分子生物学与分子生物学实验技术大纲

1、一、绪论1、分子生物学研究对象： 生物大分子的结构 （主要是遗传大分子和功能大分子） 、生物大分 子在遗传信息和细胞信息传递中的作用2、分子生物学检验技术的分析对象： 病原生物基因、基因变异、基因多态性第一节 真核基因与基因组一、真核基因的基本结构1、真核基因结构不连续，为断裂基因2、外显子： 在基因序列中，出现在成熟 mRNA分子上的序列3、内含子： 外显子之间，与 mRNA剪接过程中被删除部分相对应的间隔序列。二、基因编码区编码多肽链和特定的 RNA分子1、DNA碱基序列决定特定的成熟 RNA分子的序列三、调控序列参与真核基因表达调控1、基因的调控区（ 顺式作用元件 ）：位于基因转录区前后

2、，对基因表达其调控作用的区域， 因其是紧邻的 DNA序列，又称 旁侧序列 。第二节 真核基因组的结构与功能基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体遗传物质的总和。一、真核基因组具有独特的结构二、真核基因组中存在大量重复序列高度重复序列、中度重复序列、低重复序列或单拷贝序列三、真核基因组中存在大量的多基因家族与假基因1、多基因家族： 指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组在结构上相似、功能相关 的基因2、超家族基因： DNA 序列相似，但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族 总称3、假基因： 基因组中存在一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列，以 来表示四、线粒体 DNA结构有

3、别于染色体 DNA五、人类基因组有两万多个基因1、基因组大小用 C值表示， C值大小基本上反映生物进化程度的差异。2、C值佯谬：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象六、人的基因在染色体上的分布特征非均匀分布，存在物基因的沙漠区二、DNA复制复制： 遗传信息从亲代 DNA传递到子代 DNA上复制的三大特征： DNA复制从固定的起始位点开始、绝大多数DNA复制的双向的、半保留半不连续复制第一节 复制的基本规律一、半保留复制是 DNA复制的基本特征1、半保留复制：子代 DNA双链中的一条链来自母链，另一条链重新合成2、半保留复制意义：遗传稳定性的分子机制二、DNA复制从起始点向两个方向

4、延伸形成双向复制1、原核生物复制时， DNA从起始点向两个方向解链， 形成两个延伸方向相反的复制叉， 称双 向复制2、真核生物染色体上有多个起始点，是多复制子的复制复制子： 习惯把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子，是独立完成复制的功能单位三、DNA一子链复制的方向与解链方向相反，导致半不连续复制1、领头链：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的2、随从链：复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，复制是不连续的3、冈崎片段：随从链复制中的不连续片段4、半不连续性：领头链连续复制而随从链不连续复制第二节 复制的酶学与拓扑学变化一、核甘酸与核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反

5、应二、DNA聚合酶催化核苷酸之间的聚合1、DNA聚合酶活性： 53 的聚合活性、核酸外切酶活性（ 5 3 外切酶活性：切除引物，切除突变片段； 3 5外切酶活性：能辨认错配的碱基对，并将其水解）2、DNA聚合酶：原核生物： DNApol、 、 ；真核生物： DNA-pol 、 、 、 、 3、DNA-pol ：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补4、DNA-pol ：发生突变，依然能存活，参与DNA损伤的应急状态修复5、DNA-pol ：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据四、复制中的分子解链伴有 DNA分子拓扑

6、学变化1、解螺旋酶：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链2、拓扑异构酶：既能水解又能连接磷酸二酯键；Topo：不需 ATP，切割双链 DNA中的一链，使 DNA松弛后 , 连接切口 Topo：切割 DNA双链，此时不需 ATP；尔后由 ATP供能，使 DNA分子成负超 螺旋再连接切口3、单链 DNA结合蛋白：防止单链 DNA重新形成双链，防止单链 DNA被核酸酶水解4、引物酶：催化 RNA引物合成的酶5、引发体： 包括解螺旋酶 、 DnaC、引物酶及 DNA复制的起始区域五、DNA连接酶连接 DNA双链中的单链缺口1、DNA连接酶：催化 DNA双链的 3'羟基和相邻的 5'磷酸

7、基团形成磷酸二酯键，从而把两 段相邻的 DNA链连成完整的链第三节 原核生物的 DNA生物合成、复制起始： DNA解链形成引发体1、DNA解链成单链 由特定蛋白质识别复制起始位点， 在解螺旋酶、 TOPO酶及单链 DNA结合蛋白的共同作用下， DNA解链，解旋，形成复制叉2、引发体的生成 解螺旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体3. RNA 引物的合成二、复制延长：领头链连续复制，随从链不连续复制 引物合成后， 由 DNA pol （在真核细胞为 DNA聚合酶 和 ）催化，按碱基配对原则， 将 dNTP 逐一添加到引物 3 末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长三、复制终止：切除引物、填补空

8、缺、连接切口1. 原核生物 DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点。2. 领头链上的 RNA引物被 RNA酶水解后，由 DNA pol I 催化，由新合成链提供 -OH补齐。3. 冈崎片段引物的消除和连接第五节 逆转录和其他复制方式一、逆转录病毒的基因组是 RNA，其复制方式是逆转录逆转录： 以 RNA为模板， dNTP为原料，按碱基配对规律合成 DNA的过程，由逆转录酶催化 逆转录酶： 逆转录活性：即以 RNA为模板合成 DNA；RNase 活性：水解 RNA:DNA中的 RNA；DNA pol 活性：以 DNA为模板合成 DNA三、DNA损伤与修复DNA损伤： DNA分子一级结构的改

9、变一、突变在生物界普遍存在DNA多态性：个体间 DNA序列的差异二、多种化学或物理因素可诱发突变三、突变的分子改变类型（一）错配可导致编码氨基酸的改变（二）缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变 框移突变：三联体密码的阅读方式改变，是最严重的突变（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病四、DNA损伤的修复有多种类型（一）直接修复光修复、 切除修复 、重组修复、 SOS修复1、切除修复： 切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤 而暂停转录的 RNA聚合酶，即参与 转录偶联修复2、转录偶联修复意义： 将修复酶集中于正在转录的 DNA，使该区域的损伤尽快得以

10、修复3、SOS修复： 特点：抑制细胞分裂，允许大量快速的切除修复和重组修复，允许损伤的DNA作为模板进行复制，对碱基选择性低等后果：细胞能继续生存，但引起 DNA较长期的广泛的突变。四、转录转录： 以 DNA为模板合成 RNA的过程，遗传信息从 DNA向 RNA传递的过程第一节 RNA合成的模板和酶一、转录模板1、结构基因： DNA的一些区段可以转录出 RNA，另一些不能转录出 RNA。指能转录出 RNA的 DNA区段2. 不对称转录： 在 DNA分子双链上，一股链用作模板转录，另一股链不转录二、RNA聚合酶（一）原核生物的 RNA聚合酶： 由 2 共五种亚基组成的六聚体蛋白质。（全酶、核心酶

11、）：控制转录的速率 能与启动子结合 ：催化功能（ 被利福平抑制 ） ：结合 DNA模板 解链功能：辨认转录起始点：功能尚不清楚（二）真核生物的 RNA聚合酶RNA-pol 、 、 、转录产物、对鹅膏蕈碱的敏感性45S是 5.8S 、 18S和 28S rRNA的前体hnRNA是 mRNA的前体三、酶与模板的辨认结合操纵子（调控序列、结构基因） ： 原核生物的转录单位 辨认结合区、转录起始区第二节 RNA合成的过程一、原核生物的转录过程（一）起始转录起始不需引物： 因子辨认 -35 区（结合松弛） RNAp ol 全酶移向 -10 区（结合紧 密）合成第一个磷酸二酯键（转录起始复合物） 因子脱落

12、（二）延长1、因子脱落， RNA-pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移。2、在核心酶作用下， NTP不断聚合， RNA链不断延长 （NMP） n + NTP（NMP） n+1 + PPi）3、转录空泡： 也称转录复合物，是 RNA聚合酶的核心酶 、DNA模板和转录产物 RNA结合在 一起的复合物（ RNA-pol （ 核心酶 ）-DNA-RNA）4、转录特点： 同一 DNA模板上有多个转录同时进行；转录尚未完成，翻译已在进行（三）终止1、依赖 因子的转录终止 因子：识别结合富含 C的 RNA链； ATPase活性；解螺旋酶活性2、不依赖 因子的转录终止RNA转录后，形成

13、特殊的结构，以终止转录（1）RNA单链内部接近终止区域有富含G-C 配对区，形成稳定的二级结构茎环或发夹结构（2）在发夹结构的下游有 poly U 结构，能够加速转录复合物的解体二、真核生物的转录过程（一）起始1、转录起始前的上游区段顺式作用元件： 与基因表达调控有关的 DNA非编码序列。不同物种、不同细胞、 不同的基因， 可以有不同的上游 DNA序列，可统称为顺式作用元件转录起始点上游多数有共同的 5-TATA序列，称为 Hogness 盒或 TATA盒2、转录因子反式作用因子： 能直接或间接辨认、 结合顺式作用元件或 RNA聚合酶， 从而调节基因表达的 一类蛋白质因子转录因子： 反式作用因

14、子中，直接或间接结合 RNA聚合酶的蛋白质因子3、拼板理论： 转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因（二）延长真核生物转录延长过程与原核生物大致相似；无转录与翻译同步的现象； RNA-pol 前移处处 都遇上核小体；转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象（三）终止第三节 RNA转录后的加工一、真核生物新生 mRNA的剪接和修饰（一）首、尾的修饰5 端形成 帽子结构， 3 端加上多聚腺苷酸尾巴（二）真核生物 mRNA的剪接 hnRNA：杂化核 RNA，核内未被剪接的有内含子的 mRNA前体 snRNA、断裂基因、外显子和内含

15、子（三）mRNA的编辑转录后的 RNA在编码区发生碱基的加入， 删除或转换等现象， 使翻译生成的蛋白质的氨基酸 组成，不同于基因序列中的编码信息性质复制转录相同点以 DNA为模板 遵循碱基配对原则 都需依赖 DNA的聚合酶 聚合过程都是生成磷酸二酯键 新链合成方向为 5 3不同点模板两股链均复制模板链转录合成方式半保留复制不对称转录原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶碱基配对A-T，G-CA-U，T-A，G-C产物半保留的双链 DNA单链 RNA五、翻译翻译： 将核酸中由 4 种核苷酸序列编码的遗传信息，通过遗传密码破译的方式解读为蛋白 质一级结构中 20 种氨基酸的排列顺序第一节

16、 蛋白质合成体系1、三种 RNA： mRN、A rRNA、 tRNA2、合成原料： 20 种有遗传密码的氨基酸3、能源： ATP：主要参与氨基酸的活化； GTP：提供翻译起始、延长、终止阶段所需能量4、参与的蛋白质因子、酶及酶的辅助因子一、mRNA是蛋白质合成的模板1、mRNA是遗传信息的携带者： 顺反子、多顺反子、单顺反子2、mRNA上存在遗传密码： 三联体密码、起始密码： AUG、终止密码： UAAUAGUG、A 开放阅 读框架3、遗传密码的特点： 方向性： 5 端 3 端、连续性、简并性、摆动性、通用性二、核蛋白体是蛋白质合成的场所1、核蛋白体： 又称核糖体，是由 rRNA 和多种蛋白质

17、结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒， 是蛋白质生物合成的场所三、tRNA是蛋白质合成的搬运工具1、tRNA：搬运氨基酸、活化氨基酸、在密码子与对应氨基酸之间起适配器的作用2、氨基酸的活化：氨基酰 -tRNA 合成酶3、原核生物起始密码子只辨认甲酰化的甲硫氨酸，真核细胞起始密码子编码的 met 不须甲酰化第二节 蛋白质合成过程一、翻译的起始参与原核和真核生物翻译起始因子及其生物学功能： 略（一）原核生物1、起始： mRNA和起始氨基酰 -tRNA 分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物（1）核蛋白体大小亚基分离 （ 2）mRNA在小亚基定位结合 （3）起始氨基酰 -tRNA 的结合（4） 核蛋白体

18、大亚基结合2、 原核生物 mRNA在核蛋白体小亚基上的准确定位和结合涉及两种机制：（1）S-D 序列：在各种 mRNA起始 AUG上游约 813 核苷酸部位，存在一段由 49 个核苷 酸组成的一致序列（2）mRNA序列上紧接 S-D 序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白 rpS-1 识别并 结合（二）真核生物（1）核蛋白体大小亚基分离 （ 2）起始氨基酰 -tRNA 的结合（ 3）mRNA在小亚基定位结合 （4） 核蛋白体大亚基结合二、肽链合成延长1、延长： 根据 mRNA密码序列的指导， 次序添加氨基酸从 N端向 C端延伸肽链， 直到合成终 止的过程2、核蛋白体循环： 肽链延长在核蛋

19、白体上连续性循环式进行，每次循环增加一个氨基酸 延长因子：延伸过程所需蛋白因子（ EF）3、位点请看课件：（1）进位 （注册）：指根据 mRNA下一组遗传密码指导， 使相应氨基酰 -tRNA 进入核蛋白体 A 位。（2）成肽： 在转肽酶 （transpeptidase ，一种核酶 ） 的作用下，将 P 位点的肽酰基转移到 A 位点的氨基酰 -tRNA 上，在 A 位形成肽键，使肽链延长（3）转位： 使起始二肽酰 -tRNA-mRNA相对位移进入核蛋白体 P 位，而卸载的 tRNA则移入 E位。三、翻译的终止1、当 mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA 中释出， mRN

20、、A 核蛋白体等分离2、当 mRNA上的终止密码子处在 A位时，释放因子 （RF） 识别这种信号 , 进入终止阶段 释放因子（ RF）3、蛋白质合成能量消耗情况： 1. 氨基酸活化： 2个 ATP；2. 翻译起始： 原核生物 1个 GTP， 真核生物 1个 GTP， 1 个 ATP；3. 翻译延长：每形成一个肽键需 2个 GTP；4. 翻译终止： 1 个 GTP六、基因表达调控第一节 概述一、基因表达与调控的概念1、基因组： 一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因2、基因表达： 基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程二、基因表达的时间性及空间性1、基因表达的时间性：

21、 生物体的不同发育阶段，细胞的生长、增殖、分化、衰老及死亡等 2、基因表达的空间性： 不同的组织细胞发挥不同的生理功能三、基因表达的方式1. 组成性表达； 2. 诱导和阻遏表达； 3、协调表达四、基因表达调控的生物学意义适应内外环境的变化，维持个体生长，发育，增殖，分化第二节 基因表达调控的基本原理 、基因表达调控的多层次和复杂性 、基因转录激活调节基本要素第三节 原核生物基因表达的调控、原核基因转录调节特点 主要环节在转录起始一） 因子决定 RNA聚合酶识别特异性二）操纵子模型的普遍性三）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性二、操纵子 （operon） 的结构与功能乳糖操控子：负调控方式、正调控方式、

22、协调调节第四节 真核生物基因表达的调控一、真核基因组结构特点1. 真核基因组结构庞大， C值矛盾； 2. 单顺反子； 3. 重复序列； 4. 基因不连续性二、真核生物基因表达调控的特点原核与真核基因表达调控特点比较原核基因真核基因一种 RNA-pol ， 决定识别特异性三种 RNA-pol操纵子模型的普遍性活性染色体结构发生变化阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性正性调节占主导转录与翻译相偶连转录与翻译分割进行转录后修饰加工简单转录后修饰加工复杂七、重组 DNA技术DNA重组： 不同来源的 DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程重组 DNA：在体外用限制性内切酶，将不同来源的DN

23、A分子进行特异地切割，获得的目的基因或 DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA分子第一节 工具酶工具酶： 在体外对 DAN分子进行切割、重新连接、修饰及合成等过程所需的酶类一、限制性内切酶定义：一类核酸水解酶， 能识别和切割双链 DNA分子中的特定核苷酸序列 , 识别序列一般具 双重对称性 （ 回文结构 ）（一）命名（二）分类（三）功能有严格的识别、切割顺序，以内切方式 水解双链 DNA中的磷酸二酯键，产生的 DNA 片段 5 端为 P， 3端为 OH；识别顺序一般为 48 个碱基，通常 限制性内切酶 13 识别顺序一般为 48 个碱基，通常 为回文结构，即具有 180°反

24、向重复1、产生 5 突出粘性末端2、产生 3 突出粘性末端3、产生平头末端同尾酶： 识别序列不完全相同，但切割 DNA后， 产生相同的黏性末端；这两个相同的黏性末 端称为 配伍末端同裂酶： 又称异源同工酶，来源不同但能识别相同序列（切割位点可相同或不同）的酶二、DNA连接酶功能：1、催化双链 DNA一端的 3-OH与另一双链 DNA5端的磷酸基团形成 3,5 磷酸二 酯键， 使具有粘末端或平端的 DNA末 19 酯键，使具有粘末端或平端的 DNA末 端连接起来2、修复双链 DNA分子中单链切口三、DNA聚合酶催化以 DNA为模板合成 DNA的反应，在 DNA 重组技术中主要用于 DNA的体外合

25、成 合成反应需要 4 种脱氧核苷酸和镁离子（一）大肠杆菌 DNA聚合酶 I5 3 的聚合活性、 5 3 外切酶活性、 3 5外切酶活性（二）Taq DNA 聚合酶耐热， 在 7075时具有最佳的生物活性，无3 5 外切酶活性（三）逆转录酶无 3 5 外切酶活性（四）末端转移酶 二价阳离子存在下，催化 dNTP加到 DNA分子 3 -OH, 以带 3突出的 DNA为最佳受体第二节 DNA重组载体载体： 携带靶 DNA（目的 DNA）片段进入宿主 细胞进行扩增和表达的运载工具一、基因工程载体的种类和用途（一）克隆载体质粒载体、 噬菌体、 M13噬菌体、粘粒、酵母质粒、病毒（二）表达载体 指导目的基

26、因在宿主体内的转录与翻译1、原核表达载体2、真核表达载体第三节 DNA重组与鉴定分 （1） 分离目的基因切 （2） 限制酶切割目的基因与载体接 （3） 将目的基因与载体连接成重组载体转 （4） 将重组载体转入受体细胞筛 （5） 筛选出含重组 DNA的细胞等一、目的基因的制备（一）化学合成法 适用于已知目的基因的核苷酸序列，此法适用于合成分子量较小的目的基因（二）构建基因组文库存在于转化细胞内由克隆 载体所携带的所有基因组 DNA的集合（三）构建 cDNA文库用细胞总 mRNA制备全套双链 cDNA后，建立的基因文库（四）PCR扩增法二、载体的选择与构建1. 具有自主复制能力，能使重组 DNA在

27、受体细胞内进行复制；2. 具有多克隆酶切位点；3. 具有易检测的遗传标记，便于筛选；4. 分子量要小，在受体细胞内多拷贝，便于提取和纯化；5. 对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子、 前导序列、加尾信号、增强子等 DNA 调控元件 。三、目的 DNA片段与载体的连接（一）粘性末端链接1、同一限制酶切位点连接2、不同限制酶切位点连接（二）平末端连接（三）人工接头连接（四）同聚物加尾连接四、重组 DNA分子转入宿主细胞 将体外构建的重组 DNA分子导入用于复制、扩增和表达的原核或真核受体细胞。 宿主细胞应具备的特征： 处于感受态 对载体无严格限制 限制酶和重组酶缺陷 不对外源 DNA进行

28、修饰 能表达重组体所提供表型特征 转化、转染、感染五、重组子的筛选与鉴定（一）根据载体的遗传标志进行筛选1、根据载体的抗药性标志筛选仅作为初步筛选 2、根据载体的抗药性标志插入失活选择3、 -互补筛选 - 蓝/ 白筛选（ -半乳糖苷酶基因来源）（二）序列特异性筛选1. 重组 DNA的快速裂解与鉴定2. 限制性内切酶图谱进行分析3. 核酸分子杂交方法进行鉴定4. PCR 扩增方法进行鉴定5. DNA 测序六、重组载体的表达第四节重组 DNA技术的应用一、基因诊断二、基因治疗三、基因工程药物、疫苗和抗体四、基因敲除和转基因技术八、临床分子生物学检验标志物第一节分子生物标志物及其相关概念生物标志物：

29、可测定并定量的生物学参数 （如特定的酶浓度或激素水平、 特定基因型的群体 分布和生物物质的存在等） ，可以作为健康和生物标志物生理状态的评估指标。分子生物标志物： 是生物标志物的一种类型，是指可以反映机体生理、病理状态的核酸、 蛋 白质（多肽） 、代谢产物等生物分子一、分子生物标志物相关概念广义 :可遗传的并可检测的核酸序列或蛋白质狭义： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组 DNA间的差异（一）DNA生物标志物 DNA是最主要的分子生物标志物，癌基因、抑癌基因和错配修复基因的突变均可作为DNA生物标志物（二）RNA生物标志物 mRNA、异常剪接转录本、 m

30、icroRNA、长链非编码 RNA（三）蛋白质生物标志物第二节 核酸分子生物标志物一、基因组和基因组特征二、基于基因突变的分子生物标志物 基因突变： 具有遗传效应的 DNA分子上特定的核苷酸序列发生改变， 导致遗传效应发生相应 变化（一）点突变：指单个碱基的改变，又称碱基转换1、错义突变： 指点突变改变了三联体密码子，导致基因产物中某个氨基酸被另一个氨基酸 所取代2、无义突变： 指 DNA序列的改变使得编码某一氨基酸的密码子突变终止密码子，导致翻译 过程提前终止3、RNA加工突变： 外显子 - 内含子结合点或内含子 - 外显子结合点、内含子中的点突变（二）插入或缺失突变1、移码突变： 如果在编

31、码序列中插入 / 缺失 1 个或几个（非 3 整倍数）的碱基，改变了突变 点后的编码序列，称移码突变（三）动态突变 短串联重复序列随世代交替的传递逐代递增，重复次数增加三、基于基因多态性的分子生物标志物多态性、突变分子标记的类型： 基于杂交的分子标记、如 RFLP，基于 PCR的 分子标记，基于 DNA序列和 芯片的分子标记，如 SNP（一）限制性片段长度多态性 （RFLP） 第一代 DNA分子标记限制性片段长度多态性： 使用某种限制性内切酶酶切不同个体的DNA分子后， 个体之间酶切片段长度的差异性 特点： 不受环境条件和发育阶段的影响；是共显性的；需要对探针进行标记，需要进行 Souther

32、n Blot ，耗时费力； DNA需要量大。（二）小卫星和微卫星多态性第二代 DNA分子标记小卫星： 由 10100bp 组成的重复单位 重复几十到几百甚至几千次串联重复而成， 又称可变 数目串联重复微卫星： 广泛分布于真核生物基因组中 16bp 的串状简单重复序列，也称为短串联重复或 简单重复粗劣；不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性 小卫星 DNA特点： 微卫星 DNA特点：（三）单核苷酸多态性（ SNP） 单核苷酸多态性： 指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性特点： 密度高，最常见，具代表性，遗传稳定性高于微卫星 DNA（四）拷贝数多态性（ CNP）指

33、基因组中较大的 DNA片段（200bp 2Mb） 发生了拷贝数度的变化， 可能涉及一个基因或连 续几个基因四、基于 DNA甲基化的分子生物标志物DNA甲基化： 是指生物体在 DNA甲基转移酶的催化下， 以 S- 腺苷甲硫氨酸为甲基供体， 将甲 基转移到特定的碱基上的过程五、基于转录产物的分子生物标志物（一）mRNA标志物（二）miRNA标志物（三）长链非编码 RNA标志物六、基于线粒体 DNA的分子标志物七、基于循环核酸的分子标志物第三节 分子生物标志物的发现与评价、高通量技术与分子生物标志物的发现一）基因组学二）转录组学三）蛋白质组学四）代谢组学、分子生物标志物的特征和评估一）分子生物标志物

34、的特征二）分子生物标志物评估的基本统计学方法三）生物标志物的评价阶段、分子标志物的未来发展九、临床标本和分离纯化技术第一节 临床标本的处理标本都可能会造成假阴性结果尿液、粪便、痰液、生殖道标本一、临床标本处理的一般原则 （一）标本采集的时间和注意事项 在疾病发展过程中，过早或过晚采集（二）标本的类型和数量 常用标本类型：血液、骨髓、咽试子、 数量：考虑敏感性和特异性（三）标本采集部位的准备 去掉污染的微生物或其它杂物（否则“假阳性”） ；过度清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微 生物（假阴性）（四）标本的运送（五）标本的保存（六）标本处理中的生物安全问题二、常见临床标本的处理方法第二节 生物样本分离

35、纯化与质量鉴定一、生物样本分离纯化策略（一）核酸1、材料与方法选择总原则 保证核酸一级结构的完整性；尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度2、保证核酸完整性的措施 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间；尽量避免各种有害因素对核酸的破坏3、核酸分离纯化的主要步骤（1）制备细胞及破碎细胞； （ 2）消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子；（ 3）去除其他不需要的核酸分子； （4）沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 （二）蛋白质1、蛋白质本身的理化特征2、分离纯化某种蛋白质的主要步骤（1）前处理：将组织或细胞中的蛋白质以溶解状态释放出来；（ 2）粗分离：将目的蛋白质与其他杂蛋白

36、分离； （ 3）细分离：对蛋白样品进一步纯化，以获得高纯度的目的蛋白质；二、DNA的分离纯化（一）基因组 DNA的分离与纯化1、酚抽提法（经典方法） 裂解缓冲液中各成分的作用（1）EDTA： 二价金属离子螯合剂，可抑制 DNA酶活性，并降低细胞膜的稳定性；（2）SDS： 阴离子去污剂，可降解细胞膜、乳化脂质和蛋白质，使它们沉淀，同时抑制DNA酶（3）无 DNA酶的 RNA酶： 可有效水解 RNA而避免 DNA 的消化（4）蛋白酶 K：水解蛋白质，可消化 DNA酶和细胞 中的蛋白质（5）酚： 可使蛋白变性沉淀、抑制 DNA酶活性（6）pH8.0 的 Tris 溶液： 能保证抽提后 DNA进入水

37、相，而避免滞留于蛋白质层2、吸附柱法提取 DNA（1）利用裂解液促使细胞破碎，使细胞内核酸释放出来；（ 2）释放的核酸特异性的吸附在特定的硅载体上； （ 3）将吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸；（三）质粒 DNA的分离纯化 开环 DNA、线状 DNA、质粒 原理：当提取的质粒 DNA电泳时， 同一质粒 DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分 子的泳动速度快质粒 DNA的提取方法1、碱裂解法 （ 简单、重复性好且成本低，使用最广泛）原理： pH12.6 高碱性条件下，染色体 DNA和质粒 DNA都变性，但质粒 DNA超螺旋共价闭合 环状结构的两条互补链不会完全分离。当以

38、pH4.8 的 KAc 高盐缓冲液调节其 pH至中性时，变性的质粒 DNA又恢复到原来构型，保 存在溶液中。染色体 DNA不能复性而形成缠连的网状结构。 通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子 RNA、 蛋白质 -SDS复合物等一起沉淀下来而被除去试剂：溶液 I ：（1）葡萄糖： 增加溶液的粘度 , 维持渗透压 , 防止 DNA受机械剪切力而降解；（2）EDTA：螯合 Mg2+,Ca2+ , 抑制 DNase;有利于溶菌酶作用 （低离子环境 ） ；（ 3）溶菌酶： 溶菌 , 但 pH<8.0 该酶受抑制溶液 II ：（ 1） NaOH：核酸在 pH5 9稳定,但在 pH>12或&

39、lt;3则变性，溶液 II 中 pH为 12.6， 可使染色体和质粒 DNA变性；（ 2）SDS：离子型表面活性剂； 溶解细胞壁上的脂质与蛋白 , 破 坏细胞壁，解聚细胞中的核蛋白，与蛋白质结合成复合物 , 使蛋白变性沉淀，抑制 RNase,下 一步需除去，溶液 III ：KAc-HAc缓冲液（pH4.8） ： 把pH12.6 的抽提液调回 pH至中性,使变性的质粒 DNA 复性,并稳定存在 , 而高盐的 KAc有利于变性的染色体 DNA、高分子量 RNA、和 K+-SDS-蛋白 质- 细胞壁复合物凝聚而沉淀（四）线粒体 DNA的分离纯化（五）血浆中游离 DNA的分离纯化三、RNA的分离纯化在

40、 RNA的制备过程中，排除 RNase 的污染是 RNA制备成功与否的关键因素（一）总 RNA的分离与纯化1、（异）硫氰酸胍-酚氯仿法是总 RNA提取法中最常使用、经典的一步法。2、Trizol 试剂 是苯酚和异硫氰酸胍混合的溶液3、原理： 内含异硫氰酸胍等物质，能在迅速裂解细胞或组织的同时灭活细胞释放出的核酸酶，保持 RNA的完整性。再经氯仿、异丙醇抽提后可得到总 RNA溶液4、同时制备 RNA、 DNA与蛋白质的 一步法（二）mRNA的分离与纯化（三）循环 miRNA的分离与纯化（四）长链非编码 RNA的制备四、自动化核酸提取系统硅胶膜吸附法、硅胶磁珠法五、蛋白质的分离纯化（一）蛋白质的性

41、质与纯化原则 （二）从细胞或组织中提取蛋白质的常用方法1、蛋白分子量大小 透析、超滤、凝胶过滤层析2、蛋白分子溶解度、盐溶、盐析、等电点沉淀、有机溶剂法3、蛋白表面电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）、离子交换层析（ IEC）4、配体的特异性亲和力三）膜蛋白的分离与纯化六、核酸和蛋白的鉴定（一）核酸的鉴定1、核酸含量测定在波长 260 nm紫外线下：1 OD=50 g/ml 的双链 DNA、1OD=40 g/ml 的单链 DNA或单链 RNA、 1OD= 20 g/ml 的单链寡聚核苷酸2、核酸的纯度鉴定通过测定在 260nm 和 280nm的紫外线的吸收值，然后计算比值（A260/A280）

42、 来估计核酸的纯度（1）DNA A260/A280 比值约为 1.8 ；高于 1.8 ，说明含有 RNA（2）RNA A260/A280 比值约为 2.0（3）DNA 和 RNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值下降（4）比值为 1.8 的 DNA溶液不一定为纯的 DNA溶液3、核酸的完整性鉴定 凝胶电泳法、荧光光度法（二）蛋白质的鉴定十、核酸杂交技术是定性或定量检测 DNA或 RNA序列片段的有力工具第一节 核酸分子杂交的概念1、核酸分子杂交： 单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成 双链杂交体的过程2、核酸分子杂交技术： 利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术3、分子杂交

43、原理： 具有一定同源序列的两条核酸单链（ DNA或 RNA），在一定条件下按碱基 互补配对原则经过退火，形成异质双链的过程4、核酸杂交技术的理论基础： DNA变性复性现象一、核酸探针 指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能被标记且被特异性检测的核酸分子 （一）常用探针的种类1、 DNA探针最常用的核酸探针基因组 DNA探针、 cDNA探针、三大优点2、RNA探针优点： 杂交效率高， 杂交稳定性高， 非特异性杂交较少， 未杂交探针可用 RNase 降解， 减少 本底的干扰缺点： 易降解，标记方法复杂3、寡核苷酸探针优势： 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，

44、需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针杂交的特异性（二）探针的长度DNA探针 通常为 400500 个碱基、 RNA探针 的长度实际上取决于将重组 DNA分子线性化的 限制性内切酶的酶切位点、 寡核苷酸探针 一般由 17 50 个核苷酸组成，探针的最小长度取 决于靶序列的复杂性（三）核酸探针的标记1、探针标记物的选择 放射性标记、非放射性标记、优缺点比较、均匀标记、 全程标记 、末端标记 理想标记物应： （1）不影响碱基对特异性； （2）检测方法高度特异、灵敏； （3）标记及检测 方法简单；（ 4）较高的化学稳定性； （ 5）环保，无损害； （ 6）价格低廉2、探针标记方法的选择全程标记：（1

45、）随机引物标记最常用的 DNA探针标记方法（2）DNA缺口平移标记（3）全程 RNA探针标记（4）化学法全程标记 末端标记：注：请将两者进行比较（1）5末端标记（2）3末端标记二、分子杂交信号检测（一）放射性标记探针检测1. 放射自显影2. 液体闪烁计数法（二）非放射性标记探针的杂交检测1. 酶促显色检测 （1）直接检测直接作用于显色的底物、直接作用于化学发光的底物（2）间接检测要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤2. 荧光检测3. 化学发光检测4. 多探针检测最大益处是可同时检测多个杂化分子第二节 经典的核酸分子杂交技术一、固相杂交 先将待测单链核酸样品结合到固相支持物 （常用有硝酸纤维

46、素滤膜、 尼龙膜、化学活化膜等） 上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交，放射自显影分析杂交结果（一）反向点杂交 将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰， 故能一次性筛查出多种不同的序列特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好（二） Southern 杂交（三）Northern 印迹杂交应用 DNA探针检测特异 RNA的另一种膜上印迹技术二、液相杂交液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中， 探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互 补配对形成杂交分子的过程三、原位杂交应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体， 然后应用 组织细胞化学或免疫组

47、织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术第三节 DNA芯片技术有序地、 高密度地一、DNA芯片的概念 是通过微阵列技术将大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作为探针， 排列固定于玻璃片或纤维膜等支持物上二、DNA芯片原理三 DNA芯片技术四、杂交与结果分析五、DNA芯片在医学中的应用第四节 影响杂交信号检测的因素一、探针的选择二、探针的标记方法三、探针的浓度四、杂交率五、杂交温度六、杂交的严谨性七、杂交反应时间八、杂交促进剂十一、 核酸体外扩增技术及定性检测技术多聚酶链式反应： PCR第一节 靶序列扩增指直接扩增靶核酸，使靶序列的拷贝数增加百万倍，以达到体外对靶序列进行检测的目的

48、一、PCR扩增技术（一） PCR的原理和反应过程1、变性退火延伸2、5 ' 端是人工合成的引物，是特定的， 3 ' 端没有固定的终止点3、特定的扩增产物在第 2 个循环中出现，以后快速扩增，成为主要扩增产物4、特点：高度的敏感性、高度的特异性、操作简便、快捷、适用样品的广泛性（二）PCR 反应系统及反应参数1、反应系统（1）模板；（2）引物；（3）Taq DNA聚合酶：特性；（4）dNTP；（5）Mg+: Mg2+浓度过低使酶活力降低， Mg 2+浓度过高会导致非特异性扩增；（6）PCR反应缓冲液2、扩增参数（1）PCR反应温度（2）PCR反应时间（3）PCR反应循环次数二、其

49、他 PCR技术三、PCR产物分析（一）RFLP（二） PCR-ASO（三）单链构象多态性（四）DGGE（五）熔点曲线分析（六）DNA测序第二节 探针序列扩增指靶 DNA的数量不变，通过扩增特异结合到靶序列上的探针序列达到检测靶序列的技术、连接酶链反应（ LCR）第三节 信号扩增一、分支 DNA二、杂交捕获法酶标抗体 DNA-RNA杂交体固化抗体的三明治样结构十二、核酸实时定量检测技术定义： 指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应进程，最后通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术优点：与普通 PCR的区别：第一节 荧光定量 PCR的基本原理一、实时荧光

50、定量 PCR中常用的概念1、扩增曲线一条以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所做的曲线2、荧光阈值在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上3、循环数（ Ct 值） PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的循环次数4、扩增效率（ E） PCR反应一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值在0 1之间二、PCR扩增的理论模式PCR中，随着扩增反应循环次数的增加，模板以指数的方式进行扩增。PCR扩增一定的周期后，扩增产物的总数量可以用以下公式来表示Yn=X· （1+E） nYn：PCR产物的量； X：原始模板的数量； E：扩增效率；

51、 n：扩增反应的循环次数初始模板的对数值与 PCR的循环数呈线性关系 ，因此，可根据扩增达到阈值的循环数就可 以计算出样品中所含靶基因的量三、实时荧光定量 PCR中的荧光化学物质荧光共振能量转移（一）荧光染料技术1、原理常用的荧光染料为 SYBR Green。其特点为： （1）非特异地结合双链 DNA小沟；（2）与双 链 DNA结合后受激产生荧光； （ 3）在变性条件下双链分开，荧光消失。2、技术特点（4）SYBR Green 染料能与任何双链 DNA结合，因此，它也会结合到非特异性扩增产生 的双链分子或引物二聚体中，本底高，使实验产生假阳性信号（二）荧光探针技术1、水解探针技术原理：（1）探

52、针的 5'端标记报告基团 R，探针的 3'端标记淬灭基团 Q；（2）探针完整时， R 基团发射的荧光被 Q基团淬灭，导致没有荧光发射；（3）在扩增过程中， Taq DNA 聚合酶发挥 5' -3 '核酸外切酶活性，水解探针， R基团与 Q 基团随之分离， R 基团发射出荧光特点：2、双杂交探针技术原理：（1）第一条探针的 3'端标记供体荧光基团，第二条探针的5'端标记受体荧光基团；（2）在 PCR扩增过程中，两条探针与目的基因同时杂交时，供体荧光基团与受体荧光基团 相互靠近，供体荧光基团刺激附近的受体荧光基团，使后者发光而被检测系统接收 特点：3

53、、分子信标技术 原理：（1）结构由环状区和柄区组成， 5'末端标记荧光报告基团， 3'末端标记荧光淬灭基团 （2）当无目的序列存在时，分子信标的结构呈茎环结构，此时由于两端的基团相距非常接近，此时没有荧光信号。（3）当有目的序列存在时，分子信标与靶序列特异性结合，环状区单链与靶序列杂交而形 成稳定的、比柄区更长的双链，从而使荧光基团与淬灭基团分开，此时可检测到荧光 特点：第二节 实时荧光定量 PCR引物和探针的设计一、引物设计基本原则二、探针设计的基本原则1、探针要绝对的保守2、TaqMan探针的长度最好在 20 40bp 之间，确保探针的 Tm值要比引物的 Tm值高出 5 1

54、0，同时， Tm值在 65 72之间，此时， Taq 酶具有较强的外切酶活性3、探针的 5'端不能含有 G4、探针的 3'端必须进行封闭5、避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4 个或超过 4 个的 G 碱基；探针中的 G不能多于 C6、TaqMan探针应尽可能靠近上游引物，同时又没有重叠7、避免探针与引物之间形成二聚体8、第三节 实时荧光定量 PCR反应体系和条件的优化一、反应体系的优化模板的质量和浓度、引物和探针的浓度二、反应条件的优化退火温度、循环次数第四节 实时荧光定量 PCR测定的数据分析、绝对定量、相对定量第五节 临床基因扩增实验室的设置与人员资质要求一、实验

55、室的设置二、实验室各区的主要功能三、实验室工作基本原则四、实验室人员资质的要求十三、核酸序列分析第一节 第一代 DNA测序技术双脱氧链终止法、化学降解法，以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术缺点： 费时费力、 测序准确度不高、测序基于 PCR反应，需要引物并且有些结构复杂的难于 进行 PCR反应的片段不能测序一、双脱氧链终止法利用 DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定 DNA核苷酸顺序的方法DNA片段测定出核苷原理： 因 3' 端不具 OH基， DNA链合成至此中断，可根据不同长度的 酸序列二、测序反应体系（一） DNA模板单链 DNA模板、 双链 DNA 模板、 PCR 产物（二）测序引物（三）DNA聚合酶 大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段、测序酶、 Ta