第三节动物的克隆PPT课件

1、第三节第三节 动物的克隆动物的克隆经济管理学经济管理学小资料：小资料： 20 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。19071907年，美国生物学家哈里森年，美国生物学家哈里森(Harrison)(Harrison)从蝌蚪的脊索从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织

2、存活了好几周，并且从神经细胞中养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。渐发展成为动物细胞培养。1 1、广义的动物组织培养、广义的动物组织培养( (组培组培) )包括：包括：2 2、动物组织培养技术的发展：、动物组织培养技术的发展：18851885年，年，鸡神经板鸡神经板在生理盐水

3、中培养成活。在生理盐水中培养成活。 1903 1903年，年，皮肤及白细胞皮肤及白细胞培养于腹水及血清中，存活培养于腹水及血清中，存活1 1个月。个月。 1907 1907年，美，年，美，蛙胚神经管蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，观察到培养在蛙淋巴液中，观察到细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。细胞培养、组织培养和器官培养。细胞培养、组织培养和器官培养。一、动物细胞的培养和克隆形成一、动物细胞的培养和克隆形成3 3、动物细胞培养、动物细胞培养 将动物体的一部分组织取出，经过将动物体的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶机械消化或胰酶消化消化，使其分散成，使其分散成

4、单个细胞单个细胞；然后在人工控制的培养条；然后在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。一、动物细胞的培养和克隆形成一、动物细胞的培养和克隆形成 幼龄动物幼龄动物取动物器官取动物器官和组织和组织剪碎组织剪碎组织胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理细胞培细胞培养养单个细胞单个细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础是其他动物细胞工程技术的基础动物细胞的培养过程动物细胞的培养过程思考：思考：2 2、为什么选用动物胚胎或幼龄个

5、体的器官或组织做动物、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？细胞培养材料？1 1、动物细胞培养液的、动物细胞培养液的主要成分主要成分是什么？较植物组培培养基是什么？较植物组培培养基有何独特之处？有何独特之处？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。等。独特之处有：独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强强思考：思考：3 3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为

6、什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4 4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？培养成新个体？成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体育成新的动物个体培养过程：培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶1010代细胞代细胞5050代细胞代细胞细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系剪碎原代培养原代培养传代培养传代

7、培养细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果获得细胞获得细胞或细或细胞产物胞产物快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株等病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动葡萄糖、动物血清物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较3 3、动物细胞培养、动物细胞培养 将动物体的一部分组织取出，经过将动物体的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶机械消化或

8、胰酶消化消化，使其分散成，使其分散成单个细胞单个细胞；然后在人工控制的培养条；然后在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。一、动物细胞的培养和克隆形成一、动物细胞的培养和克隆形成4 4、动物组织培养、动物组织培养 动物动物组织组织在体外以及人工条件下维持生活状态或生在体外以及人工条件下维持生活状态或生长特性。长特性。5 5、器官培养、器官培养如何获得纯系的细胞系？如何获得纯系的细胞系？把把一个细胞一个细胞从群体中分离出来培养从群体

9、中分离出来培养（克隆培养法）（克隆培养法）思考：思考：二、克隆培养法二、克隆培养法1 1、克隆培养法概念：、克隆培养法概念：2 2、特征：、特征：3 3、基本要求：、基本要求：遗传性状均一、表现性状相似。便于研究。遗传性状均一、表现性状相似。便于研究。 把把一个一个细胞从群体中分离出来培养，使之繁殖成细胞从群体中分离出来培养，使之繁殖成一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个等位概念）一个等位概念）必须保证分离出来的细胞是必须保证分离出来的细胞是一个一个而不是多个而不是多个, ,即必须肯即必须肯定所建成的克隆定所建成的克隆来源于单个细胞。

10、来源于单个细胞。二、克隆培养法二、克隆培养法4 4、提高克隆形成率的措施：、提高克隆形成率的措施：5 5、用途：、用途：选择适宜的培养基、添加血清、激素刺激、选择适宜的培养基、添加血清、激素刺激、 CO2CO2培培养箱、养箱、PHPH值等值等如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。三、动物的细胞融合技术及其应用三、动物的细胞融合技术及其应用 什么是细胞融合技术？什么是细胞融合技术？ 为什么要进行细胞融合？为什么要进行细胞融合？ 如何实现细胞融合？如何实现细胞融合？三、动物的细胞融合技术及其应用三、动物的细胞融合技术及其应用（一）细胞融合与

11、细胞杂交（一）细胞融合与细胞杂交细胞细胞A A细胞细胞B B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿过细胞膜被病毒颗粒穿过细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞 化学：化学：PEGPEG（聚乙二醇）（聚乙二醇） 物理：电融合物理：电融合 生物：灭活的病毒（仙台病毒）生物：灭活的病毒（仙台病毒）仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保

12、留融合活性细胞融合方法：细胞融合方法：主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用用 途途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后使细胞分散后诱导细胞融合诱导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的原理细胞融合的原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物

13、、动物细胞融合的比较读下面一段文字资料，思考以下问题：读下面一段文字资料，思考以下问题： 长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的动物发生免疫反应的过程中，体内的B B细胞可以产生多细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个达

14、百万种以上的特异性抗体，但是每个B B细胞只分泌一细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个一抗体，必须用单个B B细胞进行无性繁殖，即克隆。细胞进行无性繁殖，即克隆。（二）（二） 杂交瘤技术和单克隆抗体制备杂交瘤技术和单克隆抗体制备什么是抗体？什么是抗体？由何种细胞产生？由何种细胞产生？主要分布在哪里？主要分布在哪里？起何作用？起何作用？什么是单克隆抗体？什么是单克隆抗体？效应效应B B细胞细胞血清血清特异性免疫作用特异性免疫作用抗体：抗体：机体受抗原刺激后产生的，并机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生

15、特异性结合的具有且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫功能的球蛋白。用单个用单个B B淋巴细胞进行无性淋巴细胞进行无性增殖（扩增殖（扩增）增），也就是通过克隆，形成细胞，也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体化学性质单一、特异性强的抗体。单克隆抗体：单克隆抗体：讨论：怎样才能获得单克隆抗体？提示提示1 1：仅用细胞培养技术可行吗？：仅用细胞培养技术可行吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？殖的？提示提示3 3：有什么方法能使：有什么方法能使B B细胞产生抗

16、体的能细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？（二）（二） 杂交瘤技术和单克隆抗体制备杂交瘤技术和单克隆抗体制备设计方案：设计方案：一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖杂种细胞杂种细胞 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹

17、腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体两次筛选分别有什么目的？两次筛选分别有什么目的？本过程利用了哪些原理？本过程利用了哪些原理？为什么选用小鼠骨髓瘤细为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与胞与B B细胞融合？细胞融合？ 第一次筛选得到杂交瘤细胞第一次筛选得到杂交瘤细胞 第二次筛选出特异抗体的细胞群。第二次筛选出特异抗体的细胞群。免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理 细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B B细胞分泌细胞分泌抗体的能力，而且还

18、有无限增殖的本领，因而可以获抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。得大量单克隆抗体。四、动物的克隆繁殖四、动物的克隆繁殖 理论上，分化的动物细胞能像植物细胞一理论上，分化的动物细胞能像植物细胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？样脱分化、再分化成一个动物体吗？ 动物细胞实际上表现出全能性的情况如何动物细胞实际上表现出全能性的情况如何呢？呢？受精卵受精卵 胚胎干细胞胚胎干细胞 多能干细胞多能干细胞 单能干细胞单能干细胞 体细胞体细胞四、动物的克隆繁殖四、动物的克隆繁殖（一）动物细胞全能性的表现程度（一）动物细胞全能性的表现程度（2 2）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如

19、水螅的上）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如水螅的上皮细胞，不经过分裂就可以转变为上皮、肌肉细胞。皮细胞，不经过分裂就可以转变为上皮、肌肉细胞。（1 1）高等动物细胞）高等动物细胞 在动物的个体发育过程中，在动物的个体发育过程中，分化的结果使得细胞在分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化，形态和功能上高度特化，这是由于细胞在伴随着它们发这是由于细胞在伴随着它们发育过程中在时间、空间的变化，育过程中在时间、空间的变化，基因表达的调控使得细基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质胞中合成了专一的蛋白质。（二）动物难以克隆的（二）动物难以克隆的根本原因根本原因四、动物的克隆繁殖四、动物的克隆繁

20、殖核移植核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植（难度高）（难度高） 1 1、基本过程：、基本过程：动物体细胞核移植动物体细胞核移植是将动物的一个是将动物的一个细胞的细胞核细胞的细胞核, ,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中中. .使其重组并发育成一个新的胚胎使其重组并发育成一个新的胚胎, ,这个新的胚胎最终这个新的胚胎最终发育为动物个体发育为动物个体. .( (三三) )细胞核移植实验和动物的克隆繁殖细胞核移植实验和动物的克隆繁殖四、动物的克隆繁殖四、动物的克隆繁殖细胞核移植实验和动物的克隆繁殖：细胞核移植实验和动物的克隆繁殖：胚胎细胞核

21、的移植成功率远高于成体细胞。胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞。2.2.培育过程：培育过程：去核卵细胞去核卵细胞体细胞核体细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期胚胎早期胚胎(或重组胚胎）或重组胚胎）胚胎移植胚胎移植母体子宫母体子宫妊娠、出生妊娠、出生 个体个体3 3、原理：、原理：动物体细胞动物体细胞核核具有具有全能性全能性绵羊绵羊“多莉多莉”克隆过程：克隆过程：卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多莉羊的培育过

22、程多莉羊的培育过程融合后的卵细胞融合后的卵细胞体细胞克隆成功的意义：体细胞克隆成功的意义：1 1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受 精卵时期的功能。精卵时期的功能。2 2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。应用：应用： 为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途径；对濒危动物的保存也有重要意义。径；对濒危动物的保存也有重要意义。克隆羊成功的分子细胞生物学机理：克隆羊成功的分子细胞生物学机理： 重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋白，重组移核细胞丢失了源于

23、乳腺细胞的调节蛋白，经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核DNADNA被重新被重新编排，细胞开始表达自己的基因。编排，细胞开始表达自己的基因。A A 、 B B细胞为动物细胞细胞为动物细胞, ,请据图回答问题请据图回答问题: :A A细胞细胞B B细胞细胞C C细细胞胞D D细细胞胞(1)(1)若若A A细胞为骨髓瘤细胞细胞为骨髓瘤细胞B B细胞为淋巴细胞细胞为淋巴细胞, ,那么那么D D细胞称细胞称为为 细胞细胞,D,D细胞具有两个亲本细胞的特征细胞具有两个亲本细胞的特征,

24、,一方一方面因具有骨髓瘤细胞的面因具有骨髓瘤细胞的 性质性质, ,通过通过 方方式产生大量细胞式产生大量细胞, ,我们称之为我们称之为 过程过程; ;另一方面能另一方面能分泌大量的抗体分泌大量的抗体, ,我们把该过程分泌的抗体我们把该过程分泌的抗体称称 . .杂交瘤杂交瘤连续分裂连续分裂有丝分裂有丝分裂单克隆单克隆单克隆抗体单克隆抗体练一练练一练(2)D(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是细胞中产生的抗体其化学本质是 , ,合成合成该物质的场该物质的场 , ,它是由它是由 控制合控制合成的成的, ,合成过程包括合成过程包括 和和 两个重要步骤两个重要步骤. .球蛋白球蛋白核糖体核糖体基因基因转

25、录转录翻译翻译(3)D(3)D细胞中产生的抗体具有细胞中产生的抗体具有 作用作用, ,与血清抗体相与血清抗体相比其优越之处在于比其优越之处在于 强强, , 高高. .免疫免疫特异性特异性灵敏度灵敏度(4)(4)若若A A为人细胞为人细胞,B,B为鼠细胞为鼠细胞, ,用同位素标记用同位素标记A A细胞膜上的蛋白细胞膜上的蛋白质质,B,B不标记不标记, ,在在C C细胞时细胞时, ,检测结果发现整个细胞一半有放射性检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有另一半没有. .在在D D细胞时细胞时, ,检测结果发现整个细胞都有放射性检测结果发现整个细胞都有放射性, ,请解释原因请解释原因 . .构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动练一练练一练谢谢！谢谢！动物细胞培养条件：动物细胞培养条件：1 1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2 2、营养、营养（氨基酸、无机盐、维生素、氨基酸、无机盐、维生素、葡萄糖、葡萄糖、动物血清动物血清等）等）3 3、温度和、温度和pHpH 36.5+ 36.5+（- -）0.50.5度度, 7.2-7.4, 7.2-7.44 4、气体环境：、气体环境： COCO2 2培养箱培养箱