基于深度测序技术非侵入性胎儿染色体非整倍体检测

1、中南大学湘雅医院产前诊断中心中南大学湘雅医院产前诊断中心湖南家辉遗传专科门诊部湖南家辉遗传专科门诊部邬玲仟邬玲仟 基于深度测序技术的非侵入性基于深度测序技术的非侵入性胎儿染色体非整倍体检测胎儿染色体非整倍体检测染色体非整倍体染色体非整倍体l定义：体细胞染色体数目增加或减少一条或数条的个体l类型：la. 单体型：2n-1；x，21，22号丢失常见。lb. 三体型：2n+1；常染色体13、18、21三体常见，性染色体三体型有xxx、xxy、xyy。lc. 多体型：仅见于性染色体；如48，xxxx49，xxxyy。21三体综合征三体综合征唐氏综合征（downs syndrome， ds）先天愚型足月

2、新生儿最常见的染色体疾病，发病率1/700至今没有根治方法我国每年约2000万新生儿,每年约有26600个ds儿出生。我国有大约60万以上的ds患者。l特殊面容：面部扁平、鼻梁低平、眼距宽、外眦上斜、内眦赘皮、张口吐舌等l智力障碍：患者智商（iq）通常为3060。l生长发育迟缓和肌张力减退：出生体重偏低，肌张力低下，身材矮小，短颈，颈背皮肤松垂，手短而宽、通贯掌、小指弯曲等。l至少1/3的患者伴发先天性心脏病。十二指肠闭锁和气管食管瘘等伴发症也较其它疾病常见。患白血病的风险为正常人群的15倍。 临床表现临床表现18三体综合征三体综合征18三体综合征是次于先天愚型的第二种常见染色体三体征。新生儿

3、发生率约为1/7500。主要临床表现: 智力障碍、生长发育迟缓、胸骨短、严重的心脏畸形以及肌张力亢进等。颅面部的畸形包括小颌畸形、枕部突出、小耳以及低位耳等。双手呈特征性的握拳状，摇椅足。l13三体综合征发病率为1/2000025000。l主要临床表现：严重的中枢神经系统畸形，内脏畸形，颅面部的畸形，手足畸形等；13三体综合征三体综合征 21三体综合征二级预防模式三体综合征二级预防模式早孕期筛查 ： nt+papp-a中孕期筛查 ：二联、三联或四联得到最终的风险值产前诊断母亲血清标记物和超声筛查的可信度母亲血清标记物和超声筛查的可信度结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率:65%，假阳性率:

4、4.5-5.0%增加抑制素a，可以将检出率增加到75%结合母亲年龄的nt测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5%.结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性率：5%.wapner r, et al. (2003) first-trimester screening for trisomies 21 and 18. n engl j med 349:14051413血清学筛查存在的问题血清学筛查存在的问题孕周的确定不准确许多单位未严格控制孕期筛查的时限取血时间与开单时间，称体重时间不一致的问题实验室操作缺乏统一的技术规范染色体综合征侵入性产前诊断染色体综合征侵入性产

5、前诊断侵入性产前诊断的利与弊侵入性产前诊断的利与弊47, xy, +21主要参考文献：tabor a, et al. rct of amniocentesis in 4606 low risk women. lancet 1986;1:1287-93 全国妇幼卫生检测办公室的调查显示 2007-2009年全国产筛4097801人， 21三体高风险176130人， 产前诊断的93504人， 确诊为21三体胎儿6679例。产前诊断服务量不能满足需求产前诊断服务量不能满足需求 基于fish的产前诊断 优点：所需样本量少，检测周期短（24h-48h）。 缺点：价格昂贵，通量小。 基于定量 pcr的产前

6、诊断 优 点 ： 所 需 样 本 量 少 ， 检 测 周 期 短（24h）。价格便宜，通量大。 缺点：对于嵌合型21三体，定理pcr可能会出现假阴性，样本中母血的污染也会影响结果的判断。目前快速产前诊断方法的利弊目前快速产前诊断方法的利弊母体外周血含有游离胚胎母体外周血含有游离胚胎dna主要参考文献：fetal cf-dna detected via y chromosome。lo ym et al., lancet 1997母体血浆母体血浆dna的存在形式的存在形式分娩后母体分娩后母体cffdna快速降解快速降解lo et al. am j hum genet 1998; 62:768cff

7、dna半衰期16.3min，2h后检测不到 vs 母血胎儿细胞持续存在数年血浆血浆dna的高母体的高母体dna背景背景血浆母体 dna胚胎 dna20% 胚胎 dna母体母体dna高背景带来的检测难度高背景带来的检测难度血浆20% 胚胎 dna101121染色体染色体3体带来的微量体带来的微量dna变化变化 纯胚胎dna，唐氏与正常21号染色体的剂量变化：3 : 2 = 1.5 血浆dna中胚胎dna占20%时，唐氏与正常21号染色体的剂量变化：11 : 10 = 1.1 母体血浆dna中胚胎的dna一般占5%到30%，大多小于20% 唐氏与正常21号染色体的剂量变化大多 1.1 当胚胎dna

8、只占5%时，怀唐氏胚胎的母体血浆dna的21号染色体量理论上会增加2.5% 21号染色体只占全基因组的1.3%，检测1.3% 的全部dna的2.5%的增量要求非常高的精确度 荧光定量pcr（realtime pcr）的精确度（cv）在42% 数码pcr（digital pcr)的精确度（cv）在15% 第二代测序的精确度（cv）在0.5%第二代测序技术用于检测胚胎第二代测序技术用于检测胚胎染色体拷贝数变化染色体拷贝数变化采集母体血浆提取血浆dna制备测序文库在第二代测序仪上测序测得的序列与人的参考基因组比对并作统计分析 母血胎儿游离母血胎儿游离dna拷贝数检测技术平台拷贝数检测技术平台抽取外周

9、血 分离血浆文库制备 生物信息分析新一代测序l 自2008年以来医学遗传学国家重点实验室已经收集了700多份各类孕妇外周血桨，同时，所有样本均有金标准的核型分析数据。通过与北京贝瑞和康生物技术有限公司技术合作，成功地完成了其中401例样本的双盲检测，结果显示13、18、21、x、y五大染色体检测的灵敏度达到100%，特异性99%以上，处在国际领先水平。研究结果研究结果男性女性小计正常核型175175350（87.3%）trisomy 13123 （0.7%）trisomy 188412（2.9%）trisomy 21101828（6.9%）xo胎儿66（1.5%）xxx胎儿11（0.24%）x

10、xy胎儿11（0.24%）总计401401（100%）检测结果总结检测结果总结假阴性：0/28 = 0%假阳性：0/373 = 0%47,xy,+2126/46,xy24：z = 4.7746,xx,der(21;21)+21 : z = 9.59t21检测结果检测结果假阴性：0/3 = 0%假阳性：0/398 = 0%假阴性：0/12 = 0%假阳性：0/389 = 0%t13检测结果检测结果t18检测结果检测结果x/y染色体检测结果染色体检测结果假阴性假阳性xo：0% (0/6) 0.51%(2/395)xxx：0% (0/1) 0% (0/400)xxy：0% (0/1) 0% (0/400) 非侵入性，避免流产，感染等风险，降低孕妇心理担忧非侵入性，避免流产，感染等风险，降低孕妇心理担忧 高灵敏度，高特异性高灵敏度，高特异性 检测周期短检测周期短5天天 通量大，质控容易通量大，质控容易合作单位合作单位