第八章：蛋白质的结构和功能(12学时)

1、第八章：蛋白质的结构和功能（12学时）第一节：活性蛋白质与前体（pp277-285）例如： 酶原 Þ 蛋白酶；激素原 Þ 激素，或者：前激素原 Þ 激素原 Þ 激素一、 激素与激素原（pp277-279）1 提取和确定前体的方法：前体不表现生物活性，活性测定的方法无效。免疫复合物提取法（主要方法，例如胰岛素前体的提取），步骤如下： 制备抗激素抗体：以激素作为抗原，注射到实验动物体内，待动物产生相应的抗体后，抽取血清，提取具有交叉反应性的抗激素抗体。 找出无活性的蛋白质：利用激素原能和“抗激素抗体”形成免疫复合物的特性，将抗激素抗体与产生激素的腺体的组织匀

2、浆混合，分离提取免疫复合物，找出无活性的蛋白质，即为可疑的激素原。 鉴定激素原：对这种无活性的蛋白质测序，与相应的激素的一级结构对比，就能推断是不是该激素的前体。重组DNA译码法：例如“前脑啡肽原”的确定2 前体与激素在一级结构方面的关系：见227页表8-1。前体部分序列与激素相同，或者说，激素的序列包含在前体的序列之中。胰岛素与前体1 胰岛素的分布、功能和来源：主要作用于肝、肌肉、脂肪组织，参与糖代谢，有平衡血糖的作用。作为糖尿病的特效药，在临床医学上广为应用。胰岛素原由胰腺中胰岛细胞产生。2 胰岛素的活化过程：（见278页图8-1和8-2）前胰岛素原：信号肽B-链C-肽链A-链（105肽）

3、 ß 信号肽酶 ß 切下 信号肽（24肽）胰岛素原：B-链C-肽链A-链（81肽） ß 类胰蛋白酶+类羧肽酶 ß 切下 Arg31, Arg32, Lys59, Arg60和C链胰岛素：胰岛素（A-链+B-链）（21肽+30肽）3. C肽的作用： 便于生物合成； 利于二硫键正确配对。4. 信号肽的作用：在新生肽链的传送过程中起识别和导向的作用。脑啡肽与前体1 脑啡肽的分布和功能：脑啡肽存在于脑区，与脑细胞的专一性受体结合，对机体具有强烈的镇痛作用。2 脑啡肽的种类：甲硫脑啡肽：Tyr-Gly-Gly-Phe-MetC端为甲硫氨酸；亮脑啡肽：Tyr-Gly

4、-Gly-Phe-LeuC端为亮氨酸。3 前脑啡肽原的一级结构特征：（见280页图8-3）全长267个氨基酸残基（人体）；信号肽段1个：位于124；甲硫脑啡肽(MEK) 4个：位于100104、107111、136140、210214；亮脑啡肽（LEK）1个：位于230234；甲七肽（MEK-RK）1个：位于261267； 甲八肽（MEK-RGL）1个：位于189193； 酶切位点（配对碱性残基）：三种（Lys-Arg；Lys-Lys；Arg-Arg），12个。4 脑啡肽结构与功能的关系：Tyr1：以甲氧基取代酚羟基，失去活性；前面加一个Arg，活性下降；Gly2：改为D-Ala（D型丙氨酸）

5、，则镇痛作用大大提高；Gly3：为活性必需的，不能被取代；Phe4：可被Trp或者N-CH3-Phe取代；但不能被Tyr和Leu取代；Met5：去除则活性下降；延长一个Thr，则活性不变。二、 酶与酶原（pp279-283）1. 体内蛋白酶的来源和功能： 胃和胰脏：产生消化食物蛋白质的酶； 血液：产生导致血液凝固的蛋白酶。2. 酶原的概念：酶的前体，含有酶的一级结构的氨基酸残基序列，但是由于多余肽段的存在，没有形成活化中心的立体结构（功能域），因而不具有催化活性。在生理活动需要时，在其他酶和/或因子的作用下，切去多余的肽段，形成酶。3. 10种酶原激活的条件和过程：见281页，表8-2。胰凝乳

6、蛋白酶原的激活1激活过程：（282页，图8-4）胰凝乳蛋白酶原：单链，245肽，5对二硫键 ß 胰蛋白酶 ß Arg15Ile16之间切断-胰凝乳蛋白酶：双链，15肽+230肽，酶活性最高，但不稳定 ß -胰凝乳蛋白酶（自身激活）切开三处 ß释放2个2肽:Ser14-Arg15；Thr147-Asn148-胰凝乳蛋白酶：三链：A链、B链、C链，稳定，但活性较低2活化中心的形成：（催化部位变化不大，结合部位从无到有） 催化部位（Asp102、His57、Ser195）：酶原和酶的分子构象非常相似，活化中心的催化部位具有相同的取向（282-283页，图8-5

7、 A. 和 B.）。结合部位（189192位口袋）：是酶原中不存在的 (283页图8-6）。胰凝乳蛋白酶结合部位形成的机理：l Ile16氨基质子化：15-16切开后，Ile16与Asp194羧基形成离子键。l 形成“口袋”结构：上述离子键的形成，引起一系列的构象变化：- Met192从酶分子内部转移到分子表面，暴露疏水侧链；- Gly187和Gly193伸展，形成疏水“口袋”，可与底物结合；- Ser195和Gly193的亚氨基也与底物羰基氧形成氢键。胰蛋白酶原的激活1 激活过程：（284页，图8-7）（提前教室画图） 激活的地点：来自胰脏，在12指肠激活。 过程：在肠激酶或者胰蛋白酶的催化

8、下，切下N端6肽。2 连锁反应：（284页，图8-8）（提前教室画图）三、 两类前体的不同功能（pp283-285）表 两类前体功能和结构的比较前 体前激素原/前酶原激素原/酶原多余肽段的生理作用：信号肽：起识别和向导作用，将新生肽输送到内质网，信号肽切除后，肽段进入储存场所分泌颗粒。多余肽段：起阻碍活化中心或者活性肽形成的作用，是酶的无活性储备形式，接受生理功能调节。多余肽段的结构特征：信号肽：数目：1个；位置：多肽链的N端；长度：1530个残基；残基：很强的疏水性。多余肽段：数目：1至多个；位置：末端或肽段的中部；长度：或长或短；残基：切口处常有Arg,Lys第二节：血红蛋白的结构与功能（

9、pp285-299）一、 概述（pp285-285）1.分布及功能存在于人和脊椎动物的红细胞中，是O2和CO2的运载工具。2.学科发展史上的贡献在结构和功能关系的研究上，它是研究得最清楚的蛋白质。3.血红蛋白的种类和亚基的组成HbA：22在成人体内为主要成分，占95% 以上；HbA2：22在成人体内为次要成分，占2 % 左右；HbF：22是胎儿的主要血红蛋白。二、 血红蛋白的分子结构（pp285-291）血红蛋白一、二、三、四级结构1.一级结构特征：（以HbA为例）见286页的图8-9链和链有60处氨基酸残基是相同的，占42 %；链和链与肌红蛋白有23处相同，占16 %；2.二、三级结构：链和

10、链与肌红蛋白三者的构象高度相似，走向相同（见图8-11）；三者的差异见288页表8-4（以肌红蛋白作标准）。3.四级结构：（见288页的图8-1）四聚体结构：为四面体排布（二面体对称），体积：6.4×5.5×5 nm。亚基的接触：分为两种l 1/1或者（2/2）：两条链之间有34个残基的接触，共形成17-19个氢键，接触面积较大，形成一个稳定的二聚体，不受O2结合作用的影响；l 1/2或者（2/1）：两条链之间只有19个残基的接触，接触面积较小，受O2结合作用的影响。能把两个二聚体联系成为一个四聚体。脱氧血红蛋白的亚基间的离子键（见289页的图8-13）：总共8个l 1与2

11、之间的离子键：两个末端离子键，两个链间的离子键；l 1或者2的各自链内离子键一个，共两个；l 1与2之间离子键一个；l 2与1之间离子键一个。这种四聚体对氧分子的亲和力低于亚基，也低于氧合血红蛋白。脱氧血红蛋白亚基与DPG间的离子键（见290页的图8-14）：共6个l DPG：是2,3-二磷酸甘油醛的简称，位于四聚体的中央空穴中。l 离子键：DPG带负电荷，与1和2上六个（每链三个）带正电荷的基团形成离子键。l 作用：使脱氧血红蛋白四级结构更加稳定，降低对氧分子的亲和力。血红素、原卟啉、铁原子（见212页 图6-24提前画图；291页 图8-15）1.血红素：位于各亚基的疏水性空穴中，由一个原

12、卟啉和一个铁原子组成。2.原卟啉：由4个吡咯基构成，呈扁平状，铁原子位于中央。3.铁原子：通过2个共价键和2个配位键与原卟啉的4个氮原子相连，另外还能形成2个具有非常重要生物功能的配位键，称为第5配位键和第6配位键。血红素与珠蛋白的结合、氧分子的结合位（291页 图8-15）血红素与珠蛋白的结合依靠来自E和F螺旋上的E7和F8位上的两个组氨酸：1. 第5配位键与F8组氨酸的相连：F8位上的组氨酸距离血红素较近，直接以配位键与铁原子相连；2. 第6配位键与E7组氨酸的相连：E7位上的组氨酸距离血红素较远，不能直接与铁原子相连，因此在两者之间形成了一个空间；3. 氧分子的结合位：上述的空间就是氧分

13、子的结合位。氧分子在这个位置上的结合是一种可逆的结合过程。4. 疏水性空穴：水分子可以障碍氧分子的结合。为了防水，珠蛋白为血红素构筑了一个防水的空穴。三、 血红蛋白对氧分子的结合（pp291-292）1 结合状态的决定因素：血红蛋白与氧分子的可逆结合主要取决与血液中的氧分压（PO2）：在肺部，氧分压高：Hb + 4 O2 Þ Hb(O2)4；在组织，氧分压低：Hb(O2)4Þ Hb + 4 O2式中Hb成为脱氧血红蛋白；Hb(O2)4 称为氧合血红蛋白（有时简写为HbO2）。每个血红蛋白有四条肽链，故可以与四个氧分子结合。2 铁原子的变价：在血红蛋白分子中，铁原子可以有二价

14、与三价的变化：在Hb中，铁原子为亚铁：Fe2+；在Hb(O2)4中，铁原子为三价铁：Fe3+。3 血红蛋白氧饱和度（Y）：4 血红蛋白的氧结合曲线（氧解离曲线）：坐标系：PO2为横坐标；Y为纵坐标：最低值为0%，即全部为脱氧血红蛋白，最高值为100%，即全部为氧合血红蛋白。特征：肌红蛋白为双曲线型，血红蛋白为S型（见292页 图8-16）。四、 血红蛋白的变构效应（pp292-293）1 变构效应的概念：变构效应（allosteric effect）指的是：在蛋白质分子中一个亚基由于与配子体（例如氧分子）的结合，导致亚基的构象发生变化，随之引起相邻亚基的构象和功能发生改变的现象。许多蛋白质和酶

15、都具有变构效应。2 血红蛋白的变构效应：书上的Adair模型的推导过程请同学自己看，不作要求。模型要点是： 血红蛋白的4个亚基（或者4个氧结合位）之间有协同作用； 这种协同作用使结合常数K1 < K2 < K3 < K 4，换句话说，对氧分子的结合，一个比一个更容易，具体就表现为这种S型曲线； 在血红蛋白分子中，-亚基首先与氧分子结合，氧分子引起-亚基构象变化。这种构象变化使相邻的-亚基的构象随之发生变化，排除了-亚基氧分子结合部位的空间障碍，提高了-亚基对氧的亲和力。五、 血红蛋白的变构过程（pp293-295）是实际测量结果加上推断得出理论假说。1铁原子和血红素的变化：

16、原子半径的变化：在血红素中，铁原子由于其电子所占外层轨道的不同，而有高自旋和低自旋两种状态。在脱氧血红蛋白中，铁原子处于高自旋状态，半径大；在氧合血红蛋白中，铁原子处于低自旋状态，半径小。 血红素构象的变化：（参见294页图8-17）在脱氧状态，由于铁原子半径大，不能嵌合在卟啉环的中央小孔，而偏离原卟啉平面0.06 nm；当O2与Fe2+结合时，铁原子由高旋状态变成低旋状态，半径缩小13 %，于是铁原子移动0.06 nm，进入原卟啉的中央小孔，并且牵动了F8 His向原卟啉平面的位移，从而引起蛋白质分子的构象发生变化。2亚基三级结构的变化：F8 His向原卟啉平面的位移，引起亚基三级结构的变化

17、包括： F螺旋、EF拐角、FG拐角发生位移（见294页 图8-18）； F螺旋与H螺旋之间的空隙变小（见296页 图8-21），使位于该空隙的HC2 Tyr的酚基排出空隙之外； 导致与相邻亚基相连的离子键断裂（见296页 图8-21）。3四级结构的变化： 11二聚体与22二聚体之间相对位置旋转15 o，平移0.08 nm； 2相对于1旋转了13.5 o：2的AspG1(99)与1的TyrC7(42)之间的氢键消失，而新建2的AsnG4(102)与1的AspG1(94)之间的氢键（295页 图8-21）； 两个亚基之间的空隙变小，挤出了DPG分子，两个亚基之间的离子键全部断裂； 上述变化进一步使

18、维持四级结构所有的离子键都断裂； 血红蛋白分子由紧密的T构象转变成松弛的R构象，对O2亲和力提高； 亚基的构象变化，使对氧分子结合的空间障碍（E11Val）消失，亚基也与氧结合。六、 S型氧合曲线的生理意义（pp295-296）1 血液流经肺部时：肺部氧分压相对较高，但是受环境气压的影响较大。即使O2分压从100毫米汞柱降至80毫米汞柱（例如从平原进入高原地区），由于S型曲线上部较为平坦，血液的氧饱和度并不受很大的影响，氧饱和度仅下降2 %（从0.95降至0.93），血红蛋白仍然能够保证充分的摄氧能力。2 血液流经组织时：进入了解离曲线的中段，氧分压从40毫米汞柱降至20毫米汞柱，血液的氧饱和

19、度随之下降30 %（从0.60降至0.30），保证了血液在流经氧分压低的在组织时，即使氧分压仅有较小的变化，氧合血红蛋白的解离也有明显的增加，从而释放出更多的O2，保证组织需要。七、 影响血红蛋白氧亲和力的因素（pp296-299）氧亲和力：指的是血红蛋白对氧结合的牢固程度，表示为PO250，含义是血红蛋白中的氧达到半饱和程度所需要的氧分压。氧亲和力越高，血红蛋白与氧分子的结合越牢固，则释放给给组织的氧就越少；反之越低，组织就能得到更多的氧供应。影响血红蛋白氧亲和力的因素有：H+、CO2、DPG等浓度，Hb的变异。1 质子（H+）和二氧化碳（CO2）的影响1 波尔效应（Bohr effect）

20、：质子浓度 Ý 和二氧化碳分压 Ý，能够降低血红蛋白对氧分子的亲和力，促使氧解离曲线右移（297页 图8-22）。2 波尔效应（Bohr effect）的生理意义： 当血液流经组织时：与血液相比，组织的pH值较低，CO2分压较高，曲线右移，因而有利于氧合血红蛋白释放O2，同时O2的释放又促进了脱氧血红蛋白分子与H+ 和CO2 的结合； 当血液流经肺部时：由于肺气泡的O2分压较高，促使脱氧血红蛋白分子释放H+ 和CO2。CO2的呼出，曲线左移，有利于氧合血红蛋白的生成。3 波尔效应（Bohr effect）的发生机理： H+ 有助于离子键形成：l H+ 与链N末端Val的NH

21、2结合：生成正电基团NH3+，后者再与另一个链的C末端的COO 结合形成离子键；l H+ 与链His146的咪唑基结合：生成带正电荷的基团，后者再与同一条链上的Asp94的侧链COO 结合形成离子键； CO2也有助于离子键形成：l 与N末端的NH2发生可逆反应，生成H+ 和RNHCOO；l 后者可与82 Lys和141 Arg的正电基团生成离子键 这些离子键增加了脱氧血红蛋白的稳定性，从而降低了对氧的亲和力。2,3-二磷酸甘油酸（DPG）的影响1 DPG的来源和特征：DPG是一种有机磷酸酯，是红细胞中糖酵解支路的产物。DPG分子量虽然不大，但是带有高密度的负电。2 DPG的右移作用：DPG能够

22、稳定脱氧血红蛋白的四级结构，降低后者对氧分子的亲和力，使血红蛋白的氧合曲线右移（见298页 图8-23）。3 DPG的右移作用的发生机理：脱氧血红蛋白分子的中央空穴较大，可以容纳1个DPG分子。在氧分压低的组织中，DPG与血红蛋白的结合能力大于O2，同时在血红蛋白中DPG又与O2是互不相容，这样在血红蛋白与DPG结合的同时，就必须释放O2；而另一方面，与DPG的结合使得血红蛋白四级结构更加稳定，使血红蛋白对O2的亲和力进一步降低。4 DPG的生理作用： 当血液流经O2分压低组织时：红细胞中的DPG能促进氧合血红蛋白释放更多的O2，以满足组织对O2的需要。DPG的浓度越大，则释放的O2越多。故D

23、PG浓度变化是调节血红蛋白分子对O2亲和力的重要因素； 在有呼吸困难时：例如在空气稀薄的高山上的人，或者有换气困难的肺气肿病人，其红细胞中的DPG浓度都会代偿性增加，使为数不多的氧合血红蛋白分子尽量地释放O2，以满足组织对O2的需要。 胎儿红细胞中的DPG：胎儿红细胞中血红蛋白主要是HbF（22），HbF对O2的亲和力比HbA高，这使胎儿血液流经胎盘时，HbF能从胎盘的另侧母体的HbA夺取到O2。其原因是链的143位是丝氨酸而不是组氨酸，故而HbF结合DPG的能力弱，因而对O2亲和力高。第三节：分子病（pp299-305）一、 概述（pp299-300）1 分子病（molecular dise

24、ase）：这一名词常用来称呼蛋白质一级结构的氨基酸序列与正常有所不同的遗传病。病因是DNA分子上的基因突变，机体合成了失去正常活性的异常蛋白质，或者是缺失了某种蛋白质，影响了机体的正常生理功能，而产生的疾病。由于病因是基因的突变，故分子病可以遗传。2 基因突变的类型： 单个碱基取代； 一个或多个密码子的嵌入或缺失； 基因的连接； 终止密码子的变异等3 异常血红蛋白：单个碱基取代：目前发现的异常血红蛋白绝大多数是第一种类型，即单个碱基的取代。单个碱基引起蛋白质异常的机理如下：按照蛋白质生物合成的翻译机理（A-U、G-C、C-G、T-A配对）：DNA所含的A、G、C、T（腺、鸟嘌呤；胞、胸腺嘧啶）

25、；mRNA 所含的U、C、G、A（尿、胞嘧啶；鸟、腺嘌呤、）。mRNA中四种核苷酸，三个一组相连，可以排列组成64种三联密码子。64个密码子中61种对应于20种不同的氨基酸（每种氨基酸，少则对应1种密码子，如蛋氨酸AUG、色氨酸UGC；多则对应6种密码子，如精氨酸、亮氨酸），如果三联密码子中某个碱基被取代，就有可能翻译出不同的氨基酸，造成蛋白质一级结构的错误（见2-4页 表1-1，第5列）。举例：参见299页 图8-24：（提前画表）异常Hb正常链异常链位置DNAmRNAAADNAmRNAAAHbS6CTTGAAGluCATGUAValHbC6CTTGAAGluTTTAAALysHb Siri

26、raj7CTTGAAGluTTTAAALysHbE26CTTGAAGluTTTAAALysHb Ms63GTACAUHisATAUAUTyrHb N95TTTAAALysCTTGAAGlu其它突变类型：还可以见到一个或多个密码子的嵌入或缺失等等情况。4 异常血红蛋白的分类： 改换分子表面：取代发生在分子的表面，绝大多数无害（HbS等例外）； 改换活性部位：变异发生在血红素附近，影响对氧的结合； 改换三级结构：多肽链失去正常构象，结构不稳定； 改换四级结构：在亚基之间界面上的突变，常具有异常的氧亲和力。二、 分子表面突变的血红蛋白镰刀状红细胞贫血症（pp300-302）1 概况：暴露于血红蛋白（

27、HbA）分子表面是极性的氨基酸残基。在人类以及各种动物的血红蛋白之间，分子表面的氨基酸残基有显著的差异。说明这部分的氨基酸容易变异，它们对于血红蛋白的功能是不重要的。已经发现的100多种在分子表面发生氨基酸取代的异常血红蛋白，绝大多数是无害的。只有一小部分，例如：HbS、HbC、HbE、HbI、HbK等可以引起临床症状。2 镰刀状红细胞贫血症： 分布及危害：镰刀状红细胞贫血症在非洲黑人中流行。因为红细胞中含有HbS血红蛋白，使病人的红细胞呈镰刀状，而不是正常的扁圆形（见300页 图8-25）。镰刀状红细胞极易破碎，寿命短，造成严重的贫血，危及生命。遗传学分析表明，患者若为纯合子（HbS/HbS

28、），其红细胞中HbS含量高达95%以上，患者很难活到成年；患者若为杂合子（HbS/HbA），红细胞中HbS含量约为35%，临床症状不严重，不危及生命，但能将疾病的基因传给下一代。 HbS与HbA一级结构的差异：如上表所述，决定6位氨基酸的mRNA的三联密码子由GAA变成了GUA，（DNA中：CTT变成了CAT；），使得氨基酸由Glu变成为Val。 HbS与HbA三级结构的差异：相同点：6位氨基酸都位于分子表面；不同点：在HbS中6位氨基酸疏水侧链不带电荷，HBA中6位氨基酸侧链带负电荷。使脱氧HbS在红细胞中的溶解度大大降低。 亚基6位粘斑和血红蛋白纤维的形成：在HbS中6位氨基酸疏水侧链起到

29、了粘斑的作用（301页 图8-26），使得HbS分子可以形成细长的聚合体，即一股螺旋纤维。几股螺旋纤维进一步缠绕在一起，就形成了直径为17nm和21.5 nm的两种纤维（302页 图8-27）。它们使红细胞变成了镰刀形，而这种细胞就容易破碎，导致贫血，最后危及生命。三、 活性部位突变的血红蛋白HbM病和CHBHA病（pp302-303）先天性青紫症（HbM病）1 HbM病的分布和危害：HbM病发现于世界各地区和各种种族。在HbM的四聚体中只有半数的血红素可以与O2结合，结果产生组织供氧不足，导致临床上的先天性青紫症状，以及继发性的红细胞增多症。2 HbM的分类：分为以下五种类型表8-6 血红蛋

30、白M的类型 血红蛋白名称氨基酸的取代氧亲和力波尔效应M BostonTyr®58(E7)His降低降低M IwateTyr®87(F8)His降低降低M SaskatoonTyr®63(E7)His正常存在M Hyde ParkTyr®92(F8)His正常存在M Milwaukee-1Glu®67(E11)Val降低存在3 HbM病的发病机理（见303页 图8-28）： 酪氨酸Tyr对E7和F8 His的取代：见于前四种HbM病。由于Tyr残基的负离子（一O）与血红素的Fe 3+ 构成了离子键，从而使血红素固定在高铁（Fe 3+）状态，受影响

31、的血红素丧失了与氧结合的能力。 谷氨酸Glu对67 (E11) Val的取代：见于最后一种HbM病。67 (E11) Val与63 (E7) His非常接近，相距4个残基，这在螺旋上大致相当于转了一圈，因此两者指的方向相同。由于Glu带负电荷，它也能与血红素的Fe 3+ 构成了离子键，从而使血红素固定在高铁（Fe 3+）状态，受影响的血红素丧失了与氧结合的能力。CHBHA病的发病机理（见290页表8-5和304页 图8-29）：CHBHA病又称为“先天性亨氏小体溶血性贫血症”。与血红素接触的氨基酸残基都位于血红素空穴的周围，这些残基绝大多数都是非极性的残基，非极性残基与血红素互相作用，可以将血

32、红素固定在该空穴之中，这对于血红蛋白的功能是必需的。如果上述残基被极性残基取代，可以使血红素脱离血红蛋白，不能携带氧分子，失去血红蛋白的功能。而没有血红素的珠蛋白也会发生变性、沉淀形成所谓的“亨氏小体”，故这一类的分子病又称为“先天性亨氏小体溶血性贫血症”。四、 三级结构突变的血红蛋白（pp303-304）1 残基被脯氨酸Pro取代，造成三级结构的破坏：Pro是螺旋的破坏者（参见200页上）。如果脯氨酸取代了螺旋段中的氨基酸残基，则血红蛋白的三级结构就会遭到破坏，从而产生不稳定的血红蛋白和CHBHA。例如：Hb Duarte是62 (E6) 的Val被Pro取代所致；Hb Genoa是28 (

33、B10) 的Leu被Pro取代所致。2 残基的缺失，造成三级结构的破坏：许多种不稳定的血红蛋白，由于多肽链关键部位缺失一个或多个氨基酸残基，从而使螺旋和肽链的构象受到破坏，导致血红蛋白的稳定性下降，丧失了结合O2的能力。例如（见304页 图8-30）：Hb Freiburg是由于23 (B5) 缺失所致；Hb Gun Hill是由于9195 (即F7FG2)缺失所致。五、 四级结构突变的血红蛋白（pp304-305）1 亚基之间界面上的相对位移：在正常情况下，在氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白互相转变时，血红蛋白的四级结构会发生改变，包括12（或者21）的接触处两条肽链发生明显的前后位移（见295页

34、 图8-20）：l 在脱氧状况下：99 (G1) Asp与42(G7)Tyr之间形成一个氢键；l 在氧合状况下：102 (G4) Asn与94(G1)Asp之间形成一个氢键。当这一个氢键形成时，另一个就破坏；另一个形成时，这一个就破坏。维持了血红蛋白四级结构构象的稳定。如果相关的残基被取代，会引起血红蛋白变构效应的丧失，出现异常的氧亲和力（升高或降低）。2 99 (G1) Asp被取代：如果99 (G1) Asp被取代，将会破坏脱氧状态构象的稳定性，氧亲和力升高。属于这类的突变血红蛋白有：l Hb Yakima：His 99 (G1) Asp；l Hb Kempsey：Asn 99 (G1)

35、Asp；l Hb Radcliffe：Ala 99 (G1) Asp；3 102 (G4) Asn被取代：如果102 (G4) Asn被取代，将会破坏氧合状态构象的稳定性，氧亲和力降低。属于这类的突变血红蛋白有：l Hb Kansas：Thr102 (G4) Asn。第四节：蛋白质的进化（pp305-313）一、 蛋白质分子进化的一般规律：（pp305-306）1 突变理论：蛋白质是DNA基因表达的产物。结构基因的突变会导致蛋白质分子的变异。 自然选择的淘汰：如果变异有损于蛋白质的生物功能，则有关的生物个体就受到自然选择的淘汰，得不到延续； 物种的进化：如果变异有助于蛋白质的生物功能的改进，或

36、者新的功能的产生，就有可能促成物种的进化； 中性突变：在更多的情况下，蛋白质的生物功能不受影响，则这种突变可以得以遗传，称为中性突变。2 同源蛋白：指的是：由共同的祖先蛋白质分子经过变异和自然选择而产生的功能上相同、相关、甚至不同，但是结构上有某种程度相似性的不同蛋白质。例如血红蛋白与肌红蛋白就是同源蛋白（结构相似，功能相关）。3 同源蛋白的进化趋势： 功能完善：使蛋白质所具备的功能得以保全，并得以完善； 功能异化：使蛋白质产生新的功能。功能异化是蛋白质进化的普遍现象。4 守恒氨基酸残基（严格守恒）：指的是：在生物进化过程中，始终保持不变氨基酸残基。守恒氨基酸残基一般与蛋白质分子的生物功能保持

37、密切的关联。尤其是与活性部位（包括与金属辅基或辅酶相结合的位置）构象有关的氨基酸残基均不会发生改变，这是维持蛋白质生物功能的基本条件。5 疏水核疏水性的守恒（相对守恒）：蛋白质分子的疏水核，其疏水作用对维持蛋白质分子的构象有重要的作用，因此在进化过程中，疏水核中的个别残基可以置换，但疏水性是守恒的。6 蛋白质分子表面的变异（相对易变）：由于分子内部的氨基酸残基通常对维系三维结构比较重要，因此变异较多发生在蛋白质分子表面上。在同源蛋白的进化过程中，氨基酸残基之间的置换有下列规律：残基侧链的大小、形状、柔性、电荷、氢键形成能力等越近似，则置换越容易发生。例如：Lys被置换为Arg；Ile被置换为L

38、eu等等。二、 细胞色素C分子的进化（pp306-313）细胞色素C一级结构的种族差异1 用细胞色素C分子研究进化的优势： 分布广泛：细胞色素C是生物界中广泛存在的一种古老蛋白质，从细菌到人，一切需要氧的生物体中都有细胞色素C存在。 结构简单：细胞色素C分子结构比较简单，大小合适，容易纯化、结晶，结构测定比较方便。现在，已经测出近100种生物的细胞色素C一级结构。2 细胞色素C一级结构的种族差异： 多肽链残基数目的差异：脊椎动物：104个（个别103个）昆虫：108个在N端增长了4个植物：111114个（一般为112个）在N端增长了58个 一级结构残基改变数与亲缘关系（见306页 表8-7）：

39、以人为例人与黑猩猩：完全相同；人与恒河猴：相差一个残基；人与马：相差12个残基；人与乌龟：相差15个残基；人与金枪鱼：相差21个残基；人与蚕蛾：相差31个残基；人与小麦：相差43个残基；人与面包酵母：相差45个残基； 生物进化树：Dickerson等人根据各种生物的细胞色素c一级结构的差异和相同性，绘制出生物界的进化树（evolutionary tree），与生物分类学所绘制的进化树是一致的。细胞色素C三级结构的保守性从表8-7中发现，在不同物种的细胞色素c一级结构中，有26个位置的氨基酸残基是完全不变的（守恒残基）。这些守恒残基分散在多肽链的各个部位。在分子进化过程中，细胞色素c的一级结构虽

40、然有较大的变化，但是三级结构基本上保持不变（见312页 图8-32）。1 血红素结合位（功能域）的严格保守性（312页 图8-32）：血红素是细胞色素c分子的电子传递中心，在生物进化中保持不变。 Cys14和Cys17的S原子与血红素的乙烯基共价相连； Met18的N原子和Met80的S原子与血红素的Fe原子配位键相连； Tyr48和Trp59与血红素的丙酸基以氢键相连。2 血红素疏水环境的严格保守性（表8-7）：70-80位11个残基参与形成血红素的疏水环境，都是守恒残基。3 多肽链转弯处的严格保守性： Pro (30, 71, 76)； Gly (29, 34, 45, 77, 84)。4

41、 环狭缝疏水基团的保守性取代：环绕狭缝的16个疏水残基：Leu (32, 35, 64, 68, 94, 98) 6个；Ile (81, 85, 95) 3个；Pro (30, 71) 2个；Phe (10, 46) 2个；Tyr (48, 67) 2个；Trp (59) 1个。双下画线为守恒残基；单下画线为保守性取代残基。所谓保守性取代指的是：化学性质相似的氨基酸残基之间的互相置换现象。例如：l Leu与Ile；l Val与Ile；l Phe与Tyr；5 电子传递通道的守恒残基：血红素与环境之间有两个通道，其中左通道由5274肽段组成，是电子的传递通道，其中Trp59, Tyr67, Tyr

42、74是3个疏水守恒残基。第五节：蛋白质变性（pp313-326）一、 概述（pp313-315）引起变性的因素：1 化学因素：包括：酸、碱、有机溶剂（如：乙醇、甲醇、丙酮、乙醚）、尿素、盐酸胍、SDS、三氯乙酸、磷钨酸、水杨酸等等；2 物理因素：包括：热、紫外线、X射线、超声波、高压、表面张力、剧烈的振荡、研磨、搅拌等等。变形现象：变性蛋白有下列表现1 物理性质的改变：包括 溶解度下降，凝集、沉淀； 失去结晶能力； 出现流动双折射现象； 特性黏度增加； 旋光值和椭圆度的改变； 荧光光谱发生变化。2 化学性质改变：包括 消化率提高：在变性前不易被水解，但变性后，水解部位增加，加快。 内部基团暴露

43、：变性后，埋藏在分子内部的基团暴露到了分子的表面。从而变得可以与某些试剂发生反应了。3 生物性能的改变：包括 抗原性质的改变：抗体失去与专一抗原结合的能力； 生物功能的丧失：例如，酶失去催化活性、激素失去生理调节功能等。4 天然蛋白质：没有发生上述变化的蛋白质，就是天然蛋白质。 狭义天然蛋白质：在体内条件下，具有呈现全部生物功能所需要的精确构象的蛋白质。 广义天然蛋白质：一般来说，关于蛋白质结构和功能的研究是在体外进行的，需要从体内分离提纯蛋白质。因此，把具有生物活性的离体蛋白质也称为“天然”蛋白质，并假定这种蛋白质的构象，完全类似于体内天然蛋白质的构象。广义天然蛋白质的概念用得更为频繁。变性

44、的概念1 变性的定义：由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失，以及物理、化学性质的异常变化。变性可以涉及次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构的断裂。2 变性的程度：变性的程度有大小之分：小的变性只引起很小的构象变化，以致于目前的实验手段都无法测量；大的变性可以用物理、化学的方法测量。蛋白质变性的鉴定方法1 测定蛋白质的比活性：用几种方法提纯的蛋白质，若得到相同的比活性，就可认为，此蛋白质制剂是天然蛋白质。比活性可以追踪纯化蛋白质变性程度。2 测定蛋白质的物理性质： 观察蛋白质的溶解度是否下降，是否凝集、沉淀； 以天然蛋白质作对照，测定蛋白质的物理性质

45、。例如：a用旋光法测定蛋白质的旋光度的变化；b用圆二色法测定蛋白质的椭圆度变化；c以紫外差示光谱法测定蛋白质消光系数的变化；d以粘度法测量蛋白质溶液的特征粘度变化；e以电泳法测定蛋白质的电泳迁移率的变化等。3 测定蛋白质的化学性质：例如：测定蛋白质分子中某侧链基团与专一性试剂反应的数目，观察参加反应的侧链基团数目有无增加；测定蛋白质的水解速度，看蛋白质被水解的速度有无增加。4 测定蛋白质的抗原性：用免疫法测定蛋白质的抗原性是否改变，抗体能不能与抗原专一性结合。5 测定方法的综合应用：检查蛋白质变性的情况往往要采用多种方法，最后观察其综合结果，才能得到确切的结论。变性研究的重要意义：1 掌握变性

46、条件，防止产生变性：大多数从事该领域研究的人，都希望认识和掌握变性条件，以得到高活性的蛋白质和酶制剂。2 利用变性条件，研究亚基特征：例如：亚基的拆离和亚基分子量的测定。3 利用变性过程，研究各种作用力：例如：维持二级、三级、四级结构的作用力；研究各种作用力在活性部位上的作用。二、 变性和复性（pp321-325）可逆变性和不可逆变性1 概念： 可逆变性：除去变性因素之后，在适当的条件下，蛋白质构象可以由变性态恢复到天然态的变性，称为可逆变性； 不可逆变性：除去变性因素之后，蛋白质构象不能由变性态恢复到天然态的变性，称为不可逆变性。2 可逆变性的实验依据：40年代之前，都认为蛋白质变性是不可逆

47、的，但是后来的实验研究表明，有些蛋白质的变性是可逆的。这些实验包括： 血红蛋白：多种方法所致的血红蛋白变性都可以设法使它复性，复性后的蛋白质的许多指标，如溶解度、结晶性质、特征光谱、对氧的亲和力等都与天然蛋白质一样。 RNA酶：在温和碱性条件下，由于巯基乙醇和8 mol/L脲的作用，发生了变性。二硫键全部断裂，肽链完全伸展，酶活性全部丧失。如果用透析的方法除去变性剂，并在O2存在的条件下，让二硫键重新生成，则酶的活性接近全部恢复，晶体的X射线衍射图谱，与天然晶体完全相同。 胰蛋白酶：在酸性溶液中，经过70100的热处理，便丧失活性和溶解性。如果适当冷却，仍然可以恢复原来的酶活性和溶解度。虽然，

48、上述例子证明了蛋白质变性是可逆的，但是为数很少，大多数蛋白质的变性是不可逆的。3 不能复性的原因：从理论上讲，大多数蛋白质的变性应该是可逆的。不少蛋白质之所以不能复性，主要原因是因为所需要的条件复杂，如：折叠所需要的辅因子、蛋白酶的彻底去除、解离和结合的条件、巯基的保护等等，未能掌握和满足。蛋白质的变性过程：1. 天然态（N）和变性态（U）：天然态：指的是天然蛋白质分子的构象，蛋白质的多肽链处于折叠状态；变性态：指的是变性蛋白质分子的构象，蛋白质的多肽链处于伸展状态。2. 中间态（I）：部分蛋白质的变性过程包含1个或多个中间态（中间构象状态）。例如：b-乳球蛋白，在盐酸胍作用下，其变性过程包含

49、一个中间态；磷酸化酶b，在尿素作用下，其变性过程包含2个中间态。3. 变性的可逆过程：天然态N（折叠态）ß 在某些变性条件下（变性）变性态U（伸展态）ß 在某些有利于天然态的条件下（复性）天然态N（折叠态）4. 变性过程的二态性（见322页 图8-37）：实验证明：在蛋白质的变性（伸展）过程中，肽单位要么呈充分折叠的状态（N），要么呈充分伸展的状态（U）；如果某蛋白质在变性过程中存在中间态（I），则中间态（I）存在的时间也是极为短暂，即所谓的“二态性”。例如：肽链的伸展百分数为50 %，这时的情况是：50 %的肽单位是处于充分伸展状态；余下的肽单位则是处于充分折叠状态。而不

50、是100 % 的肽单位同时处于半折叠构象状态。5. 变性过程的协同性：实验还证明：在蛋白质的变性过程中，在某一个折叠构象中，一旦任何一个肽单位发生变性，由折叠态变成为伸展态，都会导致这个折叠单位中其他肽单位也发生一致的变化。形象地说，蛋白质的变性过程好象“多米诺骨牌”的变化一样：具有“二态性”，也具有“协同性”。蛋白质的复性过程：蛋白质的复性过程（重新折叠）比变性过程（伸展）的动力学变化要复杂得多。1 复性的概念：当无活性的伸展的蛋白质处于有利于折叠的最适环境里，伸展的肽链会自动折叠成天然的折叠态，并恢复成天然的折叠态，并恢复全部的生物活性，称为复性。2 复性过程的择优性：虽然多肽链有能力采取

51、许多不同的构象，例如100个残基的多肽链可能形成10100个不同的构象，但是复性过程采取一种目前还不能解释的择优方式进行，复性过程具有恢复天然蛋白质的唯一构象的趋势。3 复性过程的步骤：复性过程通常包含二个或更多的步骤，过程较为复杂。和变性过程相同的是，可能包括1个或多个中间态（I）。但是，所有的中间态（I1，I2In）都不如伸展态（U）和折叠态（N）稳定。过程表达如下：U Û I1 Û I2 Û I3 In Û N4 中间产物的检测：并不是每个中间产物都可以积累到可以检测的水平，一般只有限速步骤之前的中间产物，才有可能积累到一定的水平，并被检出；即它的

52、形成速度常数大于消失速度常数。5 充分折叠的蛋白质：Baldwin等人的研究表明，蛋白质的充分折叠一般要经历两个或两个以上速度不等的的重新折叠步骤（根据速度的不同可以分为“快速重新折叠”和“慢速重新折叠”）；而充分折叠的蛋白质，总是以其中最慢步骤的速度形成（瓶颈效应）。6 造成慢速折叠的原因：只有肽键中所有异构态都与折叠态所要求的一致时，伸展的肽链才能重新折叠。而纠正错误构象的异构体的是一种缓慢的过程。 与脯氨酸Pro残基相邻的肽键的“顺反异构现象”； 其它错误构象的异构体（也有可能是先折叠，后纠正）。7 Uslow、Ufast 和 N态之间的平衡（323-324页，翻译有问题）要点：如果存在

53、这种既有慢速折叠，又有快速折叠的复杂过程，则只有一部分的变性蛋白质（伸展态）可以复性为天然蛋白质（重新折叠）。而在溶液中可以同时存在三种状态的蛋白质。捕获中间产物鉴定并分析中间产物是进行变性/复性研究的重要内容。常用的方法是加入二硫化物试剂（RSSR），使中间产物中还没有复性的Cys之间形成二硫键，这种陷阱可以使中间产物处于稳定状态。通过这种陷阱，我们可以捕获在不同的折叠时间，存在的具有不同二硫键数目的中间产物，并能够加以分离，测定中间产物二硫键的数目，以及其他的构象性质（325页 图8-40）。三、 各种变性因素对蛋白质构象的影响（pp315-321）1 温度1 热变性：由于加热而产生的蛋白

54、质变性，称为热变性。主要特点有： 变性温度：一般蛋白质放入5060的溶液，经过一定的时间，就可以发生热变性。但是也有例外，例如，在PCR反应中广泛应用的Taq DNA 聚合酶，其发挥活性的最适温度就是70，在80时也不变性。 可逆和不可逆热变性：热变性有可逆和不可逆之分，但是多数是不可逆的。不可逆热变性往往发生凝集和沉淀现象。可逆热变性的蛋白质构象虽然是相当无序的，但是还保留着一部分有序的结构区域。 对二硫键的影响：热变性可以导致多肽链中二硫键的断裂和二硫键之间的交换反应。特别是在碱性条件下，更是如此。 变性的范围：热变性一般只涉及次级键的变化。2 RNA酶的可逆热变性（见316页 图8-33）： 可逆变性条件：pH值：1.133.15，温度：070 。在这样的变性条件下，变性的蛋白质随着变性因素的排除，能够自动恢复到天然态（N）。 反映热变性程度的指标：是用紫外差示光谱法测定的“消光系数增值（）”。也可以用“特性粘度法”或者“旋光法”测定，结果相同。 变性规律：在相同的pH值条件下，变性程度随温度的升高而增大；在相同的温度下，变性程度随pH值的减小而增大。3 冷钝化：由于制冷所产生的蛋白质变性，称为冷钝