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1、 第四章第四章分子荧光分析新技术分子荧光分析新技术 4.1 分子荧光光分析法概论分子荧光光分析法概论 一定量分析一定量分析 a =-lgt =bc t = f ( ) f =f 若用级数展开,略去高次项,得若用级数展开,略去高次项,得f = 2.303f kc k = bf称为荧光的量子产率称为荧光的量子产率,f 0iittii 0)1( 303.20bcei 0i吸吸收收的的量量子子数数发发出出的的量量子子数数 二影响发光强度的因素二影响发光强度的因素 f = xcffkkkk s* skc kf kx tkp kc 讨论讨论1. kf主要取决于分子结构,受环境影响较小。主要取决于分子结构,
2、受环境影响较小。 max 可作为可作为kf的定性度量的定性度量 max大,大,a大,大,kf大大 例如例如 * * nn* * 具有多重共轭双键的分子发射的荧光较强具有多重共轭双键的分子发射的荧光较强2. kc受环境影响最为强烈受环境影响最为强烈( (无辐射去活速率常数)无辐射去活速率常数) t升高,分子碰撞的几率增加,升高,分子碰撞的几率增加,kc变大变大 3. kx为内交联的速率常数为内交联的速率常数 kx既受分子结构的影响,也在一定程度上受环境的既受分子结构的影响,也在一定程度上受环境的 影响。影响。 kx:(:(1)对)对* *nn,k kx xk kf f 对对* *,k kx xk
3、kf f (2)溶剂的极性影响分子跃迁类型)溶剂的极性影响分子跃迁类型 喹啉在苯中喹啉在苯中 * *nn 在极性在极性s s * * 喹啉在苯、乙醇、水中的喹啉在苯、乙醇、水中的f分别为分别为1,30,1000 (1) kx依赖于依赖于s*tt的距离的距离 距离越小,距离越小,kx越大越大(2) 重原子效应重原子效应 在含有在含有轨道上的分子引入重原子之后,轨道上的分子引入重原子之后,k kx x变大变大 氟苯氟苯 f 0.16 氯苯氯苯 f 0.05 溴苯溴苯 f 0.01 碘苯碘苯 f 0(3) 不成对自旋的顺磁物质,也发现会增大系内交联速率不成对自旋的顺磁物质,也发现会增大系内交联速率
4、例如:锌卟啉二甲酯螯合物具有中等强度的荧光和磷光例如:锌卟啉二甲酯螯合物具有中等强度的荧光和磷光, 铜卟啉二甲酯螯合物的荧光减弱,磷光增强铜卟啉二甲酯螯合物的荧光减弱,磷光增强 三分子发光与结构的关系三分子发光与结构的关系 要使分子产生荧光,则分子结构能吸收要使分子产生荧光,则分子结构能吸收uv-vis辐射辐射, 且要有较高的荧光效率。且要有较高的荧光效率。(1)若分子吸收若分子吸收uv-vis辐射能力越强,发光越辐射能力越强,发光越 强;强;(2)能强烈发光的分子几乎都是经过能强烈发光的分子几乎都是经过* * 跃迁,具有共轭双键、刚性较强的平面和跃迁,具有共轭双键、刚性较强的平面和 多环结构
5、的分子易于发光。多环结构的分子易于发光。 取代基对分子发光有显著影响取代基对分子发光有显著影响(1) 给电子基团常使荧光增强给电子基团常使荧光增强 如如nhnh2 2,ohoh(2) 吸电子基团使荧光减弱或熄灭吸电子基团使荧光减弱或熄灭 如如cooh,no2,nn 刚性强的分子刚性强的分子f大大 如环的封闭作用使分子刚性增强如环的封闭作用使分子刚性增强 芴芴 f 1.0 联二苯联二苯 f 0.2 有机螯合剂与金属离子形成配键时,有机螯合剂与金属离子形成配键时, 刚性刚性 增强增强 8-羟基喹啉与羟基喹啉与zn f 8-羟基喹啉羟基喹啉 f 四仪器四仪器 与与uv-vis的区别:的区别: 1.检
6、测方向与入射方向检测方向与入射方向垂直,以便使被散射垂直,以便使被散射的入射光的直接检出的入射光的直接检出减至减至最少最少2.两个单色器两个单色器 3.检测池四面透明检测池四面透明 4.激发光谱激发光谱 5.发射光谱发射光谱 lm1sm2dr五溶液荧光的熄灭五溶液荧光的熄灭 荧光的熄灭广义的包括了任何可使荧光增强度荧光的熄灭广义的包括了任何可使荧光增强度降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的现象,这些会引起荧光的熄灭的物质光强度降低的现象,这些会
7、引起荧光的熄灭的物质称为称为熄灭剂熄灭剂 。 狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分子的子的荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩短短,从而导致荧光强度的降低。,从而导致荧光强度的降低。 著名的熄灭剂著名的熄灭剂: 卤素离子卤素离子 重金属离子重金属离子 氧分子氧分子 硝基化合物硝基化合物 卤素离子对于奎宁的荧光有显著的熄灭卤素离子对于奎宁的荧光有显著的熄灭作用,但对某些物质的荧光并不发生熄灭作作用,但对某些物质的荧光并不发生熄灭作
8、用,这表明熄灭剂和荧光物质分子之间的相用,这表明熄灭剂和荧光物质分子之间的相互是有选择性的。互是有选择性的。 荧光熄灭作用在荧光分析中有着降低待荧光熄灭作用在荧光分析中有着降低待测物质的荧光强度的不良作用,但另一方面,测物质的荧光强度的不良作用,但另一方面,我们可以利用某一物质对某一荧光物质的熄我们可以利用某一物质对某一荧光物质的熄灭作用建立对该物质的荧光熄灭法检测。该灭作用建立对该物质的荧光熄灭法检测。该法常具有更高的选择性。法常具有更高的选择性。 1.碰撞熄灭碰撞熄灭 溶液中荧光物质分子溶液中荧光物质分子m和熄灭剂和熄灭剂q相碰撞相碰撞 而引起荧光熄灭。而引起荧光熄灭。 比较速率比较速率(
9、1)(1)m mh hmm* *( (吸光吸光) 1) 1 (2)(2)m m* * m mh h ( (发生荧光发生荧光) k) k1 1 m m* * (3)(3)m m* * +q m+q+ +q m+q+热热 k k2 2 m m* * qq 1k 2kstern-volmerstern-volmer方程式方程式 k k:熄灭常数:熄灭常数 qq:熄灭剂浓度:熄灭剂浓度(m)(m) f f0 0,f,f分别是熄灭剂分别是熄灭剂q q不存在时及存在时的不存在时及存在时的溶液的荧光强度溶液的荧光强度)(1072321rdrdprktt 10qkff 2. 组成化合物的熄灭组成化合物的熄灭
10、某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之后,溶液的吸收光谱有了显著的改变,溶液的后,溶液的吸收光谱有了显著的改变,溶液的荧光强度显著降低荧光强度显著降低; 随着温度的升高,荧光强随着温度的升高,荧光强度而增强。度而增强。 上述情况可能是由于一部分荧光物质分子上述情况可能是由于一部分荧光物质分子m与熄灭剂分子与熄灭剂分子q作用而生成了络合物作用而生成了络合物mq,如,如络合物络合物mq的形成是由于微弱的范德华引力的的形成是由于微弱的范德华引力的作用,则所形成的络合物并不发生荧光,且作用,则所形成的络合物并不发生荧光,且对对solusolu的吸收并不发生任何影响。的吸收
11、并不发生任何影响。能能量量降降低低 hmmmhmhmqmqq m1k* 发生荧光的物质仍为发生荧光的物质仍为m m* *分子,品种并没有改分子,品种并没有改变,所以荧光分子的平均寿命也没有改变,至于变,所以荧光分子的平均寿命也没有改变,至于solusolu温度升高荧光强度之所以增强,可能是由于温度升高荧光强度之所以增强,可能是由于温度升高时该络合物较不稳定,较多地分解为温度升高时该络合物较不稳定,较多地分解为m m和和q q分子的缘故。这一点可以作为这一类型熄灭分子的缘故。这一点可以作为这一类型熄灭不同于碰撞熄灭的标志。不同于碰撞熄灭的标志。 如果络合物如果络合物mqmq的形成是由于强大的力,
12、则络的形成是由于强大的力,则络合物合物mqmq将具有它自己的吸光特性,溶液的吸收光将具有它自己的吸光特性,溶液的吸收光谱也将发生改变。谱也将发生改变。3.转入三重线级的熄灭转入三重线级的熄灭 e c位位 e 能能 * * g d a bcbd处于单线态的基态处于单线态的基态egf为第一激发单线态为第一激发单线态虚线为激发三线态虚线为激发三线态 当由单线态转移至三线态时,多余的振当由单线态转移至三线态时,多余的振动能在碰撞中损失掉,动能在碰撞中损失掉,solu中绝大多数转入中绝大多数转入三重线级的分子在一般温度下是不会发光三重线级的分子在一般温度下是不会发光的,它们把多余的能量消耗于它们与其它的
13、,它们把多余的能量消耗于它们与其它分子的碰撞之中,分子的碰撞之中,因因而引起荧光的熄灭而引起荧光的熄灭 。 转入三重态的分子在低温下可由三线转入三重态的分子在低温下可由三线态重新返回到基态,在这一过程中将放出态重新返回到基态,在这一过程中将放出波长较长的磷光。波长较长的磷光。 含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧含溴、碘化合物、重氮、羰基、羧基及某些杂环化合物基及某些杂环化合物容易转变至三线态,容易转变至三线态,因而易使荧光熄灭。电子自旋方向的改变因而易使荧光熄灭。电子自旋方向的改变系有系有强烈磁场的诱导作用强烈磁场的诱导作用所引起的,在原所引起的,在原子核附近,尤其是在子核附近,尤其是在br或或i
14、这样重的原子这样重的原子核附近,存在着强烈的磁场,所以含溴、核附近,存在着强烈的磁场,所以含溴、碘的化合物容易使溶液荧光熄灭碘的化合物容易使溶液荧光熄灭。 几乎所有会发生荧光的有机化合物都会几乎所有会发生荧光的有机化合物都会被溶解在溶液中的氧分子熄灭剂熄灭到不同被溶解在溶液中的氧分子熄灭剂熄灭到不同的程度。的程度。 三线态的氧分子和单线态的荧光物质分子碰撞三线态的氧分子和单线态的荧光物质分子碰撞 单线态的氧分子和三线态的荧光物质分子碰撞单线态的氧分子和三线态的荧光物质分子碰撞 4. 4. 发生电子转移反应的熄灭发生电子转移反应的熄灭 某些熄灭剂分子与荧光物质分子相互作用时,某些熄灭剂分子与荧光
15、物质分子相互作用时,发生了电子转移反应,即氧化还原反应,即引发生了电子转移反应,即氧化还原反应,即引起荧光的熄灭。起荧光的熄灭。 例:甲基蓝荧光溶液被例:甲基蓝荧光溶液被fefe2+2+离子熄灭离子熄灭 d + + h d* d* d + + h d * + fe2+ d + fe3+ d + h dh(半醌)(半醌) 2dh d + dh2 (无色染料)(无色染料) 发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离子,属离子,i,br,cns,s2o32等易于等易于给出电子的阴离子对奎宁,罗丹明及荧光素给出电子的阴离子对奎宁,罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生熄灭
16、作用。钠等有机荧光物质也会发生熄灭作用。5. 荧光物质的自熄灭荧光物质的自熄灭 当当c 1m时,常发生自熄灭现象。时,常发生自熄灭现象。 自熄灭的原因是多样的:自熄灭的原因是多样的: (1)m* m 例:例:f熄灭熄灭 苯和蒽苯和蒽 (2)多聚体的形成)多聚体的形成 多聚体与单体具有不同的吸收光谱,但不多聚体与单体具有不同的吸收光谱,但不会发生荧光或荧光强度很弱。会发生荧光或荧光强度很弱。 消除:消除: (1)荧光熄灭作用均随着熄灭剂的浓)荧光熄灭作用均随着熄灭剂的浓度增大而加大,因此若对度增大而加大,因此若对solu稀释可消稀释可消除或减低荧光的熄灭作用;除或减低荧光的熄灭作用; (2)溶解
17、氧的除去,通入氮气。)溶解氧的除去,通入氮气。六六. 散射光和拉曼光对于荧光分析的干扰散射光和拉曼光对于荧光分析的干扰1. 散射光对于荧光分析的干扰散射光对于荧光分析的干扰 光通过物质时,有小部分在侧向散射开来,光通过物质时,有小部分在侧向散射开来, 这种现象叫做这种现象叫做光的散射光的散射。 若散射光的频率与入射光的频率相同,则若散射光的频率与入射光的频率相同,则 称为称为溶剂的瑞利散射光溶剂的瑞利散射光。 若散射光的频率与入射光的频率不同,则若散射光的频率与入射光的频率不同,则 称为称为溶剂的拉曼光溶剂的拉曼光。 f 450 320 640 360 720 320 nm瑞利散射光瑞利散射光
18、 360 nm水溶剂的拉曼光水溶剂的拉曼光光栅分光光栅分光640 nm,720 nm分别是二级的瑞利散射光和拉曼光分别是二级的瑞利散射光和拉曼光0.04gg奎宁奎宁/ml0.1n h/ml0.1n h2 2soso4 4exex 320 nm320 nm上述这些峰均会在空白实验中出现上述这些峰均会在空白实验中出现 散射光和拉曼光对荧光分析有显著的影响,必散射光和拉曼光对荧光分析有显著的影响,必须消除。须消除。 荧光分光光度计:荧光分光光度计: 滤光片荧光计滤光片荧光计 若荧光峰的波长与激发光的波长很接近,则由若荧光峰的波长与激发光的波长很接近,则由散光所应起的误差将严重地影响方法的灵敏度,可散
19、光所应起的误差将严重地影响方法的灵敏度,可调节荧光计的狭缝宽度。调节荧光计的狭缝宽度。 液槽液槽 探测器的窗口探测器的窗口 2. 溶剂的拉曼光及其对荧光光谱的干扰溶剂的拉曼光及其对荧光光谱的干扰 拉曼光没有确定的波长,但它的频率和激发拉曼光没有确定的波长,但它的频率和激发光的频率却有一定的差值。光的频率却有一定的差值。 例:在不同汞射线照射下水的拉曼光的波长例:在不同汞射线照射下水的拉曼光的波长 exex(nm)(nm) 248 313 365 405 436水(水(q) 271 350 416 469 511波数波数(-1-1) 0.339 0.339 0.340 0.335(1)差别差别
20、荧光有一定的波长,而与激发光的频率无荧光有一定的波长,而与激发光的频率无关,拉曼光随着激发波长而改变;关,拉曼光随着激发波长而改变; 拉曼光发生的时间比荧光快一千万倍;拉曼光发生的时间比荧光快一千万倍; 拉曼光强度很弱。拉曼光强度很弱。表表1 在不同汞射线照射下数种主要溶剂的拉曼光波长在不同汞射线照射下数种主要溶剂的拉曼光波长 solvent solvent exex(nm)(nm) 248 313 365 405 436 248 313 365 405 436 水水 271 350 416 469 511271 350 416 469 511 乙醇乙醇 267 344 409 459 500
21、267 344 409 459 500 环己烷环己烷 267 344 408 458 499267 344 408 458 499 四氯化碳四氯化碳 - 320 375 418 450- 320 375 418 450 氯仿氯仿 - 346 410 461 502- 346 410 461 502 表表2 在不同汞射线照射下在不同汞射线照射下 拉曼光与激发光的波数差值拉曼光与激发光的波数差值(-1-1) solvent solvent exex(nm) (nm) 平均差值平均差值(-1-1) ) 248 313 365 465 248 313 365 465 水水 0.339 0.339 0.
22、340 0.335 0.3380.339 0.339 0.340 0.335 0.338 甲醇甲醇 0.292 0.292 0.293 0.290 0.2920.292 0.292 0.293 0.290 0.292 0.143 0.143 0.141 0.134 0.140 0.143 0.143 0.141 0.134 0.140 环己烷环己烷 0.287 0.287 0.291 0.285 0.2880.287 0.287 0.291 0.285 0.288 0.137 0.138 0.135 0.132 0.136 0.137 0.138 0.135 0.132 0.136 四氯化碳四
23、氯化碳 - 0.073 0.079 0.071 0.074- 0.073 0.079 0.071 0.074 氯仿氯仿 - 0.073 0.073 0.065 0.070- 0.073 0.073 0.065 0.070 - 0.301 0.301 0.304 0.302 - 0.301 0.301 0.304 0.302 (2)拉曼谱线与激发光的频率差值及波数)拉曼谱线与激发光的频率差值及波数差值是分子的振动能级与转动能级跃迁的差值是分子的振动能级与转动能级跃迁的结果,拉曼光的频率和激发光的频率之间结果,拉曼光的频率和激发光的频率之间的差值相当于分子的振动转动频率,对的差值相当于分子的振动转
24、动频率,对于某一给定的物质,频率差值是恒定不变于某一给定的物质,频率差值是恒定不变的,而和激发光的频率无关。的,而和激发光的频率无关。first eeslaser frequency(vitual es) 0 218 314 459762790 h0 h0h0h0stokesh(0- ) )antistokes (3)拉曼光的消除)拉曼光的消除 选择适当的溶剂选择适当的溶剂 选用合适的激发光波长选用合适的激发光波长 e=e= h=h=h =h=h c c 4.2 三维荧光光谱法三维荧光光谱法 total luminescencetotal luminescence spectrometry s
25、pectrometry 一般荧光法对复杂混合物荧光光谱难以一般荧光法对复杂混合物荧光光谱难以分辨,因而使它的应用受到限制。分辨,因而使它的应用受到限制。 f是是exex、emem的函数。的函数。 total luminescence(tls) two-dimensional spectra(tds) topograms一一. 三维荧光光谱图的表示方法三维荧光光谱图的表示方法1. 三维投影图(三维投影图(isometric projection) 以以emem为为x轴,轴, exex为为y轴,轴,f为为z轴而构成轴而构成的三维投影图。的三维投影图。 y轴轴由小到大由小到大 正面图正面图 y轴轴由
26、大到小由大到小 背面图背面图 2. 等高线图(等高线图(contour plats) 以以emem为为x轴,轴, exex为为y轴,把荧光强度相轴,把荧光强度相等的点用线连接起来,则在平面上形成等高线等的点用线连接起来,则在平面上形成等高线图,称为等高线荧光光谱图。图,称为等高线荧光光谱图。二二. 实验技术实验技术1. 一般的荧光分光光度计一般的荧光分光光度计 分别测定各个不同激发波长下荧光发射分别测定各个不同激发波长下荧光发射光谱,根据所得数据用计算机绘制三维投影光谱,根据所得数据用计算机绘制三维投影图或等高线图。图或等高线图。 此法非常麻烦,耗时。此法非常麻烦,耗时。2. 电视荧光计(电视
27、荧光计(videofluorometer) 电视荧光计使用快速扫描多道检测器,电视荧光计使用快速扫描多道检测器,如光导摄像管在几毫秒内以矩阵的形式收集如光导摄像管在几毫秒内以矩阵的形式收集数据,光导摄像管的光敏表面可看成是几千数据,光导摄像管的光敏表面可看成是几千个检测器的二维排列。个检测器的二维排列。 red yellow greenblue uvemissionpolychromator vidicon exexememexcitationpolychromatorsample3. 光二极管阵列荧光计光二极管阵列荧光计(the photodiode array fluorenometer)
28、 与二维光导摄像管检测器相比,光二极管阵与二维光导摄像管检测器相比,光二极管阵列是一维检测器。为了得到光二极管检测器,荧列是一维检测器。为了得到光二极管检测器,荧光分光光度计的光电倍增管和单色器必须被二极光分光光度计的光电倍增管和单色器必须被二极管阵列和多色器所取代。管阵列和多色器所取代。三三. 三维射影图和等高图的特点三维射影图和等高图的特点1. 三维投影图比较直观地观察激发发射波三维投影图比较直观地观察激发发射波长对所对应的荧光强度的信息;长对所对应的荧光强度的信息;2. 三维投影图难以用于相似样品的定量测定;三维投影图难以用于相似样品的定量测定;3. 等高线图可用于相似样品的定量比较。等
29、高线图可用于相似样品的定量比较。四四. 生物医学应用生物医学应用1. 血清血清 tds已经被广泛用于多环芳香碳氢化已经被广泛用于多环芳香碳氢化合物分析、液相色谱、细菌指纹、地球化合物分析、液相色谱、细菌指纹、地球化学、煤化作用研究和光化学研究,在生物学、煤化作用研究和光化学研究,在生物医学中的应用是较新的应用研究。医学中的应用是较新的应用研究。 从血管直接抽取的血样称为从血管直接抽取的血样称为全血全血。 全血经放置之后,自然分为两层,上全血经放置之后,自然分为两层,上层清析。称为层清析。称为血清血清(serum)。 全血加抗凝剂以后,放置一段时间后,全血加抗凝剂以后,放置一段时间后,也会分为两
30、层,上层的清液称为也会分为两层,上层的清液称为血浆血浆(plasma)。 血浆比血清多一种胶原蛋白。血浆比血清多一种胶原蛋白。 a. 小白鼠小白鼠 血清是由大量的物质所组成,但仅少数物血清是由大量的物质所组成,但仅少数物质对血清的荧光有贡献。在质对血清的荧光有贡献。在紫外区紫外区,荧光是由,荧光是由于蛋白质上色氨酸的荧光所致,因为从酪氨酸于蛋白质上色氨酸的荧光所致,因为从酪氨酸到色氨酸非常有效的分子间能量传递。到色氨酸非常有效的分子间能量传递。 leinev报道了正常报道了正常小白鼠小白鼠血清血清uv荧光和荧光和肝癌带病小白鼠肝癌带病小白鼠uv荧光的变化,具有肿瘤的荧光的变化,具有肿瘤的小白鼠
31、的单一荧光峰向短波方向移动,且峰高小白鼠的单一荧光峰向短波方向移动,且峰高降低。降低。 在他的进一步报道中,健康和具在他的进一步报道中,健康和具有肿瘤的小白鼠的有肿瘤的小白鼠的可见荧光可见荧光地貌图被地貌图被报道,仅一个荧光峰被发现,暂时被报道,仅一个荧光峰被发现,暂时被认为是认为是nad(p)h(烟酰胺腺嘌呤二核烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸苷酸磷酸)的荧光所致,通过聚类分的荧光所致,通过聚类分析荧光参数,可使具有肿瘤的小鼠与析荧光参数,可使具有肿瘤的小鼠与正常小鼠区分开来。正常小鼠区分开来。 b. 人血清人血清 人血清的总荧光光谱也可被分为紫外人血清的总荧光光谱也可被分为紫外和可见两个区域。在紫
32、外区的单一荧光峰和可见两个区域。在紫外区的单一荧光峰是由于血清蛋白的强荧光峰所致,它的最是由于血清蛋白的强荧光峰所致,它的最大值为大值为287/337nm,它与相同实验条件下,它与相同实验条件下色氨酸的荧光峰完全一致。由于蛋白质结色氨酸的荧光峰完全一致。由于蛋白质结合的色氨酸的荧光强烈地受环境的影响,合的色氨酸的荧光强烈地受环境的影响,因此血清宽的荧光峰可能是由于各种血清因此血清宽的荧光峰可能是由于各种血清蛋白的荧光峰的加合。蛋白的荧光峰的加合。 fig.5在可见光区域观察到的荧光峰可能是由下列物质所致:在可见光区域观察到的荧光峰可能是由下列物质所致: nad(p)h (345/460nm)
33、蛋白质结合的吡哆醛磷酸盐蛋白质结合的吡哆醛磷酸盐(410/500nm) 蝶啶蝶啶(360/425nm) 蛋白质结合的胆红素蛋白质结合的胆红素(460/515nm) 黄素黄素fig.6(1)血清超滤液血清超滤液 血清超滤液的血清超滤液的uv部分显示两个荧光峰,部分显示两个荧光峰,280/302nm,286/357nm,这是自由的,这是自由的trp和和tyr所致,与全血样品相比,所致,与全血样品相比,tyr的荧光的小部的荧光的小部分被传递给分被传递给trp,因此显示出它自己的荧光峰。,因此显示出它自己的荧光峰。当当trp,tyr不被蛋白质结合时,不被蛋白质结合时,tyr和和trp相距相距较远。较远。 在在vis区域,血清超滤液的荧光因人而有区域,血清超滤液的荧光因人而有较大的差异,较大的差异, nad(p)h 和吡哆醛磷酸盐的荧和吡哆醛磷酸盐的荧光峰不可探测,这是因为在超滤中它们难以从光峰不可探测
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