产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究

1、产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 摘要：从采自秦岭的森林腐木菌苔上分离到一株产漆酶的裂褶菌（schizophyllum commune fr.） 菌株mys005，对其产漆酶培养方式、培养基组成及培养条件进行了优化试验。结果表明，裂褶菌菌株mys005的产漆酶适宜培养方式为液体浅层振荡培养，含有cu2+、mn2+、zn2+的微量元素复合液、洋葱（allium cepa l.）、麦（triticum aestivum l.）麸对其产漆酶都有较大的促进作用，而愈创木酚则对其生长和产漆酶有抑制作用。由新鲜马铃薯（solanum tuberosum l.） 200 g、k2hpo4 1.00

2、 g、nacl 0.50 g、mgso4 ·7h2o 0.50 g、nano3 2.50 g、cacl2·2h2o 0.10 g、fecl3 0.02 g、吐温-80 1.20 ml溶于1 000 ml去离子水中组成的培养基在添加微量元素复合液（50 mg/ml cucl2·2h2o+20 mg/ml mnso4·h2o+10 mg/ml znso4·7h2o）3 ml、洋葱100 g、麦麸10 g后，并且培养基起始ph 4.5、培养温度30 、培养摇床转速200 r/min、培养时间7 d，则摇瓶发酵的漆酶产酶量最高可达1 121 u/ml，

3、显示出了良好的工业开发潜力。 关键词：漆酶；裂褶菌（schizophyllum commune fr.）；筛选；产酶培养基；优化 中图分类号：q554+.9；s646.1+9；q93-33 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）12-2792-06 isolation of schizophyllum commune producing laccase and optimization of laccase production conditions zhao wen-juan，xu sheng-yun，ren ping （enzyme engineering institu

4、te of shaanxi sciences / shaanxi engineering center for enzyme technology， xian 710600， china） abstract： a schizophyllum commune fr. strain mys005 producing laccase was isolated from the rotten wood lawn in forest of qinlin. the culture method for laccase production， medium composition and cultivati

5、on conditions was optimized. results showed that the suitable cultivation method for s. commune strain mys005 to produce laccase was shallow liquid shaking culture. trace elements compound liquid containing cu2+， mn2+， zn2+， onion （allium cepa l.）， wheat （triticum aestivum l.） bran could promote lac

6、case production； while guaiacol could inhibit the growth and laccase production. if adding trace element compound solution（50 mg/ml cucl2·2h2o+20 mg/ml mnso4·h2o+ 10 mg/ml znso4·7h2o） 3 ml， onion 100 g， wheat bran 10 g，in the medium containing fresh potato （solanum tuberosum l.） 200 g

7、， k2hpo4 1.00 g， nacl 0.50 g， mgso4·7h2o 0.50 g， nano3 2.50 g， cacl2·2h2o 0.10 g、fecl3 0.02 g、tween-80 1.20 ml in 1 000 ml deionized water， and keeping the starting ph at 4.5， starting temperature at 30 ， culture shaker speed at 200 r/min， culturing for 7 d， the laccase enzyme production y

8、ield in shake flask fermentation could be up to a maximum of 1 121 u/ml， showing great potential for industrial development. key words： laccase； schizophyllum commune fr.； isolation； enzyme producing medium； optimization 漆酶（laccase，ec1.10.3.2）是一种含铜元素的多酚氧化酶，是重要的木质纤维（ligno cellulose）降解酶之一1。20世纪末，以担子菌亚

9、门（basidiomycotina）的白腐菌（white rot fungi）为代表的真菌产生的漆酶成为了国内外研究的热点，真菌分泌的漆酶主要具有催化木质素的降解、去除有毒化合物的毒性、促进真菌色素的合成等作用。基于此，真菌漆酶在造纸工业中的生物制浆和纸浆生物漂白、有毒造纸废水处理、酶法脱墨等方面表现出了相当的研究价值和应用潜力2-8。 裂褶菌（schizophyllum commune fr.）又称白参、树花，隶属于真菌门（eumycota）担子菌亚门层菌纲（hymenomycetes）伞菌目（agaricales）裂褶菌科（schizophyllaceae）裂褶菌属（schizophyll

10、um sp.），是一种珍贵的食、药两用真菌9。关于裂褶菌产漆酶的文献较少，李梦杰等10报道了一株产漆酶能力强且产酶速度快的裂褶菌菌株gghn08-104，其在固体发酵培养基里产漆酶活力达2 449.02 u/g；muhammad等11利用裂褶茵对纺织品染料进行脱色研究，发现裂褶菌菌株ibl-06的产漆酶活力达到了179 u/ml；黄彩霞等12报道了裂褶菌用于废新闻纸的脱墨研究试验，结果裂褶菌能分泌高活力的漆酶，并能对废新闻纸进行高效脱墨。已有试验13，14证明，对裂褶菌产漆酶情况及在造纸行业的开发应用进行深入研究很有必要。为了得到造纸工业用高活力漆酶，试验从自然界筛选到一株产漆酶的裂褶菌菌株，

11、并对其产酶培养方式、液体产酶培养基组成及培养条件进行了优化比较，为其在造纸工业和环境保护中的应用提供参考。 1 材料与方法 1.1 菌种采样 采样地点在秦岭骊山；主要采集腐木树皮上的白色菌苔、腐木屑及腐木根基处的腐殖土15。 1.2 试剂与仪器 培养基所用新鲜马铃薯（solanum tuberosum l.）、洋葱（allium cepa l.）和当年麦（triticum aestivum l.）麸均为市售，试剂均为分析纯或生化级试剂；测定漆酶活力的2， 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）铵盐2，2-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic

12、 acid），abts为美国sigma公司产品。仪器主要有du640型紫外/可见光分光光度计（美国贝克曼公司）、kyc-1102型恒温培养摇床（上海新苗医疗器械有限公司）、pys-dhs型恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。 1.3 培养基 1.3.1 真菌斜面保藏培养基（pda综合培养基） 由新鲜马铃薯（切碎）200 g、葡萄糖 20.0 g、kh2po4 3.0 g、mgso4·7h2o 1.5 g、维生素 b1 8 mg、琼脂 20.0 g溶于1 000 ml去离子水中组成，调培养基ph为6.016。 1.3.2 真菌初筛（纯化）培养基 愈创木酚pda（g-pda）培养基，pda

13、培养基灭菌后添加经无菌过滤器除菌的4 l/ml的愈创木酚-乙醇溶液4，使培养基中愈创木酚的终浓度为0.4 l /ml； -萘酚pda（n- pda）培养基，pda培养基灭菌后添加经无菌过滤器除菌的50 mmol/l的-萘酚-乙醇溶液，使培养基中-萘酚的终浓度为5 mmol/l。 1.3.3 复筛产酶摇瓶培养基（基础产酶培养基） 配方，在综合pda培养基组分中去掉琼脂成分；配方，由新鲜马铃薯（切碎）200 g、k2hpo4 1.00 g、nacl 0.50 g、mgso4 ·7h2o 0.50 g、nano3 2.50 g、cacl2 ·2h2o 0.10 g、 fecl3

14、0.02 g、吐温-80 1.20 ml溶于1 000 ml去离子水中组成，调培养基ph为6.0。 1.3.4发酵产酶培养基 配方，由配方1 000 ml+微量元素复合液（50 mg/ml cucl2·2h2o+20 mg/ml mnso4·h2o+10 mg/ml znso4·7h2o）3 ml组成；配方，由配方+新鲜洋葱（切碎）100 g/l组成；配方，由配方+新鲜洋葱（切碎）100 g/l+当年麦麸10 g/l组成 1.4 方法 1.4.1 产漆酶菌株初筛 称取15 g所采菌样（较大的腐木屑与菌苔剪碎），装入有玻璃珠与50 ml 去离子水的250 ml三角瓶

15、中，在摇床上浸泡振荡30 min以上，制成菌悬液。取0.2 ml菌悬液分别涂布在g-pda培养基、n-pda培养基上进行初筛，每个菌样分别涂58个平板，置于恒温培养箱中30 培养，每天观察菌落生长及变色圈产生情况。将在g-pda培养基上初筛后产生棕红色、浅红黄色变色圈的菌株以及在n-pda培养基上初筛后产生浅蓝紫色变色圈的菌株挑出，继续在相对应的g-pda培养基、n-pda培养基平板上进行划线接种，置于恒温培养箱中30 培养，每天观察菌落生长及变色圈的产生情况。如此反复直到分离到产生变色圈的单菌落，记录变色圈的颜色与深浅，测量菌丝圈直径（d1）及变色圈的直径（d2），由d2/d1比值大小初步判

16、断菌株产漆酶的能力。将初筛到的产漆酶菌株接入斜面保藏培养基中，以供复筛17。 1.4.2 产漆酶菌株复筛 初筛得到的斜面菌种用pda综合培养基平板活化，打成直径8 mm的菌饼，取不同数量的菌饼分别接种于配方、配方中，250 ml摇瓶装液50 ml，30、150 r/min培养7 d，发酵液过滤，得粗酶液用于测定漆酶活性。产酶活性高者即为复筛得到的目的菌株，用于下一步研究。 1.4.3 确定产漆酶培养方式 用配方和配方，分别选择静置与振荡、浅层（50 ml）与深层（100、150 ml）2组对比培养方式进行复筛菌株产漆酶发酵试验，测定发酵滤液的酶活，以确定合适的基础发酵培养基及发酵方式，每处理重

17、复3次。 1.4.4 产漆酶发酵培养基优化 向试验确定的基础产酶培养基（配方）中分别添加不同量的微量元素复合液以及洋葱、麸皮、愈创木酚进行摇瓶发酵，测定发酵滤液的酶活，对产漆酶培养基进行初步优化，每处理重复3次。 1.4.5 产酶培养条件确定 培养基选用配方，分别比较不同起始ph（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、培养时间（4、5、6、7、8 d）、培养温度（25、28、30、35 ）、接种量（直径8 mm的菌饼2、3、4、5片）、培养摇床转速（120、150、180、200 r/min）对产漆酶菌株漆酶产量的影响。500 ml三角瓶装液100 ml，培养温度、接种量、

18、培养摇床转速及起始ph和培养时间用优化后的数值，5个培养条件的处理都重复3次18。 1.4.6 漆酶活性测定方法（abts法） 酶液（发酵滤液）、缓冲液和底物abts都先在30 下预热；在3 ml反应体系中，先加入酶液0.1 ml，然后分别加入 ph 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液2.5 ml、1 mmol/l的 abts 0.4 ml，温度30 启动反应，每15 s在紫外/可见光分光光度计上测定一个反应体系在420 nm下的od值，求得反应前3 min内反应体系的od值变化用于计算酶活。要求酶反应体系的od值变化在前3 min内呈线性关系，否则需将酶液用缓冲液稀释到合适倍数。以每分钟转化1 mo

19、l/l abts（或生成1 mol /l abts自由基）的酶量为一个酶活单位19，20。计算公式： 漆酶活性=106/·b×od/t， 比酶活=漆酶活性/v。 式中，酶活的单位为mol/（l·min），比酶活单位为u/ml；为abts自由基的摩尔吸光系数，420=3.6×104 l/（mol·cm）；b为比色管厚度（cm）；v是反应体系中加入酶液的体积（ml）；od为在反应时间（t）内的吸光度增加值；t是反应时间（min）。试验中漆酶产量以比酶活表示。 1.4.7 产漆酶菌株的分子鉴定 将复筛得到的产漆酶活力高的菌株用pda综合培养基平板纯化

20、至少3次以上，进而得到纯度高的单菌落，将该菌落送样至生工生物工程（上海）股份有限公司进行真菌its分子鉴定。基因组dna提取采用生工sk1375真菌基因组dna抽提试剂盒，引物序列分别有its1： 5-tccgtaggtgaacctgcgg-3，20 bp；its4：5-tcctccgcttattgatatgc-3，19 bp。dna测序用pcr纯化产物27f和1 492 r实施完成；利用genbank中的blast软件搜索同源序列进行比对，对该菌株进行分子鉴定21。 2 结果与分析 2.1 产漆酶菌株初筛结果 将野外采集到的菌样经过适当稀释后，在g-pda和n-pda 2种初筛培养基平板上培

21、养，3 d后在g-pda平板上长出了深棕红色变色圈的菌落，将其在g-pda和n-pda平板上反复划线纯化分离，最终在g-pda平板上得到了产生明显深棕红色变色圈的单菌落，而在n- pda平板上这些菌株并不产生任何颜色的变色圈；将在g-pda平板上得到的菌株命名为mys005，其菌落形态为蓬松白色绵毛状，中央形成同心圆状的环纹区，菌丝浓密厚重，堆积高出培养基表面，不向培养基内部生长，培养基背面始终为白色；变色圈颜色为深棕红色，培养5 d的变色圈直径（d2）为18 mm，培养5 d的菌丝圈直径（d1）为11 mm，d2/d1比值为1.6。菌株mys005在g-pda培养基上的菌落形态特征与万力等2

22、2报道的结果基本一致，说明菌株mys005为裂褶菌的可能性比较大。 2.2 培养方式与基础发酵培养基的确定 综合pda培养基（复筛配方）适合所有真菌生长，而配方是在配方的基础上添加了一些常用的无机盐成分，添加吐温-80是为了利于酶的渗出，从而减少细胞内酶合成的抑制作用。王佳玲等23报道称，国内外学者在进行白腐菌漆酶的液体培养时，采用静置培养方式的次数比振荡培养方式的多，采用深层培养方式的次数比浅层培养方式的多，且前者比后者更有利于提高漆酶产量。因此试验分别对静置与振荡、浅层与深层培养方式进行了比较试验，振荡培养方式的条件是培养温度30 ，直径8 mm的菌饼在装液量为50 ml时接种1片、在10

23、0 ml时接种2片、在150 ml时接种3片，150 r/min培养7 d；静置培养方式的培养温度与接种量均与振荡培养方式条件一致，但培养过程中每隔2 d摇动三角瓶一次，结果见表1。从表1中可以看出，菌株mys005的液体发酵采用振荡培养方式的产漆酶量高于静置培养方式、浅层培养方式的产漆酶量高于深层培养方式，这说明菌株mys005的生长需要消耗大量的氧气，这一结果与李梦杰等10的研究结果相一致。另外，在采用振荡培养时，配方比配方的漆酶产量高，因此初步确定菌株mys005的培养以新鲜马铃薯（切碎）200 g、k2hpo4 1.00 g、nacl 0.50 g、mgso4·7h2o 0.

24、50 g、nano3 2.50 g、cacl2·2h2o 0.10 g、 fecl3 0.02 g、吐温-80 1.20 ml溶于1 000 ml去离子水中组成的配方（调培养基ph为6.0）为基础发酵培养基，采用浅层振荡培养方式（250 ml三角瓶装液量50 ml）。 2.3 发酵培养基的优化 2.3.1 微量元素对菌株mys005产漆酶的影响 前人研究指出，微量元素铁、锌、锰、钴、铜等往往是酶的活性基组成部分23，24，是酶的激活剂，对酶活的影响不容忽视。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，铜对漆酶有活化作用；另外对于某些白腐菌而言，在mn2+和cu2+存在的前提下能显著提高漆酶的酶活。因

25、此试验以配方为基础，通过往培养基中添加不同量的微量元素复合液（50 mg/ml cucl2·2h2o+20 mg/ml mnso4·h2o+10 mg/ml znso4·7h2o），比较了菌株mys005摇瓶发酵（250 ml三角瓶装液50 ml，直径8mm的菌饼1片，30 、150 r/min培养7 d）的产漆酶情况。结果见表2。由表2可见，添加微量元素cu2+、mn2+、zn2+能促进菌株mys005提高漆酶产量，随着微量元素复合液添加量的增加，产漆酶量也相应提高，当添加微量元素复合液3 ml时，产漆酶量比对照提高了298.39%，达到了247 u/ml。 2

26、.3.2 洋葱对菌株mys005产漆酶的影响 王佳玲等23报道称，在合成培养基中添加洋葱可以提高漆酶的产量；赵琪等25报道，木腐菌具有较强的分解木质素、纤维素的能力，其生长发育需要钾、镁、钙、磷等矿质营养元素的参与。洋葱每百克鲜品含钙40 mg、磷50 mg、铁1.8 mg、维生素c 8 mg，还含有胡萝卜素、维生素b1和尼克酸、前列腺素a、二烯丙基二硫化物及硫氨基酸等成分，营养非常全面，而且洋葱是一种价廉易得的蔬菜，若能提高漆酶产量，将对工业化生产漆酶降低成本、提高经济效益产生重大的影响。因此试验以配方为基础，通过往培养基中添加不同量的洋葱（切碎），比较了菌株mys005摇瓶发酵（250 m

27、l三角瓶装液50 ml，直径8mm的菌饼1片，30 、150 r/min培养7 d）的产漆酶情况。结果见表3。从表3中可以看出，洋葱的加入确实能提高菌株mys005产漆酶的能力，其中以添加量为100 g/l的产酶量达到最高，其摇瓶发酵液的比酶活比对照提高了260.61%，达到了238 u/ml，随后虽添加量增大而漆酶比酶活却基本保持平稳。因此确定洋葱的适宜添加量为100 g/l。 2.3.3 愈创木酚对菌株mys005产漆酶的影响 研究漆酶相关文献23指出，结构与木质素有关的低分子芳香化合物或木质素降解的碎片化合物可以作为漆酶的诱导剂来提高酶活，而愈创木酚是具有木质素特征苯环结构的木质素类似物

28、，对某些白腐菌漆酶的产生有一定的诱导促进作用，侯红漫等26在研究糙皮侧耳pleurotus ostreatus（jacq.ex fr.）quel.的漆酶产量时发现添加0.5 mmol/l的愈创木酚可使糙皮侧耳培养液的产酶量提高2.5倍。但是愈创木酚具有毒性，浓度高时会对菌体的生长产生明显的抑制作用，因此愈创木酚的添加量和添加时间对漆酶产量的提升与否将是很关键的因素。试验以配方为基础，培养条件为500 ml三角瓶装液100 ml，直径8mm的菌饼2片，30 、150 r/min培养7 d，通过用浓度4 l/ml愈创木酚-乙醇溶液的添加量（添加量分别是1.0、1.5、2.0 ml）和添加时间（试验

29、开始时添加、试验第三天添加）分别进行试验，比较了菌株mys005摇瓶发酵的产漆酶情况。结果见表4。由表4可见，当试验开始添加了1.0 ml愈创木酚-乙醇溶液后，菌株mys005漆酶的比酶活降低了72.48%，添加了2.0 ml的愈创木酚-乙醇溶液后漆酶比酶活降低了86.43%；当试验第三天添加了1.0 ml的愈创木酚-乙醇溶液后，菌株mys005漆酶的比酶活降低了63.18%，添加了2.0 ml后的漆酶比酶活降低了85.27%。由此看来愈创木酚并不是菌株mys005的诱导剂，反而是抑制剂；而添加时间的早晚并不影响愈创木酚添加量对菌株mys005产漆酶的抑制作用。 2.3.4 麦麸对菌株mys0

30、05产漆酶的影响 在产漆酶培养基中添加含有木质素的天然植物原料如稻草、锯木屑等可选择性地提高木质素降解酶的产量23。王宜磊27研究了彩绒革盖菌coriolus versicolor（l. ex fr.）quél.产漆酶的能力，并对产酶条件和酶活性进行了比较，结果发现，以麦麸替代葡萄糖后，漆酶产量由131 u/ml提高到了622 u/ml。研究表明，小麦麸皮主要由纤维素（24%）、半纤维素（62%）、木质素（11%）等组成28。初步判断麦麸中的木质素、半纤维素有可能对漆酶产量有促进作用。另外麦麸在中国北方是产量大、价格廉的农产品加工副产物，若能作为漆酶工业生产的原料则经济价值提升的空间

31、就非常大。试验以配方为基础，通过不同添加量的麦麸，比较了菌株mys005摇瓶发酵（500 ml三角瓶装液100 ml，直径8 mm的菌饼2片，30 、170 r/min培养7 d）的产漆酶情况，结果见表5。由表5可见，培养基中添加麦麸对菌株mys005产漆酶有较大的促进作用，随着添加量的增加，产酶量大大提高，当麦麸添加量为15 g/l时，产漆酶量比对照提高了150.87%，达到了868 u/ml；由产酶量结合成本因素，最终确定麦麸的添加量以10 g/l为宜。但是究竟是麦麸中的哪种成份在起作用，还需要进一步试验确认。 2.4 发酵培养条件的优化 2.4.1 培养基不同起始ph，不同培养时间对菌株

32、mys005产漆酶的影响 赵琪等25报道，裂褶菌的菌丝生长最适ph为56、子实体生长最适ph为45，因此试验选择培养基的起始ph分别调整为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，摇瓶培养时间分别设置为4、5、6、7、8 d，以此测定菌株mys005发酵液的酶活，结果如图1所示。由图1可见，当培养基起始ph为4.55.5时，适于菌株mys005产漆酶，随着培养时间的延长，产漆酶量不断提高，基本上在第七天、第八天达到最高值；其中当ph为4.5、培养时间到7 d时产漆酶量最高，达到了986 u/ml；而当ph6.5时，产漆酶量都大大降低。因此确定菌株mys005培养基的起始ph为4.

33、55.0，培养时间为7 d。 2.4.2 不同接种量、培养摇床转速、培养温度对菌株mys005产漆酶的影响 培养基起始ph 4.5、500 ml三角瓶装液量100 ml，接种量分别是直径8 mm的菌饼2、3、4、5片；培养摇床转速分别是120、150、180、200 r/min；培养温度分别是25、28、30、35 ，培养7 d，测定菌株mys005的产漆酶情况，结果分别见表6、表7、表8。从表6、表7、表8综合分析可知，培养摇床转速对菌株mys005液体发酵的产漆酶量影响较大，接种量次之，培养温度的影响最小。因此菌株mys005液体发酵的适宜培养温度为2830 、接种量为直径8mm的菌饼23

34、片、培养摇床转速180200 r/min。 2.2 分子鉴定结果 对菌株mys005高纯度的单菌落进行真菌its分子鉴定，基于rdna its区段进行克隆测序，并对its序列进行核酸序列数据库genbank同源性检索比对，将从genbank检索获得的相关分类元真菌的its序列连同菌株mys005 its序列一起用于系统发育分析，结果表明，受试菌株mys005与genbank核酸序列数据库中schizophyllum commune fr.具有100%的同源性，属于裂褶菌属的裂褶菌。 3 小结 裂褶菌菌株mys005的生长需要消耗大量的氧气，其液体发酵产漆酶应选择浅层振荡培养方式为宜。微量元素、

35、洋葱、麦麸的添加都能大幅度提高裂褶菌菌株mys005的漆酶产量；在新鲜马铃薯（切碎）200 g、k2hpo4 1.00 g、nacl 0.50 g、mgso4 ·7h2o 0.50 g、nano3 2.50 g、cacl2 ·2h2o 0.10 g、 fecl3 0.02 g、吐温-80 1.20 ml溶于1 000 ml去离子水中组成的培养基里添加微量元素复合液（50 mg/ml cucl2·2h2o+20 mg/ml mnso4·h2o+10 mg/ml znso4·7h2o）3 ml、新鲜洋葱100 g（切碎）、麦麸10 g后，于500

36、ml三角瓶装液100 ml，在接种后调起始ph 4.5、培养温度30 、培养摇床转速200 r/min、培养7 d，则摇瓶发酵的漆酶产酶量最高可达1 121 u/ml，显示出了良好的工业开发潜力。 愈创木酚对裂褶菌菌株mys005产漆酶具有抑制作用，添加时间的早晚不改变其抑制效果，当浓度4 l/ml的愈创木酚-乙醇溶液用量为1.0 ml时，产漆酶量可下降60%以上。 参考文献： 1 曹治云，郑 腾，谢必峰，等.漆酶工业应用的研究进展j.生物技术通讯，2004，15（4）：414-416. 2 丛汉卿，徐 立，信彩云，等.植物漆酶的研究进展j.安徽农业科学，2009，37（18）：8322-83

37、23，8340. 3 张 敏，肖亚中，蒲春雷，等.白腐真菌ah28-2菌株发酵合成漆酶初步研究j.微生物学通报，2002，29（3）：37-42. 4 刘淑珍，钱世钧.担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究j.微生物学报，2003，43（1）：73-78. 5 兰瑞芳，林少琴，林玉满，等.杏鲍菇漆酶的生物学特性j.食用菌学报，2002，9（2）：14-16. 6 黄慧艳，张晓昱.白腐菌混合培养在胞外漆酶分泌上的种属互惠性j.中国食用菌，2004，23（4）：31-33. 7 尹艳丽，张晓昱，王宏勋，等.不同摇瓶条件对侧耳菌生长及漆酶分泌的影响j.生物技术，2004，14（5）：72-76. 8 张利萍，高 慧.培养条件对白腐菌分泌漆酶的影响j.安徽农业大学学报，2009，36（2）：330-334. 9 郝瑞芳，李荣春.不同配方培养料栽培裂褶菌的试验j.食用菌，2007（2）：25-26. 10 李梦杰，王翠玲，张玉金，等.裂褶菌液体和固体培养产漆酶的比较研究j.西南农业学报，2011，24（6）：2311-2315. 11 muhammad a， shahnaz k， haq n b， et al. optimization of medium fo