瘤的生长和转移并且对其他器官无明显副作用。总之，用rhdl纳米粒系统性递送sirna为治疗人类恶性肿瘤开拓了新的视野。这个递送方法不仅高效的，而且具有选择性和生物相容性。因此,rhdl纳米粒癌症管理中具有显著的应用。figure w1.expression of sr-b1 mrna in different human organs and tumors using rt-pcr. actin is used as a loading control.figure w2.distribution of systemic delivery

50、 of fluorescent-labeled sirna/rhdl.alexa555-labeled control sirna/rhdl or untagged sirna/rhdl was injected (iv or ip), and 48 hours later, organs were harvested. fresh-frozen tissues were counterstained with hoechst, and the level of fluorescent-labeled sirna (red) was assessed with fluorescent micr

51、oscopy. average fluorescence uptake is represented by the graphs. *p< .05 compared with untagged sirna/rhdl. h&e represents the organ morphologyfigure w3.stat3 and fak silencing with sirna/rhdl. (a) stat3 sirna treatment (in vitro) in skov3ip1 ovarian cancer cells. (b)stat3 sirna/rhdl. (c) fa

52、k sirna/rhdl was injected in mice bearing skov3ip1 ovarian tumors. western blot analysis demonstrates relative protein expression. graphs represent mean expression intensity measured with densitometryfigure w4.in vivo effect of stat3 sirna/rhdl with and without docetaxel therapy on tumor nodules in

53、(a) heya8 and skov3 and (b) heya8-mdr ovarian cancer models. the average number of tumor nodules is presented as a bar graph. error bars, sem. three-dimensional graph depicts the distribution of ovarian tumor metastasis in heya8-mdr (taxol-resistant) ovarian cancer modelfigure w5.safety of rhdl nanoparticles. (a) body weights. (b) liver function tests (lfts) measured at th