TAIL-PCR技术及其发展

1、tail-pcr技术及其发展摘要tail-pcr,即热不对称交错pcr，它是一种用来分离与已知序列邻近的未知 dna序列的分子生物学技术。该技术通过3个特异性引物分别与简并引物组合做连续 pcr循环，用不同退火温度选择性地扩增目标片段，所获片段可直接用做探针标记和 测序模板。此使用技术有具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，己被广泛应用于分 子生物学研宂领域。本文将从ta1l-pcr技术的基本原理、操作方法应川范围等方面进行综 述，并介绍tail-pcr技术的发展史及其存在的不足与前景。关键词tail-pcr,引物，基因21世纪是生命科学飞速发展的时代，随着我国加入wto和与世界科技日益接轨

2、，技术 的竞争已日益曾现岀其核心地位和作用1。正是因为基因是遗传物质的基本功能单位，科 学家们对它的研宄己有100多年的历史，且分离、克隆目的基因是研宂基因结构、揭示基因 功能及其表达的基础，所以，某个功能基因克隆就成了生物工程和分子生物学研宂的一个重 点。基因克隆屮常用的方法都要依靠染色体步移技术，基于pcr的染色体步移技术使微量 的核酸(dna或rna)操作变得简中.易行，同时还使核酸研究脱离于活体生物2，所以得 到广泛发展。热不对称性pcr (thermal asymmetric interlacedpcr, tail-pcr)就是立在pcr 技术基础上的染色体步移技术，为扩增己知序列旁

3、侧的未知dna片段提供了捷径3。此技 术是liu和whitter在1995年首先研宂报道的。该技术有简便、特异、高效、快速和灵敏的 特点，和分离出的dna序列可用于阉位克隆、遗传阁谱绘制及直接测序等优点，正是由于 该技术的特点及优点，近年来，被分子生物研究者广泛应用。本文主要从tail-pcr技术的 基本原理、操作方法、应用范围及其发展和目前存在的问题与前景进行综述。1、tail-pcr技术原理tail-pcr是pcr的一种随机引物，随机引物pcr是将一种特异性引物结合在已知基 因区域，随机引物结合在己知区域旁侧的某一区域，从而引发包拈己知区域在内的片段的扩 增(ichikawa et al.

4、，1997) 4。tail-pcr技术原理是：利用目标序列旁的已知序列设计的3个退火温度相对较高的嵌 套特异性引物(specialprimer，简称sp，约20bp)分别和1个tm值较低的短的随机简并引物 (arbitrarydegenerate prime, ad,约14bp)相组合，以基因组dna为模板，根据所选引物的长 短差异和特异性，设计3次具不对称的温度循环，通过分级反应达到扩增特异引物的目的。2、tail-pcr的操作方法(1) 引物设计tail-pcr反应对引物的要求比一般的pcr反应对引物的要求相对要高，所以 tail-pcr引物的没计是很重要的。特异引物的设计：3个嵌套的特异

5、性引物长度和tm值一 般分别为2030bp和58-68°c,为了pcr扩增的有效性，sp1、sp2和sp3之间最好相距 100 bp以上。简并引物的设计：它是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计 的，一般较短，长度和tm值一般分别为14 bp左右和3048°c之间。(2) 模板制备为了更好的与fi标序列退火，应尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物没计区，如蛋氨 酸和色氨酸，且要注意物种对密码子的偏好性，选择该物种使用频率岛的密码子，以降低引 物的简并性；尽量避免3末端的简并，因为对于多数氨基酸残基来说，引物t末端最好不 要位于密码子的第三位；另外，在一些多义位置可使用

6、脱氧次黄嘌呤代替简并碱基。(3) 反应体系引物设计的设计在整个tail-pcr屮固然重要，但是三个循环pcr的各组分的工作浓 度也是不可忽视的。在经典的tail-pcr屮，第2、3次反应的模板都由前一次pcr产物按1/1 000进行稀释，但实验证明，在实际的pcr反应中，只有优化每一轮产物的稀释倍 数才能得到更好的实验结果。在反应体系中，特异性引物的浓度与普通的pcr相同，但为 了满足引物的结合效率，简并引物的浓度要相对较高，一般为2.05.0滋mol/l。3、tail-pcr的应用范围(1) 用于研究结构基因的表达和调控：可根据已知的基因或分子标记连续步移，获 取人、动物和植物的重要调控基因

7、。(如分离克隆启动子并对其功能进行研究)；(2) 用于鉴定t-dna或转座子的插入位点；(3) 用于步查获取新物种中基因的非保守区域和染色体测序的空隙填补，以获 得完整的基因组序列；(4) 用于人工染色体pac、yac和bac的片段搭接。4、tail-pcr的发展史ta1l-pcr技术是pcr技术的一种，是体外扩增dna序列的技术。1983年美国科学家kary mullis孕育出pcr的雏型，经过两年的努力，在实验上证 实了pcr的构想，并于1985年申请了有关pcr的第一个专利，在“science”杂志上发 表了第一篇pcr的学术论文。从此pcr技术得到了生命科学界的普遍认同5。但 mulh

8、s用的dna聚合酶为大肠杆菌dna聚合酶i的klenow片段，不耐热，易钝化，给 p c r技术操程序带來了不少麻烦。1988年初，keohang用t4dna聚合酶进行pcr，其扩增的dna片段很均一，真实 性也较高，只有一种dna片段，但仍需加新酶。1988年saiki等从水声嗜热杆菌中提取到一种耐热dna聚合酶，在热变性时不会被 钝化，不用每次扩增都加新酶，极大的提高了扩增的效率，使pcr技术得到了广泛的 应用，也使pcr技术成为遗传与分子分析的根本性基石。往后的10多年里，pcr技术在不断的被改进，后來发现了具高保真性的taqdna 聚合酶，在常规pcr成熟后，又衍生出很多适用于其他目的

9、的pcr技术，原来的pcr 只能扩增两段已知序列之间的dna,现在可扩增到已知序列两侧的未知序列(染色体 移步法)6,至此，tail-pcr技术成熟，随着科技不断的进步，现在甚至可以扩 增到序列未知的新基因7。5、tail-pcr的不足之处人无完人，技术也是一样的，虽然tail-pcr相对于一般的pcr来说有简便、特异、 高效、快速和灵敏等很多的优点，但是它同样存在不足：(1) ad引物的结合位点有限，因而成功的几率不够高；(2) 在第2及第3轮巾仍可检测到非特异带，而理想的状况是要么出现特异带，要么没有 任何带；(3) 特异产物大小难以控制，常扩增到500bp产物.6、tail-pcr的应用

10、前景2006年，杨帆、林俊芳、苗灵凤、郭丽琼等通过rt-pcr技术从云芝中克隆到全长 的梢酸酶基因b5。通过分析，分离克隆到的植酸酶基因可能是新的基因8。2007年，陈军营、孙佩、王德勤、陈新建等以小麦基因组dna为模板，用一种改良热 不对称交错 pcr(thermal asymmetric interlaced pcr，tail-pcr)技术克隆到全长为 1 748 bp 的 小麦glp3基因的上游侧翼序列9。2009年，侯雷平、王小蒈、李洪清、李梅兰等采用tail-pcr成功扩增了转基因蓝猪 耳t-dna插入位点的侧翼序列，扩增片断长度为2002 000 bp，大多数片段在400 bp和

11、800 bp左右，其屮36%的序列含有植物的同源序列10。2011年，龚亮、张彦博、耿鹏、胡美英等利用tail-pcr技术克隆了小菜蛾线粒体s合物iii铁硫蛋白亚基的基因组dna序列，全长5 013 bp, genbank登录号为hm210791。研 宄表明，该基因具有3个内含子，大小分别为96 bp、577 bp和549 bp,且其内含子两端具 有典型的gt-ag结构11。同年，曹文清、刘建、罗义、毛大庆等也运用tail-pcr扩增分析sull、tetw的 侧翼序列，結果表明磺胺抗性基因与氨基糖苷类药物抗性基因存在连锁现象，四环素抗性 基因与tnb1230存在连锁，并成功摸索了从混合模板中t

12、ail-pcr获取特定位点多个侧翼序 列的方法12。总之，自pcr方法建立以來，在20多年的时间里，发展很快，己经有一系列pcr技术被 设计出来，并广泛的应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学研究屮。pcr的建立大大的 推动了生命科学的发展。由于pcr的实用性和极强的生命力，pcr技木还将会被不断的完善 和发展。随着分子生物学理论和应用研究的tl益发展，自从1983年获得第一株转基因祖株 以來，楨物基因工程日新月异。目的基因的分离和克隆是楨物基因工程的第一步。ta1l-pcr 技术以其自身的优点和进步在植物基因的分离和克隆中日趋突出它的作用，随着科学技术的 不断进步，tail-pcr技术将会被

13、不断改进和完善，相信tail-pcr技术将逐渐成为分子生 物学研究中的一个强大工具，进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。参考资料i王廷华。第二版总序。pcr理论与技术。北京：科学出版社，第二版，第1 页2黄留玉。绪论。pcr最新技术原理、方法及应用。北京：化学工业出版社， 第二版，第1页3郑岑，张立平，唐忠辉，赵吕平，苑少华。tail-pcr技术及其在植物基因中的克 隆。基因组学与应用生物学。2009年，第28卷，第3期，第545页4郑岑，张立平，唐忠辉，赵昌平，苑少华。tail-pcr技术及其在植物基因中的克 隆。基因组学与应用生物学。2009年，第28卷，第3期，第544页5王恒樑，黄留

14、玉。pcr发展简史。pcr最新技术原理、方法及应用。化学工业出版 社，2011年，第二版，第1页6huang shjong ay,yang w，et al. amplification of gene ends from gene library by pcr with single-sided specificity.methods mol biol，1993, 15: 357-3637pitzer c，stassar m，zollerm.modification of renal-cell-carcinoma-related cdna clones by suppression subtractive hybridization.j cancer res clin oncol，1999,125(8-9):487-4928杨帆，林俊芳，苗灵凤，郭丽琼。利用tail-pcr和rt-pcr技术克隆云芝植 酸酶基因。应用与环境生物学报。2006年12卷05期9陈军营，孙佩，王德勤，陈新建。一种改良的克隆小麦glp3基因启动子