细胞工程复习

1、细胞工程第一章 植物组织培养简介 细胞工程(Cell Engineering)：在体外培养生物细胞，并对细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品。技术：细胞培养、分化调控、细胞融合、细胞器移植、转基因等产品：（1）细胞、组织、器官、个体 （2）有用物质天然药物、色素、香精、抗体、多肽药物、蛋白质、酶、等Dolly诞生的意义：（1）大型哺乳动物的克隆技术成熟；（2）证明了高等动物的细胞全能性；（3）为人们快速繁殖优良动物、改良动物、利用动物作为生物反应器生产药物（疫苗、多肽类药物、激素等）带来了希望。植物组织培养=培养植物组织=无菌培养(aseptic culture

2、)、离体培养(in vitro culture)：在人工培养基(artificial medium)上无菌培养整株植物或植物的器官、组织、细胞或原生质体。植物组织培养的类型：1.植株培养(Plant Culture)：在容器中无菌培养完整的植株。植株来源：由种子无菌萌发而来；通过器官、组织、细胞再生而来。在快速繁殖中，后期的成苗和壮苗阶段属植株培养。一般时间较短，但也有培养时间长的，直接形成产品。2.胚培养 (Embryo culture)：无菌培养植物的成熟胚或未成熟胚，使其形成正常的植株。目的：促进胚的提早萌发，缩短育苗时间；克服远源杂种胚的夭折，以获得新的育种材料；在科学研究中，用胚培养

3、所得到的幼苗作为其它试验的材料。3.器官培养(Organ Culture)：无菌培养植物的根、茎、叶、芽、花、果等器官,使其增殖或形成其它的组织或器官等。4.组织培养(Tissue culture)：指无菌培养植物各种组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、皮层、薄壁组织、胚乳等），或由外植体分化形成的愈伤组织（callus），使其增殖或者分化。愈伤组织（Callus）：具有旺盛分裂能力，但没有组织和器官分化的细胞群。5. 花药与花粉培养：无菌培养植物的花药（带花粉）或花粉，形成单倍体植株。有效的育种辅助手段：单倍体植株获得以后，通过染色体加倍，即得到可以稳定遗传的纯合二倍体，缩短植物育种年

4、限。6.细胞培养 (Cell culture)：无菌培养植物的单细胞或小细胞团。可用于：植物克隆、细胞系的诱变和变异体的筛选、生产有用化合物（useful chemicals）。7.原生质体培养 (Protoplast culture)：将无细胞壁的原生质体培养成愈伤组织或植株。由于无细胞壁的障碍，原生质体是实现远缘植物间大规模遗传物质重组的良好体系。植物组织培养简史：1838年：Schwann 和Schleiden在细胞学说基础上提出了细胞全能性（totipotency）假说：一个高等生物（动物和植物）身上所有的体细胞(somatic cells)均来自一个共同的细胞合子(受精卵）；在适当的

5、条件下，一个体细胞应能像合子一样可以发育成一个完整个体。细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的理论基础；验证细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的动力。1902年：德国植物学家Gottlieb Haberlandt在世界上首次开展了植物组织培养研究，他分离和培养了许多植物的叶肉细胞、髓细胞、气孔保卫细胞。结果：细胞成活了数周，但不分裂、不增殖，以失败告终。失败的主要原因：当时人们对植物细胞生长发育的了解太少。规律？营养条件？所用的培养基成分太简单，没有维生素和植物激素，特别是当时人们还没有发现植物激素。1904年：Hanning成功地培养了萝卜和辣根的胚，使其提早长成小植株。1922年：Knu

6、dson成功地进行了兰花种子无菌萌发，促进了兰花育种、种苗生产和栽培，既而兰花产业的发展。显现了植物组织培养的应用价值。1925年：Laibach进行了亚麻种间杂种幼胚培养，成功地获得了杂种植株。1934年-1935年：器官培养获得成功。White(怀特)成功地进行了番茄根尖离体培养，继代培养达400余天。培养基使用了含有丰富B族维生素的酵母提取物(yeast extract)， 发现了VtB对植物组织培养的重要性。1937年： White设计了第一个培养基，为White培养基(怀特培养基) 。1939年：组织培养获得成功。 上世纪30年代发现了生长素（IAA) ， Gautheret，Nob

7、ecourt和White等在培养基中加入生长素，成功地培养了山毛柳、黑杨等植物的形成层，使其形成了愈伤组织(callus)，并且发现愈伤组织可在生长素培养基上大量增殖, 证明了生长素对植物细胞分裂的重要性。1943年：White出版了植物组织培养手册专著，植物组织培养成为一门新的学科。1940S-1950S：植物细胞培养技术出现重大突破1948年: Skoog 和Tsui（崔徵）发现了腺嘌呤与生长素的配合可以控制烟草愈伤组织形成芽与根。1950S：发现了细胞分裂素。1957年：Skoog和Miller发现用激动素可以代替腺嘌呤，烟草愈伤组织形成芽的效果增加3万倍；发现了细胞分裂素与生长素的浓度

8、比值决定着愈伤组织根或芽的形成。细胞分裂素/生长素的比值：高：形成芽；低：形成根；相当：愈伤组织增殖，但不分化=植物器官分化的激素调控模式：具有普遍性：在很多植物上得到证明；是进行植物组织培养技术研究最重要的指导思想。1952年：法国植物学家 Morel等培育了世界上第一例脱毒植物-大丽花（取分生组织培养）1958年：第一次证明了细胞全能性假说。Reinert J. 和 Steward F. C 成功地将胡萝卜单细胞培养成完整的植株1959年：Morel发现了兰花的快速无性繁殖方法拟原球茎（protocorm-like body=PLB）途径1960年：Cocking 创造了酶解法生产原生质体

9、技术，为原生质体培养、融合和细胞重组打下了基础。1962年：Murashige和Skook 发表了著名的植物组织培养基MS培养基（最常用）。1967年：Bourgin和Nitsh等通过花粉粒培养获得烟草单倍体植株。1971年：Takebe等首次将烟草原生质体培养成完整植株。1972年：Carlson等通过原生质体融合进行烟草种间杂交，并获得了第一个种间杂种植株。1970S-1980S年：德国Reihard等在药用植物细胞培养方面取得重要进展，成功地进行了治疗心脏病药物（地高辛）的生物转化1979年：日本用植物细胞发酵方法大规模培养人参细胞，商业化生产人参皂甙。1985年：日本Mitsui（三井

10、）石化工业公司用紫草细胞培养商业化生产紫草素（色素，抗菌抗病毒，用于化妆品）。1985年：Horsch等报道了农杆菌介导的烟草转基因方法。烟草叶片浸泡在农杆菌溶液中，通过筛选和植株再生，获得了具有外源基因的植株，即转基因植株（transgenic plant），创建了现代植物生物技术植物基因工程植物组织培养技术的应用：1. 植物科学研究的有效手段：可以提供均匀一致的试验材料（细胞、组织、器官、植株）；研究细胞分裂、生长、分化、细胞壁再生等过程与机理；研究基因的功能。2.快速繁殖优良植物3.挽救和保存植物的优良品种：通过分生组织培养可以重新获得无毒植株（virus-free plant），并可以

11、通过超低温保存，长期保存无毒植株的种质；用于挽救濒危植物资源。4.改良植物性状：胚培养：可挽救远源杂交胚、获得远源杂种植株；花药（花粉）培养：可获得单倍体，提高选择效率、缩短育种年限；原生质体融合技术：可克服有性杂交不亲和，创造远源杂种、甚至新的物种；细胞培养技术：可用于细胞突变，更有效筛选突变体。离体再生技术为培育转基因植物提供了保障：5. 生产有用物质：药品、色素、香料等物质（研究用红豆杉植物细胞培养生产紫杉醇）植物组织培养技术的优点：1. 不受气候、季节和地理位置的影响；2. 不受病虫害的影响3. 植物生长发育过程容易调控，容易根据市场需求调节生产；4. 

12、效率高、质量好第二章  植物组织培养的设施一、 化学试剂：用于配制培养基无机试剂：硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵、硫酸铜、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙、硼酸、钼酸钠等。有机试剂：维生素(B1、 B6、烟酸、生物素）、氨基酸、糖（碳源）、植物激素、凝固剂以及其它一些物质。二、 无菌设备1. 灭菌锅（autoclave）：最常用消毒的工具。种类多：手提式（如常见的医用消毒锅，体积小）、立式（体积中等）和卧式（有中型和大型）之分；有自热式（带有加热装置）和外热式（无加热装置，需要从外部加热，如煤气、电炉、蒸气等）之分。使用什么样的灭菌锅，要根据植物组织培养的规模而

13、定。2.超净工作台（laminar air-flow cabinet）：细胞工程中必不可少的一种设备，极端重要，用于对植物材料进行无菌操作。超净工作台=空气过滤器，空气经过12次粗滤后，最后通过孔径为0.20.4m的滤网。超净工作台可以分为双人和单人、单面和双面、水平风和垂直风等类型。三、培养室（Culture room）植物材料需在一个可控温、控光、洁净的地方进行培养。如规模小，则有12个培养箱即可。培养箱体积小，不占地方，控温、控光条件好，很适合于摸索植物材料的培养条件和科学研究。缺点是空间小、价格昂贵（10000元/台）。如果要培养较多的植物材料，应建立专门培养室。培养室所需要的设备：1

14、.培养架:培养架的设计既要考虑充分利用培养室的空间，也要考虑取放材料方便。 2.加温/降温设备：空调3.光照和控光设备:分为光培养室和暗培养室。光培养室常用日光灯照明，并安置控制光照时间的自动开关。四、培养容器1. 玻璃容器：如试管、三角瓶、果酱瓶、罐头瓶、饮料瓶等。玻璃瓶耐高温消毒、透明（便于观察），且为惰性物质，对植物材料的生长影响小，是组培中用得最广的容器，但容易破碎。2. 透明塑料容器：轻巧，不易破碎，但不耐反复高温消毒，而且有些塑料容器在高温消毒时会释放一些有害的物质，影响材料的生长。3. 容器封口：良好的封口用品要求做到既可以防止污染和容器内水分的过分散失，又要做到透水、透气。专用

15、的组培容器有自己的盖子。如果没有，可用棉塞、封口膜、锡箔纸、耐高温的塑料纸（如培养食用菌的聚丙烯塑料袋）封口。棉塞最好。瓶盖、瓶塞、或者封口膜的透气性能对材料的培养有显著影响，透气性能不好的，容器中湿度高（饱和），容易导致植物材料出现玻璃化（生理病态，植物材料呈水渍状，深绿色，刚脆，无继续培养的价值）五、其它仪器设备与用具1. 天平：需要1台万分之一的精密分析天平和百分比之一或十分之一的普通天平。2. 冰箱：用于储藏一些不宜在常温下较长时间放置的药品和试剂，如维生素、氨基酸、激素、微量元素等。3. 蒸馏水器或者去离子水生产装置4. 酸度计：植物生长需要一定的pH值，因此需要调节培养基的pH值。

16、酸度计测定pH值精度高，准确，但较烦琐。如不进行要求很高的培养（如单细胞培养、原生质体培养），可以用pH试纸代替。5. 酒精灯6. 解剖刀和镊子 7. 摇床植物组织培养室的设计植物组织培养工作按内容不同可分为3个过程：1.培养基的准备：试剂的配制、容器的洗涤、培养基的制备与消毒等：2. 植物材料的无菌操作(接种）：3.植物材料的培养、观察与分析。第三章 植物组织培养基（Plant Tissue Culture Medium）培养基的重要性：营养来源；调节生长与分化的主要途径。培养基种类比较多，共同之处：含有植物生长发育所必须的营养物质和生物活性物质不同之处：营养物质的浓度不同培养基的组成：一、

17、水：要求纯净。应用蒸馏水、去离子水，而不用自来水。二、无机营养：大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S；微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn三、有机营养 (有机成分)：维生素和氨基酸的总称。常用：肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和甘氨酸等。难培养的材料，可增加维生素和氨基酸的种类：其它维生素：维生素M（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙等。其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等四、碳源：最常用的糖是蔗糖(sucrose)，也有用葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)或其它的糖，有时几种糖混用。糖是营养物质，但不是越多

18、越好，用量大多在10-60g/L，一般为20-30 g/L。五、 植物生长物质（俗称激素）：植物激素和植物生长调节剂的总称。植物激素：植物合成的、微量就有显著效应的物质。植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素相似作用的物质。根据功能不同，植物生长物质共分为五大类：1. 生长素(Auxins)：吲哚乙酸 (IAA)、吲哚丁酸 (IBA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)（除草剂）作用：(1) 促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组织；2,4-D>NAA>IAA, IBA(2) 控制器官的分化，诱导根的形成、抑制芽的诱导。诱导根的作用：IBA>NAA>IAA2

19、. 细胞分裂素 (Cytokinins)：Zeatin 玉米素 (ZT)、异戊烯基腺嘌呤（2iP）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA, BA, BAP）、激动素（KT）、噻苯隆（TDZ）作用：促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组织；控制器官的分化，诱导芽的形成和增殖、抑制根的诱导。3.赤霉素 （Gibberellins）：种类很多，有七、八十种，其中以赤霉酸3（GA3）用得最普遍。作用：促进细胞的伸长：赤霉素最显著的作用，可用于促进芽或茎的伸长。打破种子休眠的作用。赤霉素对热不稳定，故不能用高温法消毒。4.乙烯：促进果实成熟，加速植物衰老。植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利），相反，而是尽量控制乙烯的产生。

20、5.脱落酸（ABA）：促进植物的衰老和器官脱落，植物组织培养很少用。在胚状体（embryoid）的诱导和培养中常常使用脱落酸，促进胚状体的成熟。 六、凝固剂：琼脂（agar）是最常用的凝固剂，用量为6-12g/升。另外还有phytagel, Gelrite, 2-4g/L。七、有机附加物（Organic additives）：水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量为0.1-10g/L，一般为0.5-3 g/L。椰子汁：100-200ml/L。这些物质的成分复杂、不明确，统称为有机附加物。当材料生长不好时，加入这些物质往往可以会明显改善材料的生长状况。八、其它物质防止与减缓植

21、物材料褐化的物质：1）抗氧化剂：抗坏血酸（Vc）、L-半光氨酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。2）吸附剂：活性炭（无选择性）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP；酚类物质吸附剂）。培养基的制备一、培养基母液配制1.无机盐母液的配制（以MS培养基为例）1）大量元素母液的配制：大量元素浓度比较高，故母液浓度(倍数)不能过大，否则溶解不完全，容易析出(特别是冬天)，使用很不方便，一般为20、50或100倍。另一个要考虑的问题是高浓度时有些离子之间发生会发生相互作用，形成沉淀，如SO42-、PO43-和Ca2+之间。因此，在母液浓度较高时，Ca盐要与硫酸盐、磷酸盐分开。MS大量元素的母液浓度为20倍时，5种盐在一起不会出

22、现沉淀；但当母液浓度达到50倍时就出现沉淀。因此，母液浓度高时MgSO4和CaCl2要分开。如把KNO3和CaCl2·2H2O配在一起（母液 I）， NH4NO3 、MgSO4·7H2O和KH2PO4配在一起（母液 II），这样，即使母液浓度达到100倍也不会出现沉淀。2）微量元素母液的配制：除铁盐外，其它微量元素可以全部配在一起，浓度常为100200倍。Fe2+容易变成Fe3+而形成沉淀，不利于植物材料的吸收，所以把FeSO4同Na2EDTA配在一起，形成络合铁（稳定，植物利用度高）。其母液浓度为100-200倍。配法是先分别将FeSO4和Na2EDTA溶解，然后等体积混

23、合，边混合边搅拌，混合液为黄色。微量元素母液和铁盐要放在冰箱中保存。2. 有机成分母液的配制：一种培养基的有机成分(氨基酸和维生素) 可以配在一起,100-200倍。有机成分母液应放在冰箱中保存，否则容易生霉、变质。3. 植物激素母液的配制：每种植物激素要单独配一种母液，浓度为0.5-1.0 mg/mL。激素不易溶于水，但易溶有机溶剂（乙醇、二甲基亚砜）和稀酸稀碱。稀酸稀碱：需要过滤灭菌；加入培养基后pH会变。 70%-90%乙醇：溶液无菌，加入培养基后pH不变。激素母液应低温保存。二、培养基的制备1.根据植物材料和培养目的，设计培养基配方（基本培养基，糖、植物激素、琼脂和其它成分的浓度）;2

24、.根据培养基的体积和母液浓度，计算出各种成分的用量，并且准确无误写在实验记录本上;3. 根据计算出来的结果，正确配制培养基操作步骤：1、计算出各种成分的用量，填写培养基记录表2、配制过程（1）称30g蔗糖和8g琼脂，放入锅中，加1000ml左右（总体积的2/3）蒸馏水，加热、煮沸5min，至琼脂完全熔化；（2） 按量加入各种成分(在记录表上打钩，防止漏加、多加)，然后用蒸馏水定容至1500ml；（3）调pH值：用KOH或NaOH和HCl调pH值至5.8。非常重要：pH值影响琼脂培养基的凝固效果；pH值影响培养基中营养成分的有效性；pH值影响植物材料的生长状况（不同植物材料有不同的最佳pH环境，

25、水稻、杜鹃花、兰花等喜欢偏酸性）（4）分装到培养容器中，容器盛培养基量为容器体积1/5-1/3，但不要超过2/3，容器封口。3、培养基的消毒（方法如下）：高温灭菌法：简单、易行、量大、效果好、最常用。温度121，压力1.1-1.2大气压。应注意的问题：一定要先排气10 min，否则消毒不彻底；高温消毒后，培养基的pH值会下降0.20.5个pH单位；高温消毒过程中，培养基中有些物质会被破坏或发生沉淀。如蔗糖会水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖酸等。热不稳定的物质高温高压消毒会完全被破坏，如赤霉素、玉米素等。物质破坏程度与消毒时间和压力有关。(2) 过滤灭菌法：不会破坏培养基的成分和改变培养基的

26、pH值，所以在原生质体和单细胞培养时要用过滤消毒法对培养基进行灭菌。热不稳定的物质，如ZT、2ip、GA3、核黄素等，也要用过滤消毒法灭菌 过滤灭菌的操作：先将微孔滤膜（孔径0.2-0.45 mm，用前最好在蒸馏水中浸泡数小时）装入滤头中，用纸或布将其包好，再高温灭菌；在超净工作台上取出滤头，用注射器吸取培养基或溶液，将注射器接在滤头入口端，推动注射器使培养基或溶液从滤头出口处流出，并用无菌容器收集滤液。要注意：A. 溶液中的成分必须完全溶解，不能有悬浮物或沉淀物，否则会堵塞微孔滤膜。如确有悬浮物或沉淀物，应先离心。B. 要注意滤膜是否破裂（使用时可根据经验判断；使用完后可检查滤膜）。C. 过

27、滤时不要用力过大，否则会导致滤膜破裂。过滤消毒法的缺点是操作比较烦琐，只适合少量培养基的灭菌。第四章 外植体表面消毒与污染控制污染发生的途径：1.植物材料自身带菌；2. 培养基污染；3. 接种操作过程污染；4. 培养过程中污染防范接种操作过程中污染：1.接种空间要洁净、无菌；2.超净工作台要合格；3.操作要规范、小心高洁净度的接种室和合格的超净工作台是保证无菌操作的前提培养过程中污染的防范：培养室要洁净、无虫少菌；培养容器封口要好外植体(Explant)用于建立无菌培养的起始植物材料。表面消毒(Surface sterilization)（用消毒剂）杀死外植体表面其它生物（主要是细菌和真菌）的

28、过程。植物材料表面都带细菌和真菌，接种前对外植体有效的表面消毒是建立无菌培养的关键。 表面消毒的要求：（1）最大限度地杀死细菌和真菌；（2）对外植体的毒害要尽可能的小评价消毒效果指标：污染率和植物材料的成活率常用消毒剂：用于植物材料表面消毒的消毒剂有乙醇、氯化汞、次氯酸钠、双氧水等。次氯酸钠=漂白粉 商品液：淡黄色，有效氯10%双氧水=过氧化氢 商品液无色，含量30%消毒步骤：1.  对材料进行适当的处理，用自来水将材料冲洗干净。2. 将材料剪成适当大小（长短）的小块（段）。3. 在70%-75%的乙醇中10-60 S，然后迅速转入到其它消毒剂（氯化汞、

29、次氯酸钠）中，消毒剂中可加入少量表面活性剂（Tween 20或80、家用洗涤剂等），以增加消毒效果。4. 消毒结束后，将材料转入无菌水中漂洗2-8次；5. 将材料的伤口部分切去后，再将其切成适当大小，及时接入到培养基中。材料内部污染的控制1、用分生组织作为外植体。因为分生组织内无维管组织，所以不带菌。2、在培养基中加抗菌素（青霉素、卡那霉素、四环素等），但高浓度的抗生素往往对植物材料生长发育也有抑制作用，而且抗菌效果有时不一定理想。 3、用尽量小的材料接种。每接一个外植体就将接种工具消毒一次，避免交叉感染。材料越小，污染的机会也就越小，但成活率越低。第五章   高

30、等植物离体再生与无性繁殖（In vitro Regeneration and Clonal Propagation of Higher Plants）有性繁殖（Sexual propagation）：通过授粉受精形成的种子进行繁衍后代的方法叫有性繁殖。因为繁殖体是种子，所以又称种子繁殖。种子发芽的条件：充足的水分、适宜的温度、合适的光照种子繁殖的优点：种苗生产操作比较简单；种苗根系完整、生长健壮等优点。种子繁殖的缺点：有些植物是不能或不宜用种子繁殖的。如无种子或种子无活力的植物；杂种植物；有些植物虽然可以用种子繁殖，但生育期长、或者繁殖系数低。无性繁殖（Asexual propagation）

31、：通过植物体一部分（常是营养器官，如芽、根、茎、叶等）繁殖的方法，所以又称营养繁殖（vegetative propagation）。一株植物通过无性繁殖所形成的群体称为一个无性系（clone,克隆），无性繁殖植物=克隆植物，无性繁殖又称clonal propagation植物的无性繁殖方法：（1）分株繁殖（Dividing）：通过植物本身的组织或器官生长出来的小植株进行繁殖优点：操作简单；成活率高（2）扦插繁殖（Cutting）：剪取某些植物的茎（枝条）、叶、根等（插穗）插入土中、沙中，或浸泡在水中，生根后就成为独立的新植株。最常用扦插成败关键因素是生根 生根粉：促进难生根植物生根叶插：景天属

32、、石莲属、风车草属、伽蓝菜属等多肉植物。芦荟根插：枝插成活困难而根插较易成活的树种如枣、柿、核桃、长山核桃、山核桃、漆树等常用此法（3）压条繁殖（Layering）：将枝条压入土中，使侧芽生长、生根（4）嫁接繁殖（Grafting）：可以培育出结合两种植株优点的种苗。果树育苗常用无性繁殖的优点：所繁殖的植株与母株的性状一致无性繁殖的缺点：繁殖速度有限，特别是当起始材料少时，不能快速推广优良植株；容易传播病害。植物离体再生(in vitro plantlet regeneration)：利用组织培养技术使植物外植体（根、茎、叶、花等）形成完整植株的过程离体无性繁殖=利用植物组织培养技术对植物进行

33、繁殖=in vitro clonal propagation。因为植株小，又称为植物的微型繁殖(简称微繁) =micropropagation; 因为繁殖速度快，又称为快速无性繁殖（简称快繁=rapid clonal propagation。植物离体无性繁殖的过程：1. 繁殖体的诱导（芽、胚性愈伤组织、Plb）2. 繁殖体的增殖；3. 植株再生（芽的生根、胚状体形成与萌发、 Plb分化植株）4.小苗移栽: 将再生植株由组培室移栽到温室、田间。植物离体再生途径一、顶芽和侧芽再生途径（茎段培养= nodal culture ）1.选择适当的枝条、茎段，消毒；2. 茎段

34、培养（nodal culture）或茎尖培养（shoot tip culture)；1-2芽/段3. 促进顶芽和侧芽生长，形成幼茎(shoot);4. 幼茎生根、形成完整植株。（重复2和3，可以大量繁殖植物）优点：方法简单；变异最低，所繁殖的植株在性状上能最大限度地与母株保持一致。缺点：有时繁殖系数可能比较低，不能满足快繁的要求茎段培养可能遇到的问题：1、有些植物不能通过茎段培养进行繁殖：茎能伸长的植物（菊花、马铃薯、葡萄、木本植物等）效果好；节间短、莲座状的植物（如凤梨、非洲菊、白菜等）效果差，甚至不能。即使茎能伸长的植物，因为繁殖效率低也不一定能进行有效地茎段培养。茎段培养繁殖植物的效率决

35、定于哪些指标：芽生长率：侧芽和顶芽萌动生长的茎段比率幼茎节数：节数多，侧芽就多，增殖系数就大生长速度：培养一个周期需要的时间2、侧芽和顶芽生长率低3、幼茎伸长不理想，影响增殖效率和生根（1）利用春、夏季材料，不用秋季、冬季材料；（2）在长日照条件(16h/d)和弱光下培养；（3）降低细胞分裂素的浓度（细胞分裂素高浓度抑制芽的伸长）（4） 添加GA二、不定芽再生途径不定芽(adventitious bud)： 从外植体不固定的位置形成的芽。1、外植体的选择与消毒2、不定芽的诱导（外植体既可以直接形成不定芽，也可以先形成愈伤组织，再由愈伤组织形成形成不定芽）；3、芽的增殖(茎段培养或不定芽)：不定

36、芽的增殖：增殖培养基一般可以在最佳的诱导培养基上进行增殖，但有时激素浓度要适当调整。如不定芽过多，但不伸长，则要降低细胞分裂素的浓度；如不定芽的形态正常，茎也能伸长，但增殖的数量较少，则可以提高细胞分裂素的浓度。4、不定芽的生根。优点：（1）取材料方便，不毁坏母株；（2）芽的增殖速度快，繁殖效率高；（3）可以用于培育转基因植物缺点 ：(1)再生植株的变异几率可能较大。如香蕉不定芽增殖6-8代后，不定芽的变异比率就大大增加。属于体细胞变异；(2)嵌合体性状会丧失：如一些花卉的花叶，通过不定芽途径形成的植株可能会失去花叶的性状。影响不定芽形成的因素：1.  植物种类和品种（基因）差异不同

37、植物形成不定芽的能力不同：草本植物大于木本植物；双子叶植物大于单子叶植物。同一种植物，不同品种之间往往也有很大的差异。2. 外植体的类型：同一株植物上不同的器官（根、茎、叶、花、果实、胚）形成不定芽的能力往往会有差异。茎、叶是最常用的外植体，但对于非洲菊来说，其花托是最佳的外植体。3. 外植体的生理状态发育状态：植物的生长发育可以分为营养生长期和生殖生长期。前者为幼年期（童期），后者为成熟期。幼年期的外植体形成不定芽的能力大于成熟期的外植体，特别是木本植物。生长状态：幼嫩的外植体比老的外植体容易形成不定芽。4 培养基（1） 基本培养基：不同基本培养基的无机盐浓度差异大，对不定芽的诱导会有很大的

38、影响。（2）植物激素：培养基中激素的浓度和种类对绝大多数植物的不定芽诱导有决定性的影响。CTK/Auxin比值高，有利于不定芽的形成。激素的种类与：不同的细胞分裂素、不同生长素激素的组合：细胞分裂素/生长素比值：相对量激素的浓度：绝对量5. 培养条件：光照和温度无根苗的生根（Rooting of Shoots）：当顶芽、侧芽或不定芽增殖形成的无根苗（shoot）达到足够数量后，必须将其转到生根培养基上进行生根，形成完整的幼苗（plantlet）。生根的质量影响组培苗的质量和移栽成活率无根苗生根有2种类型：皮部生根型：根直接从无根苗基部茎的皮层处长出愈伤组织生根型：无根苗基部先形成愈伤组织，再在

39、愈伤组织上形成根。影响无根苗生根的主要因素：. 植物的类型和品种：草本比木本易；幼年期外植体形成的无根苗比成年期形成的无根苗容易。2. 基本培养基成分：不同培养基的无机盐浓度差异较大，对生根的影响也比较大。一般较低的无机盐有利于生根，故生根培养基常常将大量元素减半，特别是MS培养基。3. 激素：细胞分裂素抑制生根，生长素促进生根三、胚状体再生途径胚是具有胚芽、胚根、胚轴和子叶的幼小植物体。在自然条件下，胚是通过两性细胞受精形成的合子发育而成的，存在于种子中，故又称为“合子胚”、“ 种子胚”。在种子中，胚的发育经历了球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚等几个阶段。由体细胞形成的“胚”称为“体细胞胚”

40、(somatic embryo)，或“胚状体” (embryo-like body; embryoid)。诱导植物体细胞形成体细胞胚（胚状体）的过程就称为“体细胞胚胎发生”或“体胚发生”(somatic embryogenesis)。胚状体途径植株再生的过程1.选择合适的材料、诱导胚性愈伤组织（能够产生胚状体的愈伤组织）2.促进胚性愈伤组织形成正常的胚状体（球型胚、心型胚、鱼雷型胚、子叶胚、成熟胚）3.促进胚状体萌发成苗胚性愈伤组织(embryonic callus)特征：质地较坚实，乳白色或黄色，表面具球形颗粒，生长比较缓慢；细胞较小、等直径，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性

41、强。外植体：幼胚子叶培养基：无激素的MS培养基胚状体的起源：单细胞影响胚状体诱导的因素1. 植物种类：不同种类植物形成胚状体的能力差异很大。目前已报道有90多个属、150多种植物形成了体细胞胚，但以芸香科、茄科、五加科、伞形科、毛茛科的植物比较容易。2.外植体种类：3.外植体生理状态：幼年期外植体高于成年期外植体，尤其是用合子胚及种子萌发的幼苗为外植体，容易诱导成功。幼嫩外植体高于成熟外植体4. 植物激素：少数植物可以在无激素的培养基上形成胚状体，如五加科的一些植物，人参;大多数植物则需要在生长素、或细胞分裂素、或生长素和细胞分裂素共同作用的诱导下才能形成胚状体，但激素种类、组合、浓

42、度因植物种类而异。2,4-D：常用于诱导胚性愈伤组织ABA: 植物组织培养中一般不用，但在植物的胚状体再生途径中，ABA通常有促进胚状体发育与成熟的作用。5. 培养基成分：糖、NH4+、Ca2+浓度，氨基酸（特别是脯氨酸）、水解酪蛋白等物质有利于胚状体的诱导；麦芽糖有利于胚的成熟。胚状体的应用1、快速繁殖植物：胚状体的形成需要经历胚性愈伤组织、球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚、成熟胚等一系列的过程，如果要用该途径进行植物快繁，则技术上需要做到两点：（1）胚性愈伤组织要稳定，可以大量增殖；（2）胚性愈伤组织形成胚状体的发育过程要同步。只有这样，才能大量生产整齐一致的种苗。2、生产人工种子：人工种

43、子制作是将胚状体包裹一层“胚乳”和“种皮”类的物质。一般将胚状体混和在含有营养物质和激素的海藻酸钠中，通过漏斗滴入的CaCl2溶液中，则就形成颗粒状。人工种子的好处：容易储藏；方便运输；容易使用(播种)3.培育转基因植物的重要技术之一四、拟原球茎途径拟原球茎的特点：（1）增殖：切成薄片后，每片可以形成数个新的原球茎，繁殖速率高；（2）分化成苗：如果原球茎不被切割，则可象种子原球茎一样，发育成苗。原球茎（根状茎）途径是兰花无性繁殖最快的途径；原球茎（根状茎）诱导的是兰花快速繁殖的关键。兰花的繁殖： 1. 种子繁殖种子数量多：几十万-几百万种子/蒴果成熟种子：无营养、胚未分化成熟自然发芽率极低:共

44、生真菌、温度、湿度2. 无性繁殖：常规方法是分株，速度太慢；有些兰花不能分株繁殖无病毒植株的生产脱毒苗生产机理：在植物体内，病毒是通过维管组织传导的，茎尖的分生组织（meristem culture）无维管组织，所以没有病毒；分离分生组织进行组织培养，再生出植株就是无病毒植株。通过快速繁殖技术就可以生产出大量无毒苗，从而恢复其生产能力。无毒苗生产的主要技术要点： 1. 感病植株的病毒鉴定；2.感病植株的热处理：37-39的温度处理感病植株20-60天可以使病毒失活，增加获得无病毒植株的机会；3.分生组织的分离：取茎尖生长点分生组织：0.1 mm×0.1 mm×0.1mm。4

45、.植株再生：诱导不定芽、胚状体、原球茎5.再生芽或植株病毒的检测：鉴定脱毒效果（血清免疫、电镜观察、接种鉴定等方法）。6. 扩繁无毒苗：7. 移栽后的隔离繁殖，保证种苗无病毒。植物离体繁殖技术的应用：1. 快速繁殖优良品种2. 无病毒优良种苗生产3.挽救和繁殖濒危植物4.离体保存植物资源（离体种质库）5. 培育转基因植物第六章 植物细胞培养技术植物细胞培养：培养彼此分离的细胞、使之生长、增殖。类型：1、固体培养(solid culture)：在固体培养基中培养细胞，也称静止培养。优缺点:1）细胞被固定、不能移动，可以跟踪单细胞生长；2）所得到的细胞团均由单细胞形成，遗传成分和生理特性一致；3）

46、细胞生长速度较慢；4）单细胞分裂后形成细胞团，不能长期、连续、大规模培养细胞。2. 液体培养（liquid culture）：在运动的液体培养基中培养细胞。又称悬浮细胞培养（ suspension cell culture）。液体培养又有2种形式：1）成批培养(batch culture)：在一个封闭体系中培养细胞，一个培养周期结束后，细胞被转移到新的容器中继续培养。2）连续培养(continuous culture)：在一个容器（或者系统）中连续不断的培养细胞。悬浮细胞培养的优缺点1）细胞生长速度快；2）可以长期、连续、大规模培养细胞；3）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程。细胞培养的应用：1.

47、 进行细胞生物学研究：筛选细胞、获得均匀一致的细胞作为试验材料；研究细胞生长、分裂：单细胞培养可以连续观察和记录（摄像）细胞的生长和分裂全过程2. 筛选和培育植物变异体： 如抗病、抗虫、抗盐碱、抗铝、抗除草剂等。（1）从自然变异的植株中进行选择：自然变异率低、机会小，工作量大，效率低。（2）杂交育种：可以把抗性基因转移到需要改良的品种中，但时间长（3）诱变植物（种子或芽）：工作量大 射线；甲基磺酸乙酯（EMS）（4）细胞培养：特别适合抗（耐）性育种，效率高。抗耐盐、碱、除草剂、旱先诱变细胞，再将细胞培养在有选择压力的培养皿中，具有抗性的细胞就可以分裂，诱导其形成完整植株，即可获得真正的抗性变异

48、体。在一个培养皿中，一次可以筛选10-20万个细胞（一个细胞就是一潜在的植株）细胞培养的建立和维持：细胞培养通常是将植物材料接种在液体培养基中，经过摇荡建立起来的。愈伤组织(callus)是一群无明显组织分化、有分裂能力的细胞群（团）。形成的因素：创伤；植物激素的诱导愈伤组织因植物种类、外植体、培养条件等在颜色、松散程度、含水量、生长速度等方面存在差异。分化(differentiation)形态、结构和功能相同的细胞变成形态、结构和功能互不同的细胞的过程，如分生组织细胞转变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。脱分化(去分化；dedifferentiation)已分化、成熟的细胞失去原有的状态、重

49、新恢复分裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的过程就是脱分化的过程。再分化 (redifferentiation)愈伤组织形成其它组织或器官的过程继代培养（传代培养；subculture）：将培养物（芽、愈伤组织、细胞等）分成若干份，接种到新鲜培养基上继续增殖的过程。细胞培养周期：两次继代培养所间隔的时间。在一个细胞培养周期中，细胞的生长情况经历了慢快慢的过程延滞期：细胞继代培养开始后的一段增殖缓慢的时间。快速生长期：细胞数量、重量或体积直线上升的时期。对数生长期渐降期：细胞生长速度逐渐减慢的时期。静止期：新生的细胞数量与死亡的细胞数量达到动态平衡的时期。下降期：活细胞数量不可逆下降的时期。细胞悬

50、浮培养要求达到一定的接种细胞密度 (cells/ml)， 一般为0.5-2.5×105个 细胞/ml。密度高，细胞分裂快，延滞期短；密度低则相反。如果密度太低，则细胞不能不分裂，最后全部死亡。因此，悬浮细胞培养时，要求达到最低起始细胞密度。最低起始细胞密度（minimum initial cell density）： 细胞能够生长、分裂的最低接种密度。影响最低起始细胞密度的因素(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其最低起始细胞密度比较低；相反，则高。(2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则起始细胞密度可以比较低。(3) 培养基成分：用营养成分丰富的培

51、养基或条件化培养基(conditioned medium)培养细胞，起始细胞密度低。条件化培养基：培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基(4) 培养方式：采用看护培养（nurse culture）是降低最低起始细胞密度的有效方法之一。看护培养（nurse culture）：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。单细胞培养技术：培养彼此分离的单细胞，且细胞密度比较低应用：研究和观察细胞生长与分裂过程的最好方法分离、筛选细胞系的有效方法微室培养(Culture in microchamber) 可以用于：（1）连续观察、记录细胞生长、分裂的过程；

52、（2）研究一些物质对细胞分裂的影响平板培养（Plate culture）：在固体培养基中培养大量单细胞的一种方法方法：细胞悬浮液与固体培养基混匀后，倒平板1.单细胞悬浮液的制备：（1）用不锈钢滤网（150m )过滤快速生长期（旺盛分裂）的悬浮细胞，得到单细胞滤液；（2）滤液经过离心后， 细胞沉淀；（3）倒出上清液，用新鲜培养基重新悬浮细胞，并调节细胞密度（视最终接种密度和固体培养基混合的比例而定；一般5×103-5×105 cell/ml）2.培养基的制备配制固体培养基，但浓度要比正常的高（与稀释倍数有关），高温灭菌后冷至40。条件化培养基的配制：培养悬浮细胞的培养液离心取

53、上清液与高温灭菌的培养基等量混合冷至40备用。3. 平板培养的制作：将单细胞悬浮液按预定的比例与40固体培养基混合均匀后，倒入无菌培养皿中，培养基的厚度为5 mm左右。盖上盖子，摇动、布匀，用Parafilme膜封口。4.培养条件：温度为25，黑暗或弱光照。平板培养的效果，可用植板率（plate efficiency）来衡量。植板率（%）=每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数×100影响植板率的因素：(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其植板率高；相反，则低。(2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则植板率高。(3)接种细胞密度：接种密度

54、高，有利于细胞分裂，提高植板率，如烟草细胞。(4) 培养基成分：基本培养基、激素等。用营养成分丰富的培养基或条件化培养基，植板率高。(5) 培养方式：采用看护培养可以提高植板率。平板培养是分离、筛选单细胞无性系和突变体的有效方法植物细胞大规模培养生产次生代谢物质初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢，如呼吸作用、光合作用、蛋白质和氨基酸代谢、核酸和核苷酸代谢、脂肪代谢、激素代谢等。初生代谢产物：初生代谢过程中形成的产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。次生代谢：对植物生长发育非必需的代谢，其代谢产物称为次生代谢产物。次生代谢是在初生代谢基础之上衍生而来的。次生代谢产物为小分子有

55、机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，也往往是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。植物次生代谢产物种类繁多，按结构特点可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类植物次生代谢产物的重要性：1）药物：全球80%的药品直接、间接与其有关；2）保健品：种类繁多3）食品、化妆品原料或添加剂：色素、香料；4）化工等重要原料：获得次生代谢物的方法1. 从植物中提取：可靠，但受到资源的限制，会破坏野生资源；人工栽培则占用土地、受病虫害、自然灾害等因素的限制。2. 化学合成：产量高、成本低，但污染环境，而且有些物质结构复杂，难以人工合成，如海南粗榧内

56、酯；有些虽然可以人工合成，但成本太高，如紫杉醇等。3. 植物细胞大规模培养：植物细胞不仅具有形态全能性，而且也具有化学全能性（植物离体细胞可以合成整株植物所合成的化学物物质）。植物细胞培养生产次生代谢物质的优点：（1）不破坏、不依赖野生资源；（2）不受环境因素的影响；（3）不占用土地资源；（4）环境污染小；（5）产量可以调控。是一种可持续的、大有前途的方法植物细胞培养技术生产天然产物主要成就：1.证明植物细胞在离体条件下可以整株植物所合成的次生代谢物质；2.发现了提高细胞次生代谢物质含量的方法； 实现了植物细胞进行大规模培养（75吨）；3.成功商业生产了少数次生代谢物质（紫草素、人参皂苷、地高

57、辛、紫杉醇等）。存在的问题：普遍产量不高、不稳植物细胞大规模培养生产次生代谢物质研究的主要过程1. 选择外植体、建立细胞培养和细胞系；2. 通过分析生长量和含量，选择高产细胞系；3. 研究高产、稳产的培养条件；4. 小试（放大培养）：优化培养条件（高产稳产） (可参考3)5. 中试（再放大培养）：优化培养条件（高产稳产） (可参考4)6. 大规模培养；优化培养条件（高产稳产） (可参考5)7. 工业化生产；产品分离、纯化。植物细胞培养生产次生代谢物的研究进行了60年，只有少数成功的例子，主要原因：目标化合物的产量低、不稳定。寻找提高次生代谢物产量的方法对于用植物细胞大规模培养工业化生产次生代谢物极为重要提高次生代谢物产量的方法1. 选择、培育高产细胞系：细胞系合成次生代谢物的能力对细胞大规模培养工业化生产次生代谢物有决定性的影响。（1）不同植物、不同单株、不同外植体：一种次生代谢物可能在多种植物中都有，但含量不同；在同一种植物中，不同植株之间会不同；同一株植物上，不同部位由于生理差异，往往也有不同的次生代谢物合成能力。（2）对细胞系进行系统选择： 在培养过程中，细胞系会出现变