乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测

1、乙型肝炎病毒核苷乙型肝炎病毒核苷( (酸酸) )类似物耐药的监测类似物耐药的监测 缪晓辉缪晓辉2009.5p一、一、hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义p二、各种耐药检测技术的评价二、各种耐药检测技术的评价p三、需要重视的几个问题三、需要重视的几个问题一、一、hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义 p病毒学突破（病毒学突破（virologic breakthroughvirologic breakthrough） p病毒反跳（病毒反跳（viral reboundviral rebound） p生化学突破（生化学突破（biochemical breakthroughbiochemical

2、breakthrough） phbvhbv基因型耐药（基因型耐药（genotypic resistancegenotypic resistance） phbvhbv表型耐药（表型耐药（phenotypic resistancephenotypic resistance） p临床耐药（临床耐药（clinical resistanceclinical resistance） hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义 病毒学突破（病毒学突破（virologic breakthroughvirologic breakthrough）p指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清指在核苷类药物治疗过程中，患者的

3、血清hbv dnahbv dna水平一度被抑制，但在继续治疗中水平一度被抑制，但在继续治疗中血清血清hbv dnahbv dna水平与最低值相比上升或超过水平与最低值相比上升或超过1 1个个log10log10（1010倍）。倍）。hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义 病毒反跳（病毒反跳（viral reboundviral rebound）p指核苷类药物治疗过程中患者的血清指核苷类药物治疗过程中患者的血清hbv hbv dnadna水平一度被抑制，但在继续治疗中血清水平一度被抑制，但在继续治疗中血清hbv dnahbv dna升高至升高至2 210104 4iu/mliu/ml或高于治疗

4、前或高于治疗前水平。水平。 hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义 生化学突破（生化学突破（biochemical breakthroughbiochemical breakthrough）p指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（基转移酶（altalt）水平一度复常，但在继续）水平一度复常，但在继续治疗中血清治疗中血清altalt水平又再次升高。肝脏生活水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指指标很多，但是在此仅指altalt。hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义 hbvhbv基因型耐药（基因型耐药（genotypic resistanc

5、egenotypic resistance）p指指hbvhbv基因组中的某些位点发生改变，导致这种药基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对物对hbvhbv的抑制作用下降或消失。这种的抑制作用下降或消失。这种hbvhbv基因变基因变异与异与hbvhbv的耐药性有直接因果关系，通过这些变异的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断位点的检测可判断hbvhbv有无耐药性。有无耐药性。 hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义 hbvhbv表型耐药（表型耐药（phenotypic resistancephenotypic resistance）p通过体外细胞培养方法，直接测定通过体外细胞

6、培养方法，直接测定hbvhbv对某种药物的对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定敏感性，或者在体外直接测定hbvhbv聚合酶的活性，敏聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。药。p通常以通常以icic5050来评估来评估 icic50505 5倍倍: :敏感敏感 icic5050在在5 51010倍倍: :部分耐药部分耐药 icic5050 1010倍倍: :耐药耐药hbvhbv耐药的有关定义耐药的有关定义 临床耐药（临床耐药（clinical resistanceclinical resistance）p指临床出现病毒复

7、制不能被抑制，或指临床出现病毒复制不能被抑制，或hbvhbv复复制一度被抑制后又出现制一度被抑制后又出现hbv dnahbv dna反跳，同时反跳，同时伴有伴有altalt升高，或肝炎复发的其他临床证据。升高，或肝炎复发的其他临床证据。 二、各种二、各种耐药检测技术及评价耐药检测技术及评价p病毒学反跳或突破的监测病毒学反跳或突破的监测phbvhbv基因型耐药监测基因型耐药监测phbvhbv表型耐药检测表型耐药检测p临床耐药监测临床耐药监测病毒学反跳或突破的监测病毒学反跳或突破的监测p基于对血清基于对血清hbv dna载量的动态监测载量的动态监测p需重视以下三点：需重视以下三点： 1. hbv

8、dna载量检测手段的敏感性载量检测手段的敏感性 2.检测技术的可靠性和稳定性检测技术的可靠性和稳定性 3.监测的间隔时间监测的间隔时间hbvhbv基因型耐药监测基因型耐药监测p时机时机p非必须非必须p不主张常规、广泛应用不主张常规、广泛应用基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异基因型耐药相关变异在在hbvhbv多聚酶序列中的位置多聚酶序列中的位置hbvhbv基因型耐药的主要技术基因型耐药的主要技术p碱基序列分析法碱基序列分析法 直接测序直接测序 克隆测序克隆测序p聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(pcr-rflp)(p

9、cr-rflp)p反向杂交分析技术（反向杂交分析技术（innolipainnolipa）p基因芯片技术基因芯片技术 p实时荧光定量实时荧光定量pcrpcr技术技术 探针定点突变探针定点突变pcrpcr技术技术 引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术 熔解曲线法熔解曲线法 p基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)(maldi-tof ms)直接测序法直接测序法优点优点末端终止法末端终止法使用特异性引物与单使用特异性引物与单链模板链模板dnadna退火，在退火，在dnadna聚合酶作用下进聚合酶作用下进行延伸反应，用行延伸反应

10、，用ddntpddntp终止，用终止，用pagepage区分长度仅相差区分长度仅相差1 1个个核苷酸的核苷酸的ssdnassdna，从，从而完成测序的方法。而完成测序的方法。简便、迅速、应用广简便、迅速、应用广泛。泛。化学裂解法化学裂解法用化学试剂在用化学试剂在a a、g g、c c、t t处特定的裂解处特定的裂解dnadna片段，产生一片段，产生一簇各种长度的短链，簇各种长度的短链，经过经过pagepage放射自显放射自显影可直读影可直读dnadna顺序。顺序。不需酶促反应，可不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。以对寡核苷酸测序。dnadna测序自动化测序自动化类似末端终止法，所不同的类似末端

11、终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机是用荧光染料标记，计算机自动读出。自动读出。简便、快速、准确可靠。简便、快速、准确可靠。安全、无放射性污染。安全、无放射性污染。模板用量大大减少。模板用量大大减少。测序能力增强。测序能力增强。 hbv ymddhbv ymdd变异直接测序结果图谱变异直接测序结果图谱直接直接dnadna测序的局限性测序的局限性p1.1. 设备贵、技术高、耗材、费时。设备贵、技术高、耗材、费时。p2.2.必须有充足目的基因片段。必须有充足目的基因片段。p3.3.突变株比例小于突变株比例小于20%20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法

12、检测直接测序法检测hbv ymddhbv ymdd变异变异1.jpg1.jpg克隆测序法克隆测序法克隆测序法克隆测序法p优点：优点： 1.1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株 之间的相对比。之间的相对比。 2.2.提高了检测的灵敏度。提高了检测的灵敏度。p局限性：局限性： 1.1.技术难度较高。技术难度较高。 2.2.检测周期更长。检测周期更长。 3.3.检测的费用大大增加。检测的费用大大增加。 碱基变异可能导致：碱基变异可能导致： 原有位点消失原有位点消失 产生新的位点产生新的位点 识别位点移位识别位点移位 利用错配引物使利用错配引物使 pcr

13、pcr产物中产生产物中产生 特异的酶切位点特异的酶切位点结果结果: 酶切片段长、短变化和多、少变化酶切片段长、短变化和多、少变化限制性内切核酸酶的作用限制性内切核酸酶的作用它们能识别它们能识别dnadna的特异序列，并在识别序列内或其的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链旁切割双链dnadna。如：。如：nde inde i限制酶的识别序列和切割位点限制酶的识别序列和切割位点：-caca tatg-tatg-gtat ac-gtat ac-nla illnla ill限制酶的识别序列和切割位点：限制酶的识别序列和切割位点：-catg nnn-catg nnn-gtac nnn-gtac nn

14、n-pcr-rflppcr-rflp检测检测hbv ymddhbv ymdd变异变异pcr错配引物设计错配引物设计pcr-rflppcr-rflp检测检测hbv ymddhbv ymdd变异变异pcr-rflppcr-rflp检测检测hbv ymddhbv ymdd变异变异p优点：优点： 简单、广泛易开展。简单、广泛易开展。p缺点：缺点： 1.1.限制性内切酶种类有限。限制性内切酶种类有限。 2.2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。 3.3.引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测 敏感的下降。

15、敏感的下降。 反向杂交分析技术（反向杂交分析技术（innoinnolipalipa）innoinnolipalipa诊断诊断hbv ymddhbv ymdd变异变异dnadna芯片技术芯片技术biologicalsampleanalyze datascannermicroarray“hybridize”arrayerpmicroarray fabricationpsample preparationpmolecular hybridizationpdetection and analysisdnadna芯片技术诊断芯片技术诊断hbv ymddhbv ymdd变异变异detection of y

16、mdd motif mutants by oligonucleotide chips in lamivudine-untreated patients with chronic hepatitis b virus infection。j korean med sci 2004; 19: 541-546.dnadna芯片技术芯片技术 优点优点 局限性局限性 大通量大通量 技术和设备的要求高技术和设备的要求高 快速快速 检测成本高检测成本高 灵敏度高灵敏度高 可平行检测可平行检测 实时荧光定量实时荧光定量pcrpcr在基因变异中的应用在基因变异中的应用p探针定点突变探针定点突变pcrpcr技术技术

17、-taqman-mgb-taqman-mgb探针探针p引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术p高分辨熔解曲线法高分辨熔解曲线法taqman-mgbtaqman-mgb探针定点突变探针定点突变pcrpcr技术技术taqman-mgbtaqman-mgb探针技术探针技术检测检测ymddymdd变异变异hbv dna10hbv dna105 5copies/mlcopies/mlw:m=1:1w:m=1:1hbv dna10hbv dna105 5copies/mlcopies/mlw:m=10:1w:m=10:1hbv dna10hbv dna105 5copies/mlcopi

18、es/mlw:m=10:1w:m=10:1：w：m探针定点突变探针定点突变pcrpcr技术技术 优点优点 不足不足 灵敏度高灵敏度高 需要相对较贵的荧光需要相对较贵的荧光pcr仪仪 特异性好特异性好 需要多条荧光探针，成本高需要多条荧光探针，成本高 费时短费时短 影响因素多，存在一定误判影响因素多，存在一定误判引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术检测检测ymdd变异变异熔解曲线法检测熔解曲线法检测ymddymdd变异变异特异性探针，其特异性探针，其tm值不同值不同溶解曲线分析溶解曲线分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

19、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)(maldi-tof ms)原理原理+pulseduv or ir laser(3-4 ns)detectorvacuumstrong electric fieldtime of flight tubepeptide mixtureembedded in light absorbing chemicals (matrix)cloud ofprotonatedpeptide moleculesaccvmaldi-tof msmaldi-tof ms检测检测hbv ymddhbv ymdd变异的原理变异的原理酶切分子量酶切分子量.jpg基

20、质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(mald i-tof ms)(mald i-tof ms)优点：优点： 高灵敏度、准确度、分辨率高灵敏度、准确度、分辨率 能发现相对比例小于能发现相对比例小于1%1%的变异株。的变异株。局限性：局限性： 设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。hbv耐药不同检测技术的比较advances in molecular diagnosis of hbv infection and drug resistance。int. j. med. sci. 2005 2(1)：8-161sensitivity he

21、re refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2information content is considered as a measure of a tests ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3updateability assesses the ease at which a test can be dapte

22、d to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd, not determined.hbvhbv表型耐药检测表型耐药检测p有两种途径：有两种途径：p1.细胞外细胞外hbv聚合酶活性分析。聚合酶活性分析。p2.细胞药物敏感性实验。细胞药物敏感性实验。细胞外细胞外hbvhbv聚合酶活性分析聚合酶活性分析p目前常用的研究目前常用的研究hbvhbv聚合酶活性模型是将聚合酶活性模型是将hbvhbv基因基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达hbvhbv颗粒，应用亲

23、和层析法纯化颗粒，应用亲和层析法纯化hbvhbv颗粒后，在细颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。胞外评价药物对聚合酶活性的影响。细胞外细胞外hbvhbv聚合酶活性分析聚合酶活性分析细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验p该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含毒载体将含有被检测的含hbvhbv变异位点的全基因组变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的胞上清中的hbv d

24、nahbv dna含量。含量。 细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验p该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分析。析。 临床耐药监测临床耐药监测ymddymdd变异前后病毒载量和变异前后病毒载量和altalt的变化的变化hbv mddhbv mdd变异与病毒学突破变异与病毒学突破判断临床耐药时的建议判断临床耐药时的建议p1. 1. 结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是否合并其他肝病等。

25、否合并其他肝病等。p2.2.注意甄别依从性不良。注意甄别依从性不良。p3.3.结合基因变异位点。结合基因变异位点。 三、需要重视的几个问题三、需要重视的几个问题p慎重对待天然耐药的结论。慎重对待天然耐药的结论。p不要过分依基因型耐药检测技术。不要过分依基因型耐药检测技术。p正确对待基因分型技术。正确对待基因分型技术。 ymddymdd自然变异的几组数据自然变异的几组数据pakarsu makarsu m等采用等采用innolipa innolipa 法检测法检测7171例未经抗病毒例未经抗病毒的成年慢性乙肝携带者，结果有的成年慢性乙肝携带者，结果有1313例检测到例检测到ymddymdd变异株。变异株。plee czlee cz等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对2828例拉米夫定治疗前的例拉米夫定治疗前的chbchb患者血清进行了患者血清进行了ymdd