MMP―9与TIMP―1在复发性流产中的基因表达及相关性研究

1、mmp-9与timp-1在复发性流产中的基因表达及相关性研究摘要目的 检测mmp-9、timp-1在复发性流 产绒毛组织中的mrna相对表达量，研究mmp-9和 timp-1的表达失衡与复发性流产的相关性。方法 选 取2013年412月我院妇科门诊正常早孕和复发性流 产妇女的绒毛组织各19例和28例，rt-pcr检测 mmp-9、timp-1的相对表达量。结果复发性流产组 绒毛mmp-9 mrna的相对表达量为4.11±0.42,正常 早孕组绒毛mmp-9 mrna的相对表达量为2.45±0.36, 两组比较差异有统计学意义(p0.05)。结论 复发性 流产绒毛组织中的mm

2、p-9 mrna表达量显著下降， timp-1 mrna表达量升高，mmp-9和timp-1的表达 失衡参与了复发性流产的发生、发展。关键词复发性流产；mmp-9； timp-1中图分类号r714.21 文献标识码a 文章编号 1674-4721 (2015) 08 (a) -0093-04自然流产连续发生三2次称为复发性流产，复发 性流产临床较常见，近年来其发病有上升趋势，严重 影响患者的身心健康，影响家庭幸福和社会健康发展，因此探求复发性流产的发病机制，为临床治疗和预防 复发性流产提供科学依据有重要意义。本研究采用反 转录聚合酶链反应（rt-pcr）检测不明原因复发性流 产和正常早孕绒毛组

3、织中mmp-9及timp-1 mrna相 对表达量，通过比较两组mmp-9和timp-1的基因表 达水平，探讨mmp-9和timp-1动态失衡与复发性流 产发生、发展的关系，从分子水平研究复发性流产的 发生、发展机制。1资料与方法1.1 一般资料 研究对象为2013年412月在我院妇科门诊就诊患者，年龄1835岁，月经周期57/2830 d,停经4560 cl,经临床妇科检查、b-hcg和孕酮、彩超证实为宫内妊娠，自愿选择人工流产的宫内妊娠活胎19例和复发性流产28例（自然流产三2次，各项检查提示胚胎停育）。流产前两组病史、年龄、孕产次、停 经天数均无明显差异。1.2标本米集1.2.1正常早孕

4、组19例彩超提示：宫内单活胚。常规负压吸宫术选取吸出物中的绒毛组织，液氮冻存。1.2.2复发性流产组28例 彩超提示：宫内妊娠未 压吸宫术，留取绒毛组织液氮冻存。见胎心,结合b-hcg和孕酮，确诊为胚胎停育,行负1.3研究方法1.3.1 试剂 dna extraction kit (bioflux), taq polymerase(biocer), realtime pcr master mix( biocer), probe gapdh(biorad), probe mmp9 和 timpl(biord) 均购于深圳市中生生物技术公司。1.3.2组织总rna提取 取1030 rng组织块，

5、放入6 mm陶瓷研钵中，加入液氮，剪成1 mm见方 小块，用陶瓷研磨杵充分研磨，直至成粉；将研磨 好的粉末迅速转入1.5 ml离心管中，离心管中预先加 入600 u i trizol溶液，充分颠倒混匀，室温静置5 min； 转移上清液至吸附柱中，吸附柱套上新的离心管， 12 000 r/min,离心30 s；弃去外套管中液体，向吸 附柱中加入600 u i洗脱液,12 000 r/min,离心30 s； 重复步骤一次；弃去管中液体，空柱12 000 r/min,离心lmin；将吸附柱转移到新的离心管， 加入20 »1洗脱液，12 000r/min,离心30 s。管中液 体即为提取的总

6、rna溶液,立即用于下游实验或-80°c 冻存。1.3.3目的基因和内参基因引物序列及产物特征 见表1图lo图1显示部分目的基因扩增曲线的情况，横坐标 表示pcr循环数，纵坐标表示基因表达量的荧光度, 基因扩增曲线与横线的交汇点表示ct值，目的基因表 达浓度越高，ct值越小。a： timp-1基因扩增曲线；b： mmp-9基因扩增曲线图1目的基因扩增曲线图1.4统计学分析采用spss 17.0统计软件对数据进行分析，计量资 料以x±s表示，采用t检验，计数资料用百分率(%) 表示，米用x 2检验，以p 3讨论复发性流产在育龄妇女中的发生率约为l%lo 复发性流产不仅给孕妇带

7、来心理创伤，甚至会影响到 以后的妊娠结局2,可能导致日后不孕。约50%的复 发性流产病因尚未明确3,滋养细胞具有高度增殖和 浸润性生长的潜能，但在正常胚胎植入和胎盘形成 时，滋养细胞不会发生过度增殖，侵袭性生长具有严 格的时间性和空间性，限于孕早期及子宫壁的1/3处, 提示机体可能通过细胞因子调控滋养细胞的生长，使 其保持动态平衡。细胞外基质(ecm)是细胞之间的物质，是由大 分子构成的错综复杂的网络，是阻止细胞浸润性生长 的重要屏障5。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, mmps)是降解和再塑造细胞外基 质的zn2+依赖性中性蛋白酶家族，对维持细胞外基质 的动

8、态平衡起重要作用。mmps组织抑制剂(timps) 可以阻断体内mmps所起的作用，胚胎滋养层和蜕膜 中均有mmps和timps表达，两者间的平衡对于基质 的重建和侵袭程度的控制起重要作用。mmps低表达 将会导致滋养细胞侵袭不足，影响胚胎的着床和正常 生长发育，导致流产6。mmp-9是参与滋养层细胞侵 入子宫内膜的主要蛋白质7otimp-l可以拮抗mmp-9, 阻止子宫内膜细胞外基质被mmp-9过度降解，阻止滋 养层细胞的过度浸润8-10 o但各学者研究结果不尽相 同，kuznetsova等11研究发现，mmp-9水平表达低 者流产的危险性增加；iwahashi等12研究提示， mmp-9通过分解iv型和v型胶原参与流产过程；李萍 13的研究认为mmp-9在先兆流产蜕膜组织中表达高 于正常早孕组。吕荟明等14研究认为，timp-1