精氨酸激酶(AK)的提取与纯化 2010114020208 朱景鹏

1、精氨酸激酶（精氨酸激酶（AK）的提取与纯化）的提取与纯化报告题目报告题目精氨酸激酶（）的提取与纯化作者姓名作者姓名徐青龙徐青龙班级学号班级学号1005/2010114020208指导教师指导教师汪劲松汪劲松完成时间完成时间2013 年 10 月生物学实验教学中心目录目录引言引言.11.1 精氨酸激酶（AK）.11.2 亲和层析法.21.3 电泳法.21.4 本实验主要工作.32.1 实验用品.32.1.1 实验材料.32.1.1 实验试剂.32.1.2 仪器设备.42.2 方法.52.2.1 活化菌种.52.2.2 扩大培养.52.2.3 IPTG 诱导 AK 基因的表达.52.2.4 蛋白质

2、提取.52.2.5 蛋白质的检测.62.2.6 His-tag Ni 亲和层析法纯化融合蛋白.63 结果与分析结果与分析.73.1 蛋白质层析图谱.73.2 AK 诱导表达电泳图 .84 总结总结.9参考文献参考文献.10致谢致谢.10精氨酸激酶（精氨酸激酶（AK）的提取与纯化）的提取与纯化朱景鹏朱景鹏（指导老师：汪劲松）（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院（湖北师范学院生命科学学院 生物科学生物科学 1005 班班 湖北湖北 黄石黄石 435002）摘要：摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶 EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。本实验采取含有包

3、含 AK 基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta ，在含有 50 g/ml 的卡纳霉素的 LB 培养基中培养。当菌体浓度 A600 达到 0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的 IPTG 终浓度为 0.2 mM ,诱导培养 3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。再通过 Ni 离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过 SDS-PAGE 电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。关键词关键词：精氨酸激酶分离与纯化引言引言1.1 精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主

4、要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶1。它的作用是催化可逆反应，将 ATP 上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子磷酸精氨酸3，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。AK 在体内催化反应方程式如下：Mg2+ + ADP + Arginine phosphate Mg2+ + ATP + ArginineAK 广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到 AK。虽然 AK 在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的 AK 在结构上表现出

5、了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基 AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的 AK，相对分子量约为 40KD，单亚基AK 是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的 AK 就是单亚基，相对分子量为40KD。2.海参Stichopusjaponicus中提取的 AK 为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。3.环节动物Sabellapavonina中的 AK 具有四个亚基，分子量为 150-160KD。1.2 亲和层析法依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结

6、合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高 1000 至 10000 倍。His-tag 所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与 Ni 离子结合，而 Ni离子与融合蛋白的 6Xhis 之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白区分开来。加样后，

7、用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。1.3 电泳法电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。聚丙烯酰胺凝胶

8、电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称 SDS-PAGE）,其作用是用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而 SDS-PAGE 仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由Shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中

9、加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。1.4 本实验主要工作1.4.1 从大肠杆菌 Rosseta 中得到精氨酸激酶的粗提液1.4.2 对精氨酸激酶粗提液通过 Ni 亲和层析进行进一步纯化1.4.3 对所得结果通过 SDS-PAGE 进行检测2 材料与方法材料与方法2.1 实验用品实验用品2.1.1 材料材料 含有重组有 AK 基因质粒的表达菌体E. coli Rosetta2.1.2 试剂试剂 LB液体培养基（100 mL）：蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g 50 mg/mL 卡那霉素（kanamycin） IP

10、TG Binding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0 咪唑（10 mM、250 mM） 12 %的分离胶（5 mL）: 成分体积（mL）水1.6030 %丙烯酰胺2.001.5 M Tris (PH 8.8)1.3010 % SDS0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED0.002浓缩胶 （2 mL）成分体积（mL）水1.4030 %丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8)0.2510 % SDS0.0210 % 过硫酸铵0.02TEMED0.002样品缓冲液考马斯亮蓝 R-2502.1.3 仪器设备仪器设备 YC-

11、1 型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司） ； CXG-1 型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司） ； TGL-16LA 高速冷冻离心机（星科仪器厂有限公司） ； GL-2M 型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司） ； 超声破壁仪；（上海之信仪器厂有限公司） 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司） 超纯水机 AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司） SDS-PAGE 电泳仪 电子天平 TE412-L，TE2101-L，CP64（德国 Satorins 公司） BS-1E 振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂) SW-CJ-1FD 单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司） 3FG-0

12、1B 电热恒温鼓风干燥箱 漩涡混合器 XH-C（江苏省金坛市医疗仪器厂） 高压灭菌锅 YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）酒精灯、培养皿、移液枪、 枪头 、接种环 、酒精棉球 、离心管、恒温水浴锅等。2.2 方法2.2.1 活化菌种活化菌种 取工程菌种 50 L 装有 6 mL 的 LB 液体培养基的试管（含有 6 L 卡那青霉素，其工作浓度为 50 g/mL）中。于 37摇床振荡培养 8-12 小时。2.2.2 扩大培养扩大培养 将试管中活化的 6 mL 菌液接种到 300 mL LB 培养基，同时加入 300 L 卡那青霉素（终浓度 50 g/mL）培养基于 37恒温培养箱中培养 2-

13、3 小时。2.2.3 IPTG 诱导诱导 AK 基因的表达基因的表达实验中在不同的培养时间（用 OD 值表征菌体密度）加入 IPTG 诱导表达发现，当OD=0.6-0.8 时,加 IPTG 150 L 至终浓度为 0.2 mM 时 AK 的表达量达到最大。 2.2.4 蛋白质提取蛋白质提取（1）将上述各管于 4，5000 r/m 离心 10 min；（2）弃上清，加入蒸馏水使沉淀物质重悬，再于 4，6000 r/m 离心 10 min；（3）弃上清，使沉淀物质重悬，每 1 g 沉淀加 5 mL 裂解液使其重悬；（4）在冰上进行 10 min,超声 3 s，间隔为 2 s 的超声波破壁, 反复破

14、壁直到沉淀变得澄清为止；（5）于 4，12000 r/m，离心 15 min，取上清，得到 AK 的粗提液；2.2.5 蛋白质的检测蛋白质的检测SDS-PAGE 电泳检验： 1）安装双垂直板电泳槽；2）配 12%的分离胶 5 mL，浓缩胶 3 mL；3) 制样：取样品 10 L 加样品缓冲液以 40 L 混合，100加热 5 min ， 15000g，4离心 1 min；4）上样：用微量注射器加样 15-20 L ； 5）电泳：在浓缩胶上加 60 V/cm 电压，待染料进入分离胶后将电压提高到 140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；6）固定和染色：用考马斯亮蓝 R-250 染色液浸泡，加热

15、几分钟；7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理 3-5 次，直到胶板呈现淡蓝色。2.2.6 His-tag Ni 亲和层析法纯化融合蛋白亲和层析法纯化融合蛋白Ni 柱预处理柱预处理：(1)用 2 M 盐酸胍 10 mL 与树脂打散混合洗涤，静置 10 min；(2)用蒸馏水洗 10 min；Stripping Buffer 洗 20 min；(3)用蒸馏水洗 10 min；用 0.3 M NaOH 洗 20 min；(4)用 Binding Buffer 洗 20 min；蒸馏水洗 10 min；(5)用 1.5 M NaCl 洗 20 min；用 Binding Buffer 洗 20 min

16、；蒸馏水洗 10 min; (6)Ni 柱再生：50 mL 0.1 M NiSO4洗蒸馏水洗(7)6 倍柱床体积 Binding Buffer（pH=8.0）平衡注：流速控制在 2-3 mL/min。平衡：平衡：用 Binding Buffer 平衡 Ni 柱。上样：上样：插 A280滤光片，调 A=0 值、T=100 值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液 45 mL 上柱，流速约为 1.6-1.8 mL/min 洗脱：洗脱：上样完后，用 Binding Buffer(PH=8.0)淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（40 mM、80 mM、2

17、50 mM）洗脱，在 280 nm 处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。3 结果与分析结果与分析3.1 蛋白质层析图谱图 1 AK 经 Ni 柱纯化的层析图谱由谱图可知：在上样前是用 Binding Buffer 平衡，由于电脑故障极限数据与穿流前半部分的数据丢失，但不影响穿流液的收集和后面梯度洗脱液的收集。给定的层析图谱中00:0000:07 内曲线峰急剧回落，说明此时穿流液中有数种杂蛋白自然流出；峰回落并基本持平后，分别用 40 mM、80 mM、250 mM 咪唑洗脱，分别出现了洗脱峰值，说明均有蛋白被洗脱

18、下来，峰面积大小反映了相同体积洗脱收集液中蛋白含量高低。猜想在 00:29以后继续用 500 mM 咪唑洗脱还会出现峰。3.2 AK 诱导表达电泳图M. marker 1. 250mM 咪唑 2. 80mM 咪唑 3. 40mM 咪唑 4. 穿流图 2 SDS-PAGE 电泳图由图可知：（1）第 4 道是穿流液，即蛋白上样后的流出来液体，其理论上应该全部都是杂蛋白，但从实际结果上来看，出现了少量目标蛋白带，同时也有许多杂带，说明目标蛋白大部分结合到了 Ni 柱上，穿流液中有很多杂蛋白；(2)第 3 道是 40 mM 咪唑洗脱液，目标蛋白带最强，说明大量 AK 被洗脱下来；(3)第 2 道是 8

19、0 mM 咪唑洗脱液，目标蛋白带较强，说明较大量 AK 被洗脱下来；(4)第 1 道是 250 mM 咪唑洗脱液，其目的是洗去挂在柱子上的所有蛋白质，从 SDS-PAGE 上可以看到，目标蛋白带很弱，说明仍有很少的 AK 被洗脱下来。（5）目标蛋白的相对分子质量大约在 42KD 左右，目标条带有叠影现象，表明目标蛋白在提取分离过程中被氧化了。提醒以后的实验中要加抗氧化剂，如 PMSF。4 总结总结我们以通过 IPTG 诱导精氨酸激酶基因在 E.coli 菌株中表达，通过 His-tag Ni 亲和层析法技术分离纯化得到较纯的活性精氨酸激酶，为精氨酸激酶结构与功能的研究提供基础。诱导条件，层析系统的选择对以后的研究有着重要借鉴意义。在本实验中，我了解了目标蛋白质的分离纯化程序主要包括：材料的选择、组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；蛋白质初步提纯；选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；目标蛋白的鉴定,SDS-PAGE 检测。同时我通过了本实验掌握了从菌体中粗提目标蛋白质技术，蛋白质 Ni 离子亲和层析技术，蛋白质的 SDS-PAGE 电泳分离技术等。在本实验中，我加深了对蛋白纯化方法