食品中氯丙醇酯测定的标准操作规程修改稿

1、以下修改内容中，黄色底纹为添加部分，红色底纹加删除线为修改部分，麻烦刘老师了！十分感谢食品中氯丙醇酯测定的标准操作规程（一）、食用植物油中氯丙醇酯的测定（GCMS法）1 适用范围本标准操作规程适用于食用植物油中氯丙醇酯（简称氯丙酯）的气相色谱质谱法（GCMS）法测定。氯丙酯是脂肪酸与氯丙醇相结合的一类物质，本操作规程中仅规定了其中单氯取代氯丙醇，即3-氯-1,2-丙二醇（3-monchloropropane-1,2-diol，简称3-MCPD）及2-氯-1,3-丙二醇（2-monchloropropane-1,3-diol，简称2-MCPD）两类物质的检测方法。2 方法原理食用植物油经甲醇钠碱

2、水解作用后，发生酯交换反应，氯丙酯被水解为游离态形式的氯丙醇（3-MCPD、2-MCPD），水解液经酸中和后，经基质固相分散萃取柱（MSPD）净化，乙醚洗脱液被脱水后浓缩，并经七氟丁酰基咪唑（HFBI）衍生，衍生液用正己烷或异辛烷定容后供气相色谱质谱仪分析，采用同位素内标法定量。3 安全规则3.1 样品的提取和净化应在通风橱中进行，并配备足够的个人防护设备，防止有机溶剂对人体健康造成损害。3.2 实验过程中产生的一切有机废液均应按照相关规定进行处理。4 仪器设备与试剂4.1 仪器设备4.1.1 单四级杆气相色谱质谱联用仪（GCMS）,配DB-5MS色谱柱；4.1.2 电子天平（感量0.01mg

3、）；4.1.3 电子天平（感量0.001g）；4.1.4 涡旋混匀器；4.1.5 旋转蒸发仪或氮吹仪；4.1.6 超声清洗器；4.1.7 电热恒温鼓风干燥箱；4.1.8 马弗炉；4.1.9 气密针。4.2 试剂以下试剂未特别说明的，均指分析纯。实验用水为符合GB/T 6882规定的二级水。4.2.1 冰乙酸。4.2.2 硫酸钠。4.2.3 甲醇钠：CH3Na含量50%，液体。4.2.4 甲基叔丁醚：色谱纯。4.2.5 无水乙醚：重蒸或使用进口色谱级乙醚。4.2.6 乙酸乙酯：色谱纯。4.2.7 七氟丁酰基咪唑（HFBI）：含量不低于97.5%。4.2.8 甲醇：色谱纯。4.2.9 无水硫酸钠：

4、450烘烤2h以上后使用，也可购买商品化脱水剂。4.2.10 正己烷：色谱纯。4.2.11 0.5mol/L甲醇钠溶液：称取甲醇钠（4.2.3）2.70g，加入50mL甲醇，溶解后，用塑料瓶存放冷藏备用。4.2.12 混合液A：量取80mL甲基叔丁基醚（t-BME）和20mL乙酸乙酯充分混匀，用玻璃瓶存放冷藏备用。4.2.13 饱和硫酸钠溶液：称量硫酸钠40.8g【注：30硫酸钠的溶解度为40.8g】溶于100ml水配制成溶液，充分搅拌后得到饱和溶液。4.2.14 混合液B（中和液）：移取2.0mL冰乙酸，加入25mL饱和硫酸钠溶液混匀。4.2.15 专用硅藻土填料：3000 mg/袋（福州勤

5、鹏生物科技有限公司）。4.2.16 硅藻土基质固相分散萃取柱：2000 mg/45 mL（福州勤鹏生物科技有限公司）。4.3 标准溶液和标准物质4.3.1 棕榈酸二酯标准品（3-MCPD）：纯度98%（福州勤鹏生物科技有限公司）。4.3.2 硬脂酸二酯标准品（2-MCPD）：纯度98%（福州勤鹏生物科技有限公司）。4.3.2 氘代同位素内标：氘代棕榈酸二酯（d5-3-MCPD）、氘代硬脂酸二酯（d5-2-MCPD），50g/mL。（福州勤鹏生物科技有限公司）。4.3.3 氯丙酯及其同位素内标储备液（100g/mL）：分别准确称取适量（精确到0.01mg）3-MCPD、2-MCPD、d5-3-M

6、CPD与d5-2-MCPD标准品于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解、定容，充分混匀后得到浓度为100 g/mL的单一标准储备液（均以其游离态3-MCPD、2-MCPD、d53-MCPD、d52-MCPD计，以下同）。于20冰箱中放置保存，一般可放置6个月。氯丙酯折算为游离态氯丙醇时除以如下的换算系数。表1 氯丙酯和氯丙醇之间的换算系数氯丙酯及其同位素分子量换算系数3-MCPD（棕榈酸二酯）587.365.314D53-MCPD（氘代棕榈酸二酯）592.395.1262-MCPD（硬脂酸二酯）643.465.821D53-MCPD（氘代硬脂酸二酯）648.495.611注： 3-MCPD（2-

7、MCPD）、D53-MCPD（D52-MCPD）的分子量为110.54、115.57。？与上表不符。解释：表中分子量为酯化物分子量，注解中为未酯化的原化合物分子量，换算稀释为二者分子量比值，此数据无误。4.3.4 氯丙酯混合标准中间液（20.0g/mL）：分别准确移取氯丙酯标准储备液（4.3.3）5.00 mL于25mL容量瓶中，加入正己烷稀释，定容至25mL，充分摇匀，配制成浓度为20.0 g/mL的3-MCPD和2-MCPD混合标准中间液，封紧后于-20冰箱中保存。4.3.5 氯丙酯混合标准工作液（2.00g/mL）：分别准确移取1.00mL上述氯丙酯混合标准中间液（4.3.4）于10 m

8、L容量瓶中，加入正己烷稀释，定容至10 mL，充分摇匀配制成浓度为2.00g/mL的氯丙酯混合标准工作液，于4冰箱中放置保存，此条件下的存放期最长不超过2周。4.3.6 混合内标工作液：分别移取适量氘代氯丙酯标准液（4.3.5）于10mL容量瓶中，加入正己烷稀释定至10mL，充分摇匀配制成浓度为2.00 g/mL的氘代氯丙酯混合内标工作液，于4冰箱中放置保存，此条件下的期最长不超过2周。5 样品的处理 5.1 样品水解准确称取0.1 g样品（精确至1mg）于50mL塑料离心管中，加入0.5 mL混合液A（4.2.12），再准确加入2.0g/mL混合内标工作液（4.3.6）100 L，超声5 m

9、in，使得内标物分散于整个样品体系中。然后加入1.0 mL甲醇钠溶液，涡旋后放置，严格控制水解时间为1.0 min，结束后立即加入500 L混合液B（4.2.14），充分涡旋，以中和过量的甲醇钠碱液。取一滴用pH试纸测定，溶液应呈中性或微酸性（pH为6.07.0）。5.2 净化将随基质分散固相萃取柱配备的专用硅藻土填料（3000 mg/袋）倒入上述中和后的水解液中，拧上离心管盖子，用手轻轻振摇，使溶液分散、吸附于硅藻土中。将此混合物全部倒入硅藻土基质固相分散萃取柱（2000 mg/45 mL）中，将全部小柱按照顺序摆在固相萃取柱架上，用30 mL正己烷淋洗，控制流速低于8mL/min，弃去此淋

10、洗液。待正己烷流尽后，在每根萃取柱底部放置装有15 g脱水剂的250 mL三角瓶中，将80 mL重蒸无水乙醚分45次倒入小柱中，调节洗脱流速不超过8.0 mL/min。待洗脱结束后，反复多次【一般每小时35次】振摇三角瓶，使得脱水剂与洗脱液充分接触，最大程度脱除其中的水分。【此过程大约持续1.5 h，振摇越频繁、时间越长脱水效果越好】。然后过滤，并用250ml鸡心瓶收集乙醚洗脱液，用10ml正己烷淋洗三角瓶和滤渣，淋洗液一并收集于鸡心瓶中，待后续的浓缩。5.3 浓缩过滤后的洗脱液在35下减压旋转蒸发下浓缩至约0.5 mL，用滴管将其转入带磨口塞的5mL玻璃刻度试管中。再用大约0.8mL正己烷分

11、两次充分洗涤鸡心瓶内壁，合并洗涤液至约为1.2 mL，待衍生用。也可采用氮吹法浓缩样品。5.4 衍生提前1h取出冷冻保存的七氟丁酰基咪唑试剂，待化冻为溶液后供衍生用。于上述浓缩液中，用气密针快速加入约HFBI试剂50 L【如信噪比不够高或者担心脱水不充分时，可加入100L】，立即盖上磨口玻璃塞并充分涡旋。待加完HFBI后，再将全部试管盖紧磨口塞，逐一充分涡旋一遍，放入不锈钢（或铝质）耐热试管架中。将其放置在提前30min设置好温度为75的电热恒温箱中，放置30 min。衍生结束后，取出冷却至室温，补加正己烷或者异辛烷至体积为1.2mL；于每支试管中加入约2mL饱和硫酸钠溶液。充分涡旋，放置后上

12、层有机相应完全澄清，否则应继续涡旋。将上层有机相用无水硫酸钠脱水或者直接转入约含0.2g无水硫酸钠的进样瓶中，用手振摇23次，即可供气相色谱质谱进样分析。6 样品分析6.1 仪器参考条件6.1.1 DB-5ms毛细管色谱柱: 30 m×0.25 mm（内径）×0.25 m（膜厚）。6.1.2 进样口温度: 280。6.1.3 柱温:初温50,保持1 min,以2min升至90，再以40min升至280保持5min。6.1.4 载气: 氦气，纯度99.999，流速1 mL/min。6.1.5 进样量: 1L。6.1.6 电离方式：EI源, 70eV。6.1.7 离子源温度：2

13、30。6.1.8 进样方式：无分流进样。6.1.9 氯丙酯保留时间及监测离子见表2。表2 氯丙醇及其内标衍生物的监测离子和定量离子（m/z）待测物质保留时间（min）定量离子（m/z）定性离子（m/z）3-MCPD11.137289289，253，4532-MCPD11.307289289，253D53-MCPD11.026257257，294，278D52-MCPD11.227257257，2946.2 标准曲线的制备及样品测定于5支50mL离心管中，各称取约0.10 g饱和氯化钠溶液，分别准确加入10、50、100、200、300L混合标准工作液（4.3.5）（浓度为2.0g/mL），分别

14、相当于20、100、200、400、600ng的氯丙醇，以样品为0.1g计算，相当于氯丙酯浓度分别为0.20、1.00、2.00、4.00、6.00 mg/kg（均以氯丙醇计）。再准确加入混合内标工作液（4.3.6）（2.0g/mL）各100L，超声5 min，使得内标物分散于整个样品体系中，其余操作按照5.15.4描述的步骤进行处理。并做空白对照试验，即以0.10g饱和氯化钠溶液代替样品，仅加入混合内标工作液（4.3.6）（2.0g/mL）100 L，其他步骤同样品操作步骤。衍生后，由浓度从低到高的顺序进样，内标法定量。7 结果计算计算氯丙酯（以游离态醇3-MCPD、2-MCPD计算）与对应

15、内标物的峰面积比值，以各标准系列溶液中氯丙酯的质量（,ng）与峰面积比值（）进行一次方线性回归，由回归方程计算氯丙醇酯的质量，按下式计算试样中氯丙醇酯的含量。式中：X 试样中氯丙酯含量（均以游离态氯丙醇计），单位为mg/kg；A 由标准曲线计算试样中氯丙酯的质量，单位为ng；m 试样质量，单位为g；f 稀释倍数。计算结果保留三位有效数字。注：样品测定结果超出线性范围最高点浓度值，应将该样品稀释后，重新称样制备处理再进行测定。8 质量控制8.1 加标回收样品加标测定率应10%。样品数小于10个时，至少测1个。8.2 质控样品FAPAS参考样T2642QC，标准值范围（0.3480.811）mg/

16、kg，中位值0.579mg/kg。9 技术参数9.1 线性范围及标准曲线本方法线性范围与标准曲线如表3所示。表3 线性范围与标准曲线待测物质线性范围(ng)标准曲线方程值3-MCPD酯0600y = 0.0008534x 0.0038900.99942-MCPD酯0600y = 0.0007868x 0.0053860.99959.2质控样品测定对FAPAS质控样品T2642QC样品进行6次平行实验，计算3-MCPD酯含量，其结果见表4。表4 T2642QC质控样品测定结果（n=6）待测物质测定含量（mg/kg）测定平均值（mg/kg）RSD（%）证书含量范围（mg/kg）3-MCPD酯0.4

17、710.4826.30.3480.8110.4680.4940.4340.5090.5169.2加标回收及精密度对空白植物油样品进行三水平加标，分别进行6次平行实验，计算待测物质含量的相对标准偏差及回收率，其结果见表5。表5 氯丙醇酯样品加标回收率及精密度（n=6）待测物质添加浓度（g/kg）回收率范围（%）平均回收率（%）RSD（%）3-MCPD酯200109.8-142.2122.29.2400100.3-115.5106.34.860091.7-114.6100.78.42-MCPD酯200112.1-134.8120.56.840098.7-112.7104.64.560087.0-1

18、01.494.25.99.3方法检出限及定量限以仪器中SIM模式下，定量离子通道中性噪比（S/N）为3时设定样品溶液中各待测组分的浓度为检出限，以定量离子通道中性噪比（S/N）为10时设定样品溶液中各待测组分的浓度为定量限。本法的检出限及定量限如表6所示（以取样量0.1g计算）。表6 食用油中氯丙醇酯检出限及定量限（g/kg）待测物质检出限定量限3-MCPD酯24802-MCPD酯248010 注意事项10.1 衍生时，有时可能存在磨口处结合不够紧、出现瓶内溶剂受热快速蒸发、乃至蒸干的情况，因此建议加热15min后，应将全部试管检查一遍，如发现溶液低于0.5mL，则应补加正己烷或异辛烷至1.2

19、mL，然后再继续衍生15min，如果溶液挥发变干，则造成衍生失败。10.2 氯丙酯测定值若超过线性范围最高点时，应重新取样，以混合液A稀释后吸取0.5ml稀释液，并加入内标。不可直接稀释。10.3 本实验是将氯丙酯水解为游离氯丙醇后测定，测定结果为样品中氯丙酯及游离氯丙醇的总量。11 参考文献1 高洁,刘卿,韩枫等.固相支持液液萃取-气相色谱质谱法测定膳食样品中氯丙二醇酯J.卫生研究,2014,43(3)：449-454.2 GB/T27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测S.北京：中国标准出版社，2008.3 杨大进.2015年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册M.20154 里南.食品中脂肪酸氯丙醇酯的污染调查与暴露评估D.福建农林大学,201212 资料性附录12.1 氯丙醇及氯丙醇酯概述